ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Савченко Леонід Петрович

УДК 577.352.5

ВПЛИВ ПРОСТОРОВИХ ХАРАКТЕРИСТИК СИНАПСІВ ТА ПОСТСИНАПТИЧНИХ СТРУКТУР НА ПРОЦЕСИ ЗБУДЖЕННЯ НЕЙРОНІВ. МОДЕЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті МОН України, Національному центрі наукових досліджень (Марсель, Франція), Міжнародній школі аспірантів (Трієст, Італія), та Інституті нейрології (Лондон, Великобританія)

Науковий консультант

: доктор біологічних наук, професор

Корогод Сергій Михайлович,

Дніпропетровський національний університет,

завідувач кафедри експериментальної фізики, науковий керівник лабораторії біофізики і біоелектроніки.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук,

Федулова Світлана Анатоліївна,

Міжнародний центр молекулярної фізіології НАН України, провідний науковий співробітник.

доктор фізико-математичних наук, професор

Харкянен Валерій Миколайович,

Інститут фізики НАН України,

завідувач відділом фізики біологічних систем

доктор біологічних наук, професор

Котова Аліна Борисівна,

Міжнародний науково-навчальний центр інформаційних технологій та систем НАНУ і МОНУ,

завідувач відділу застосування математичних та технічних методів в біології та медицині.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка (кафедра біофізики), м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 20.12.2005 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 18.12. 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Марина

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми

Співвідношення між формою й функцією нервових клітин закладає основу функціонування мозку. Зміна цих співвідношень приводить до порушень, зокрема, нейродегеративних (Lund 1978). Тому вивчення структурно-функціональних зв'язків і механізмів у центральній нервовій системі є однією з вузлових проблем нейронауки (Krichmar, Nasuto et al. 2002; Taschenberger, Leao et al. 2002; Kasai, Matsuzaki et al. 2003; Lamprecht, LeDoux 2004). На базі сучасних технологій реконструкції елементів нервової клітини й методів виміру біофізичних властивостей вдалося: класифікувати основні форми клітин і синаптичних контактів (Dupoux, Mehler 2001), описати різні типи іонних каналів і рецепторів (Hille 1992), визначити залежність між формою дендритного дерева та електричним репертуаром нейрону (Vetter, Roth et al. 2001; Krichmar, Nasuto et al. 2002; Satzler, Sohl et al. 2002) і виявити, що зміна форми синапсу веде до зміни його ефективності (Geinisman 2000; Geinisman, Disterhoft et al. 2000; Geinisman, Berry et al. 2001). Однак дотепер не вдалося встановити біофізичні механізми впливу структури нейронів, іонних каналів та синапсів на генерацію та передачу збудження між нейронами. Дослідження, описані в даній роботі, мають на меті допомогти встановити, яким чином структура нервової клітини залучена до регуляції передачі й перетворення сигналів у мозку.

У першому розділі дисертації дано аналіз сучасного стану дослідження структурно-залежних механізмів збудження та синаптичної передачі. У другому розділі показано, як структурна стохастична перебудова потенціал?керованих іонних каналів і їхній просторовий розподіл на мембрані впливають на ймовірність генерації потенціалу дії (ПД), від амплітуди й кінетики якого залежить імовірність викиду нейромедіатору. Важливість цих досліджень полягає в тому, що від взаємного часового положення пресинаптичного ПД і постсинаптичного потенціалу залежить характер зміни синаптичної передачі між нейронами (Kobayashi, Poo 2004). У третьому розділі розглянуто біофізичні механізми латеральної дифузії іонних каналів на поверхні клітинної мембрани. Актуальність цих досліджень визначається тим, що щільність і просторовий розподіл іонних каналів у плазматичній мембрані клітини визначає не тільки електричний репертуар нейрона, але так само відіграє важливу роль у місцевій спеціалізації, що забезпечує точне й локалізоване керування динамікою електрохімічних процесів (Korchev, Negulyaev et al. 2000). Відхилення від характерної електричної поведінки нервової клітини є ознакою функціональних змін, які можуть бути пов'язані зі зміною щільності й розподілу каналів (Stocker 2004). Наведене в дисертації дослідження латеральної динаміки каналів і її залежність від внутрішньоклітинної концентрації кальцію дозволяє зрозуміти причини функціональних змін електричної активності нейронів і модифікації синаптичної передачі. У четвертому розділі досліджувався зв'язок між постсинаптичним струмом та синаптичною геометрією. Встановлено, що ефективність цього зв'язку в хімічних синапсах визначається розміром пресинаптичного везикулярного депо й величиною електричного поля, що виникає у синаптичній щілині. Вагомість цих досліджень пов'язана з тим, що передача сигналів від клітини до клітини через хімічні синапси є найпоширенішим засобом міжклітинної сигналізації в центральній нервовій системі. Незважаючи на те, що про існування синапсу відомо вже більше ста років (Cowan, Sudhof et al. 2001; Robinson 2001), дотепер не вивчено механізми, що визначають зв'язок між структурою синапсу і його струмом. Але ж синаптична сигналізація важлива не тільки для передачі інформації, але й для підтримки життєдіяльності нервової клітини. Більшість нейромедіаторів - це не тільки сигнальні молекули, але й речовини, залучені в процеси метаболізму нервових клітин (Lynch, Errington et al. 1990), морфогенезу (Cornell-Bell, Thomas et al. 1990; Quinlan, Halpain 1996) і навіть клітинної смерті (Attwell 2000). Тому дуже важливо знати, як розподіляється нейромедіатор після його викиду із пресинаптического бутона, і як цей розподіл залежить від щільності позаклітинного матриксу, трансмембранних транспортерів і щільності позасинаптичних рецепторів. Ці знання дозволяють поглянути на синаптичну трансмісію не тільки як на вузьку взаємодію пре- і постсинаптичної клітини, але і як на явище, що модулює діяльність мозку в цілому.

Мета роботи

Метою роботи було з'ясувати біофізичні механізми, які визначають просторово-часову варіабельність потенціалів дії та зміни постсинаптичних струмів і потенціалів у нейронах в залежності від конформаційної структури іонних каналів, їх розподілу на мембрані та від геометрії прилеглого до мембрани простору.

Завдання дослідження

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

1. На стохастичних математичних моделях неоднорідних популяцій каналів дослідити закономірності змін варіабельності просторово-часової картини потенціалів дії нейрону в залежності від просторового розподілу мембранних каналів, кінетики конформаційних змін цих каналів та геометрії прилеглого до мембрани простору.

2. На математичних моделях іонних каналів і насосів плазматичної мембрани та кальцієвих депо дослідити закономірності зміни синаптичної ефективності в залежності від розміру та ємності депо і латерального перерозподілу мобільних каналів у плазматичній мембрані нейронів.

3. На математичних моделях синаптичного контакту дослідити закономірності впливу геометрії синаптичної щілини, електродифузійних властивостей нейромедіатора та постсинаптичних рецепторів на величину постсинаптичного струму в різних типах синапсів. Оцінити залежність означених процесів від просторової організації пулу синаптичних везикул.

Наукова новизна отриманих результатів

1. Вперше показано, що стохастичні переходи між конформаційними станами потенціал-керованих каналів приводять до формування стохастичної просторово - неоднорідної електричної активності в нейроні.

2. Встановлено, що зміна пропорції натрієвих каналів на поверхні нейрональної мембрани змінює варіабельність латентності потенціалів дії, а кластеризація цих каналів веде до збільшення флуктуації просторового розподілу ПД.

3. Доведено існування клітинних механізмів, що дозволяють динамічно змінювати й підтримувати неоднорідний розподіл іонних каналів на поверхні мембрани й концентрацію кальцію в тонкому шару біля мембрани. Швидкість та тривалість просторово-неоднорідного розподілу каналів залежить від потоку кальцію з внутрішньоклітинного депо та його ємності.

4. У результаті комбінацій модельних та експериментальних методів уперше оцінено ємність кальцієвого депо в клітині нервової тканини.

5. Встановлено, що латеральна кластеризація рецептор-канальних комплексів на мембрані нейрона змінює ефективність синаптичної передачі.

6. Показано, що в синаптичній щілині під час генерації струму виникає сильне електричне поле, здатне змінювати амплітуду синаптичного струму. Напруженість цього електричного поля та його вплив на постсинаптичний струм істотно залежать від геометрії синаптичної щілини та щільності постсинаптичних рецепторів.

7. Представлено доказ того, що електричне поле всередині синаптичної щілини впливає на дифузійний перерозподіл зарядженого нейромедіатора. В залежності від заряду нейромедіатора і напрямку синаптичного струму електричне поле або притягує, або виштовхує нейромедіатор з активної синаптичної зони. В результаті зміни напрямку електричного дрейфу нейромедіатора виникає прискорення або ж уповільнення синаптичного струму.

8. Установлено, що електричне поле в синаптичній щілині впливає на перерозподіл постсинаптичних рецепторів і на ймовірність пресинаптичного вивільнення нейромедіатора і, таким чином, на ефективність синаптичної передачі.

9. Шляхом комбінації експериментальних вимірів і теоретичних розрахунків установлено кількісний зв'язок між ємністю пресинаптичного везикулярного депо й динамікою зменшення амплітуди викликаних синаптичних струмів під час низькочастотної стимуляції.

Науково-практична значимість дослідження

Ця робота спрямована на вивчення фундаментальних проблем, пов'язаних із біофізичними механізмами функціонування мозку і не переслідує практичних цілей. Проте:

1. Результати даної роботи дозволяють встановити механізми взаємодії між різними учасниками формування електричної стохастичної активності в нервових клітинах і створюють передумову для доповнення теорії електрогенезу. Відкриття біофізичних механізмів керування стохастичною генерацією ПД дозволяє по-новому сформулювати теорію кодування інформації мозком.

2. Розроблена модель стохастичної електричної активності нервової клітини полегшує рішення задач прогнозування ходу й результатів електрофізіологічних експериментів. Ця модель дозволяє зменшити час дослідження з експериментальним об'єктом і скоротити кількість тварин, необхідних для такого дослідження. Використання моделі допоможе скоротити матеріальні витрати на вивчення електричної активності в мозку.

3. Отримані кількісні співвідношення між геометрією синапсу і величиною постсинаптичного струму дозволяють провести класифікацію морфологічно різних синапсів.

4. Кількісна модель електричного поля всередині синаптичної щілини і його впливу на електродифузію нейромедіатора і рецепторів у межах синаптичної щілини дозволяє проектувати нові технології, засновані на симбіозі силікон-керамічних мікросхем із живими нейронами.

Основні положення дисертації, що виносяться на захист

1. Стохастична просторово-часова динаміка потенціалу дії, що спостерігається в експерименті, є результатом стохастичних конформаційних переходів потенціал-керованих іонних каналів.

2. Величина варіабельності латентності ПД залежить від швидкості підпорогової деполяризації мембрани, поверхневої щільності потенціал-керованих каналів і величини підпорогової флуктуації мембранного потенціалу. Зменшення щільності натрієвих каналів збільшує варіабельність латентності ПД.

3. Для генерації одного ПД відкривається частина потенціал-керованих каналів, рекрутованих із різних кластерів, розташованих на мембрані нейрону. Це явище та стохастична динаміка каналів призводять до генерації, у відповідь на один і той же стимул, різних за формою електричних просторових патернів потенціалу дії.

4. Біофізичні механізми кластеризації каналів на поверхні мембрани включають електричний дрейф каналів в електричному полі, сформованому біля мембрани за рахунок неоднорідної концентрації кальцію. Механізм формування та тривалість існування неоднорідної концентрації кальцію всередині нейрона визначаються потоком кальцію з внутрішньоклітинного депо та його ємністю.

5. Ємність внутрішньоклітинного кальцієвого депо не перевищує 104 іонів кальцію. Активація цього депо призводить до динамічного формування просторово неоднорідної концентрації Са2+ і кластеризації канал-рецепторних комплексів, що у свою чергу модифікує величину синаптичного струму.

6. Синаптичний струм здатний створити електричне поле всередині синаптичної щілини, достатнє, щоб вплинути на перерозподіл молекул нейромедіатора в залежності від їх заряду, геометрії синапсу і вектора струму.

7. Зміна ефективності синапсів зв'язана зі збільшенням числа AMPA рецепторів у активній зоні постсинаптичної мембрани. Приведено доказ того, що акумуляція AMPA рецепторів у синаптичній зоні може відбуватися внаслідок електродифузії рецепторів в електричному полі, викликаному постсинаптичним струмом.

8. Деякі форми низькочастотної синаптичної депресії супроводжуються збільшенням відношення амплітуди наступного синаптичного струму до амплітуди попереднього синаптичного струму. Показано, що таке явище відбувається в результаті спустошення пресинаптичного везикулярного депо і, таким чином, визначається його ємністю.

Особистий внесок здобувача

Автор дисертації зробив основний внесок у всі стадії роботи, включаючи постановку задач дослідження, розробку біофізичних моделей електричних і хімічних процесів у нейронах і синапсах, проведення переважної більшості обчислень, аналіз експериментальних даних і підготовку статей. Автором запропоновано й розроблено концептуальну модель електричної модуляції хімічної передачі в синапсах і запропонована експериментальна методика перевірки результатів моделі. Автор самостійно розробив математичні методи аналізу експериментальних даних оптичної реєстрації потенціалів і аналізу квантових параметрів синаптичних струмів. Автором запропонована більшість протоколів натурного експерименту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Роботу виконано в рамках наукових програм лабораторії біофізики й біоелектроніки Дніпропетровського національного університету: держбюджетна тема № 07-92-98 "Електро - геометричне сполучення у клітинах мозку з різною функціональною спеціалізацією (порівняльні модельні дослідження)" (№ держреєстрації 0199U001307), держбюджетна тема № 07-118-99 "Механізми сполучення електрогенезу й форми клітин нервової системи, що розвиваються" (№ держреєстрації 0199U001305).

Частина роботи, яка присвячена механізмам просторового перерозподілу мембранних рецепторів_каналів, була виконана в рамках науково-дослідного проекту Міжнародного центра молекулярної фізіології НАН України "Механізм формування неоднорідного розподілу мембранних макромолекул й їхня можлива роль в електро- й морфогенезі".

Стохастична динаміка електричного потенціалу нейронів вивчалася в рамках міжнародного наукового проекту "Дніпро", держбюджетна тема № M/253-2003 "Стабільність часового електричного розряду нейрона: стохастичні іонні канали та пластичність" (№ держреєстрації 0103U008885).

Апробація результатів дисертації

Матеріали дисертаційної роботи були повідомлені на семінарах науково-дослідної лабораторії біофізики і біоелектроніки Дніпропетровського національного університету, на семінарах Інституту фізіології ім. А.А.Богомольця НАН України (15 грудня 2003 та 24 грудня 2004), на семінарі лабораторії клітинної нейрокібернетики Національного центра наукових досліджень (Марсель, Франція, 1995), на семінарі лабораторії іонних каналів Північного госпіталю (Марсель, Франція, 2004); семінарах Міжнародного центра теоретичної фізики (1991; 1992, 1994, 1998), на семінарі відділу епілепсії Інституту неврології Університетського Коледжу (Лондон, Англія, 2004), на щорічних зборах біофізичного товариства США ( Новий Орлеан, 1994, Сан-Франциско, 1995), зборах федерації Європейських товариств нейронаук (1994, 2000, 2004), на семінарі FEBS (Озеро Балатон, Угорщина, 1993).

Публікації

Результати роботи відображені в 21 статтях, які опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах.

Структура та обсяг дисертації

Робота викладена на 260 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, основної частини, що містить огляд літератури, три розділи результатів та їх обговорення, і висновків. Робота ілюстрована двома таблицями та 54 рисунками. Перелік використаної літератури включає 508 найменувань.

Основний зміст роботи

Модель стохастичної просторово - часової динаміки потенціалів дії

Дослідження структурно_залежних особливостей збудження нервових клітин являє собою надзвичайно складну методологічну задачу. Однією з причин цієї складності є те, що динаміка потенціалу дії визначається стохастичними потенціал-керованими переходами іонних каналів . Ймовірність переходу залежить від мембранного потенціалу , структури каналу і температури , що створює складну нелінійну взаємодію між стохастичними властивостями потенціалу дії й просторовою щільністю каналів. Отже, очікується, що існують біофізичні механізми, які визначають зв'язок між просторовою щільністю стохастичних каналів і варіабельністю латентності, амплітуди і просторового розподілу ПД. У даній роботі ця гіпотеза стала об'єктом дослідження методами стохастичного моделювання й перевірки за допомогою електрофізіологічного експерименту.

Стохастична модель, яка була розроблена для вивчення структурних особливостей стохастичної динаміки потенціалу, базується на фундаментальних принципах стохастичної конформаційної динаміки іонних каналів. Структурна схема фрагмента мембрани стохастичного нейрона показана на рис. 1.

Рис.  - Схематичне зображення фрагмента мембрани зі стохастичними іонними каналами

А. Фрагмент мембрани в координатах x та y

Б. Збільшена в масштабі ділянка мембрани із натрієвими (великі кружки), калієвими (малі кружки) і кальцієвими (шестигранники) каналами, як у відкритому (чорні фігури), так і в закритому (білі фігури) станах.

Динаміка потенціалу кожної ділянки стохастичної мембрани визначалась іонними струмами, що течуть через стохастичні потенціал – керовані канали (рис.1Б), і розраховувалась за допомогою двомірного кабельного рівняння :

,

де dex і din – товщина позаклітинного і внутрішньоклітинного примембраних шарів; VK, VNa, VСa і VL — потенціали реверсії струмів іонів калію, натрію, кальцію і витоку, відповідно; GK, GNa, GСa і GL — питомі провідності мембрани до іонів калію, натрію, кальцію й витоку, відповідно. У режимі “просторова фіксація потенціалу” електричне рівняння моделі мало такий вигляд:

Питомі провідності визначались кількістю відповідних іонних каналів, які перебували у відкритому конформаційному стані на всій мембрані. Конфірмаційна динаміка кожного каналу моделювалась окремо за допомогою стандартних кінетичних схем , та

для калієвих каналів:

,

для натрієвих каналів:

,

та для каналів кальцію: ,

де [nl]j, [mlhk]j та [сn]j - число калієвих, натрієвих і кальцієвих каналів на j-й ділянці мембрани в стані nl, mlhk та сn, відповідно. Стани калієвого каналу n4, натрієвого каналу m3h1 і кальцієвого каналу с1 є відкритими. Потенціал - залежні кінетичні змінні ap, bp (p _m, h, с) відповідають кінетичним змінним, які використовувались для опису динаміки потенціалу в пірамідних нейронах . Усі змінні bp та p множилися на параметр , який грав роль масштабного коефіцієнта, за допомогою якого можна було міняти тривалість ПД, згідно до експериментальних даних.

У моделі перехід каналу з одного до іншого конформаційного стану відбувався стрибком, з імовірністю, яка залежала від мембранного потенціалу. Кінетика стохастичних іонних каналів представлялась як каскад конформаційних переходів без пам'яті зі швидкостями, що залежать від мембранного потенціалу і які функціонують як стохастичні автомати . Стан індивідуальних каналів відслідковувався кожні п’ять мікросекунд. Коли канал опинявся у відкритому конформаційному стані, то він пропускав струм. На підставі струмів від усіх каналів складалося рівняння просторово-часового електричного балансу і розраховувався просторово-часовий розподіл мембранного потенціалу. З урахуванням цього нового мембранного потенціалу знову перераховувались оновлені конформаційні стани за допомогою кінетичних схем -. Цей процес повторювався на протязі усього часу моделювання. Запропонований метод концептуально дуже простий і точний доти, доки генератор випадкового числа адекватний і крок моделювання є маленьким у порівнянні зі швидкістю коливань мембранного потенціалу чи стану каналу. Цей метод вимагає великої комп’ютерної пам'яті, щоб відстежити стан кожного каналу, і дозволяє моделювати дуже точні просторово-часові картини флуктуацій мембранного потенціалу уздовж нейрона з реальною геометрією.

Флуктуація латентності потенціалів дії від стимулу до стимулу

Стимуляція фрагмента модельної мембрани (рис. 1) у режимі “просторова фіксація потенціалу” пилкоподібним деполяризуючим струмом (зростання від 0 до 70 пА за 15 мс, швидкість 4.67 пА/мс) визивала генерацію ПД, форма якого була однаковою в усіх частинах мембрани. Прикладання серії з 100 таких стимулів викликало серію ПД, у яких латентність (10,580,11 мс, CV=0,010) і амплітуда (105,050,78 мВ, CV=0,007) варіювалися (рис. 2А) від стимулу до стимулу. Зменшення швидкості зростання пилкоподібного струму до 1 пА/мс призводило до збільшення варіабельності латентності (20,000,34 мс, CV=0,017) та амплітуди (100,681,43 мВ, CV=0,014) ПД (рис. 2Б).

Подальший аналіз динаміки ПД мав на меті встановити біофізичні механізми варіабельності латентності ПД, яка відіграє ключову роль у кодуванні інформації нейроном . Модельні дослідження дозволили встановити, що причиною варіабельності латентності ПД є варіабельність нахилу висхідної фази ПД у підпороговій області. Виходячи з факту, що величина нахилу висхідної фази ПД визначається динамікою натрієвих каналів , було зроблено припущення, що їх динаміка є основною причиною варіабельності латентності ПД. Для перевірки цієї гіпотези була проведена серія розрахунків мембранного потенціалу і струмів при різних швидкостях зростання пилкоподібного струму стимуляції та при різній щільності натрієвих каналів. В результаті встановлено, що стохастична динаміка натрієвих каналів у підпороговій області створює флуктуації мембранного потенціалу, дисперсія яких збільшується з деполяризацією мембрани і досягає максимуму біля порога генерації. Заміна стохастичної динаміки 8000 натрієвих каналів (4000 калієвих каналів були стохастичними в усіх випадках) на детерміністичну зменшила у два рази коефіцієнт варіації рівноважного потенціалу біля порогу ( _мВ, з CV=0,02 до 0,01) і також зменшила коефіцієнт варіації латентності ПД з 0,01 до 0,005 при повільній стимуляції та з 0,017 до 0,014 при швидкій стимуляції (рис. 2). Канали калію відігравали незначну роль у варіабельності латентності ПД, тому що заміна стохастичної кінетики калієвих каналів на детерміністичну при повільній стимуляції зменшила коефіцієнт варіації латентності ПД тільки на 7 %. Мала кількість кальцієвих каналів (100) у порівнянні із числом натрієвих каналів (8000) не відігравала суттєвої ролі у варіабельності латентності ПД .

Рис.  Варіабельність латентності ПД значною мірою визначається стохастичною кінетикою натрієвих каналів та швидкістю деполяризації.

А) Зверху. Варіабельність ПД у відповідь на однакові пилкоподібні стимули (знизу). Б) Теж саме, що і на А, але стохастичний натрієвий струм замінено на детерміністичний струм. В) і Г) Теж саме, що і на А і Б, але швидкість стимулу була меншою у три рази. Параметри моделі були: поверхня мембрани – 400 мкм2, провідність натрієвого, калієвого та кальцієвого каналів була відповідною - 30 пС, 20 пС, 10 пС. Кількість натрієвих, калієвих та кальцієвих каналів була, відповідно, 8000, 4000 та 100. Параметр дорівнював 1.

Подальші розрахунки траєкторії рівноважного потенціалу в режимі “фіксація струму” показали, що чим більший рівень деполяризації мембрани тим більша варіабельність мембранного потенціалу (рис. 3 В), але коефіцієнт варіації потенціалу біля порога не був залежним від кількості натрієвих каналів. Незважаючи на те, що варіабельність потенціалу біля порогу не залежить від числа натрієвих каналів, варіабельність латентності спайку збільшується зі зменшенням числа натрієвих каналів (рис. 3 А і Б). При зменшенні натрієвих каналів від 8000 до 4000 функція щільності ймовірності латентності ПД стала ширшою (рис. 3 Г), а дисперсія різниці латентностей сусідніх ПД збільшилась практично у два рази з 0,23 мс до 0,4 мс (рис. 3 Е). Це пов’язано з тим, що при зменшенні числа натрієвих каналів у два рази нахил висхідної фази ПД зменшився з 5,5 мВ/мс до 4,9 мВ/мс і це стало причиною збільшення варіабельності латентності ПД при сталості варіабельності мембранного потенціалу в підпороговій області (рис. 3 В).

Рис.  Вплив натрієвих каналів на варіабельність латентності ПД

А). Варіабельність латентності ПД у відповідь на один і той же прямокутний струм стимуляції (тривалість 20 мс, амплітуда 60 пА) у контрольних умовах (8 натрієвих каналів) і при зменшеній щільності натрієвих каналів (4 натрієвих каналів). Б) Варіабельність різниці сусідніх латентностей (=Li-Li+1) при тих же умовах, що і в А. В) Залежність коефіцієнта варіації CV рівноважного мембранного потенціалу від рівня деполяризації та числа натрієвих каналів. Г) Функція щільності ймовірності латентності ПД при 8000 та 4000 натрієвих каналів. Д) Приклад варіабельності п’яти ПД при різній чисельності натрієвих каналів. Е) Діаграма залежності величини від числа натрієвих каналів. Інші параметри моделі приведені в підписі на рис. 2.

Результати теоретичних досліджень перевірялись в натурному експерименті, у якому досліджували варіабельність потенціалу спокою та варіабельність латентності ПД у пірамідних нейронах п'ятого шару кори мозку, викликаних однаковим струмом стимуляції. Пірамідальні нейрони 5 шару є первинними клітинами виходу кори і містять кілька типів потенціал _ керованих каналів типу Na+, K+ і Ca2+. У моделі використовували кінетику натрієвих та калієвих каналів, що блокуються відповідно ТТХ (тетрадоксин) та 4АР (4-амінопірідін), та кінетику L  типа кальцієвих каналів, пірамідальних нейронів гіпокампа . Модель синтезували таким чином, щоб забезпечити відповідність динаміки моделі та прототипу. Наші експериментальні реєстрації ПД підтвердили те, що їх латентність варіюється від електричного стимулу до стимулу, навіть при відсутності адаптації та при блокуванні синаптичної передачі. Величина коефіцієнта варіації латентності залежить від коефіцієнта варіації мембранного потенціалу в підпороговій області та від величини нахилу висхідної фази ПД. Невелика концентрація ТТХ (20 нМ) при додаванні до зовнішньоклітинного розчину призводила до збільшення варіабельності латентності, але не призводила до збільшення варіації мембранного потенціалу в підпороговій області. Цей результат знаходиться в повній відповідності до модельних розрахунків варіабельності латентності ПД і мембранного потенціалу при зміні числа натрієвих каналів.

Варіація просторового розподілу середнього потенціалу

Якщо варіабельність ПД залежить від щільності натрієвих каналів, то можна очікувати, що їх просторовий розподіл також відіграє важливу роль у формуванні стохастичної динаміки ПД. Для перевірки цієї гіпотези була розроблена й використана модель стохастичної мембрани без просторової фіксації потенціалу. За допомогою цієї моделі розраховувалась просторово-часова динаміка мембранного потенціалу. Для дослідження просторової варіації цього потенціалу було виключено часову складову з динаміки ПД. Виключення часу з динаміки ПД і збереження його у вигляді параметра було зроблено за допомогою розрахунку середнього за часом локального потенціалу. Ця процедура дала змогу дослідити варіабельність просторового розподілу СЕРЕДНЬОГО значення ПД, де x та y – просторові Декартові координати. Найважливішим у цьому рівнянні є параметр T – час усереднення ПД. Значення Т, як у модельних, так і в експериментальних дослідженнях, дорівнювало часу генерації ПД. Щоб поставити у відповідність теоретичним розрахункам мембранного потенціалу інтенсивність флюоресценції F, яка вимірювалась за допомогою потенціал чутливих барвників, нами була запропонована така формула зв’язку:

,

де I(x,y,T) – середня відносна інтенсивність флюоресценції нейрона, F2(x,y,T) – інтенсивність флюоресценції нейрона в збудженні та F1(x,y,T) – в спокої . Параметр розраховувався за допомогою формули , V(t) – потенціал, що реєструється електродом, Vinit – потенціал спокою.

Прикладення до фрагмента модельної мембрани (рис. 1) деполяризуючого струму (100 пА, 5 мс) визивало генерацію ПД, амплітуда і форма якого були різними в усіх частинах мембрани. За час генерації ПД тільки 25 процентів натрієвих та 35 процентів калієвих каналів від усієї популяції каналів перебували у відкритому стані. Від стимулу до стимулу популяція відкритих каналів рекрутувалась з різних частин мембрани. При кластерній організації іонних каналів на поверхні мембрани (рис. 4Б), на відміну від їх однорідного розподілу, і при малій товщині позаклітинної щілини (параметр dex менший ніж 100 нм), розподіл середнього потенціалу варіювався від стимулу до стимулу (рис. 4, 1-10). Варіабельність зображень потенціалу розраховувалась в трьох контрольних точках на поверхні мембрани. Контрастність електричного патерну (Vmax-Vmin, максимальне та мінімальне значення середнього потенціалу) і його коефіцієнт варіації збільшувались при зменшенні розміру позаклітинної щілини dex або внутрішньоклітинного примембранного шару din. Установлено, що просторова варіабельність флуоресцентного зображення потенціалу (формула зв’язку ) зберігається в результаті усереднення декількох індивідуальних зображень, узятих випадково з однієї серії розрахунків або експериментів. Приклад такого усереднення теоретичних зображень показано на рис. 4 (І,К,Л,М), де кадри від 1 до 10 (рис. 4), усереднені в чотирьох різних комбінаціях, взятих випадково із цієї серії. Цей результат дозволяє стверджувати, що просторова неоднорідність флюоресценції пов’язана з розподілом мембранних каналів, а варіабельність просторового розподілу потенціалу від стимулу до стимулу пов’язана зі стохастичною роботою цих каналів. За час генерації ПД тільки незначна частина каналів відкривається і які, кожного разу для генерації одного й того ж ПД, рекрутуються з різних ділянок мембрани. Контрастність просторового зображення потенціалу збільшується при зменшенні внутрішнього або зовнішнього середовища, тому що у цьому випадку менший латеральній струм створює меншу просторову дисипацію заряду. Це створює локальне збільшення заряду на сторонах мембрани й, отже, підсилює контрастність зображення.

Експериментальні вимірювання середньої флюоресценції потенціал чутливих барвників підтвердили варіабельність просторового розподілу флюоресценції від стимулу до стимулу, а також підтвердили кластерну організацію іонних каналів на поверхні мембрани .

Рис.  Варіабельність електричного патерну модельної мембрани

На кадрах А)-Б) представлена схема розподілу іонних каналів на поверхні мембрани. Чорним кольором – розподіл натрієвих каналів, сірим кольором – розподіл калієвих каналів. На В)-Г) представлені середні провідності мембрани за час генерації ПД. На кадрах Д) та Ж) показаний розподіл середньої інтенсивності флюоресценції, розрахований за формулою , при однорідному розподілі Na+ каналів (кадр А); Е), З) - просторовий розподіл флюоресценції при неоднорідному розподілі натрієвих каналів (кадр Б). На послідовних кадрах 1-10 показано просторові розподіли середньої інтенсивності флюоресценції, розраховані за час генерації однакових ПД (угорі). І), К), Л), М) - зображення середніх потенціалів, кодованих інтенсивністю флюоресценції, приведених на 1 – 10. Зверху показано номери кадрів, які було усереднено. Сіра шкала відносної флуоресценції, І(x,y,T), представлена у відсотках. Час виміру флюоресценції T дорівнював 20 мс. Значення параметра =0.2 у цих розрахунках встановлювалось таким чином, щоб тривалість модельних та експериментальних ПД нейронів у культурі була однаковою та дорівнювала 20 мс.

Для експериментального дослідження було використано метод оптичної реєстрації флюоресценції потенціал чутливих барвників, які зв'язані з мембраною нервової клітини, з одночасним вимірюванням мембранного потенціалу в конфігурації фіксації струму в режимі “ціла клітина” . Експерименти проводили in vitro на культивованих нейронах гіпокампу та вузлового ганглію.

Висновки. Стохастична динаміка каналів і просторово-часова варіація ПД

Первинним джерелом варіабельності ПД є стохастичні переходи між конформаційними станами потенціал _ керованих каналів. Випадкові, залежні від мембранного потенціалу, переходи каналів у відкритий стан створюють флуктуації мембранної провідності й, отже, флуктуації мембранного струму.

За допомогою цієї математичної моделі й експериментальної реєстрації ПД установлено, що зміна пропорції натрієвих каналів на поверхні нейрональної мембрани змінює стохастичні просторово - часові властивості ПД. Зокрема, зміна тільки розподілу натрієвих каналів змінює просторову динаміку ПД, але не його амплітуду й латентність. Зміна загального числа натрієвих каналів у моделі та аплікація малої концентрації ТТХ в експериментах, призводить до збільшення варіації латентності ПД.

Варіабельність ПД залежить від флуктуації мембранного потенціалу в допороговій області та від швидкості його висхідної фази, яка модулюється поверхневою щільністю іонних каналів.

Просторова варіабельність усередненого потенціалу визначається просторовим розподілом потенціал-керованих каналів і діаметром клітини та шириною позаклітинної щілини.

Запропонована модель стохастичної електричної активності нервової клітини полегшує рішення задач прогнозування ходу й результатів електрофізіологічних експериментів.

Модель динаміки внутрішньоклітинної концентрації кальцію та формування кластерів каналів на поверхні плазматичної мембрани

Механізм латерального перерозподілу іонних каналів на мембрані нейронів, зокрема їх кластеризація, що можна розглядати як певну модифікацію структури нейронів, дотепер не ясний. Проте попередні результати вказують, що кластеризація, можливо, пов'язана з електродифузійним або електроосмотичним латеральним перерозподілом іонних каналів. Для перевірки цієї гіпотези нами було запропоновано механізм кластеризації іонних каналів під дією електродифузії в примембранному електричному полі . Це поле формується гетерогенними мембранними струмами, густина яких визначається неоднорідною концентрацією кальцію. Механізм формування гетерогенної концентрації кальцію не ясний, але приймаючи до уваги попередні гіпотези , що така неоднорідність, у першу чергу, пов'язана з нелінійним механізмом - кальцій залежним вивільненням кальцію з внутрішньоклітинного депо - до моделі були включені нелінійні потоки кальцію з депо. Запропонована модель здатна описувати формування просторово _ неоднорідної концентрації кальцію та кластеризацію каналів на базі таких біофізичних припущень:

1. AMPA та NMDA рецепторні канали, які можуть нести електрофоретичний заряд Ne , здатні переміщатися в площині мембрани із коефіцієнтом дифузії De .

Цей процес описано електродифузійним рівнянням щодо подовжньої щільності e(z,t) AMPA ті NMDA каналів-рецепторів:

.

Провідність каналів AMPA рецепторів визначалася сумою двох провідностей іонів натрію і калію: GAMPA=GAMPA,Na+GAMPA,K . Провідність NMDA каналів визначалася сумою трьох провідностей іонів натрію, калію і кальцію: GNMDA =NMDA,Ca + GNMDA,Na + GNMDA,K . Мембранний потенціал нормований на параметр в=RbT/F, T - температура, Rb - газова стала, F - стала Фарадея.

Натрієві та калієві потенціал-керовані канали з відповідними провідностями Gm,Na, Gm,K, та електрогенні кальцієві насоси були рівномірно розподілені та фіксовані на поверхні мембрани.

2. Електричний струм мобільних рецепторних та фіксованих потенціал _ керованих каналів і насосів змінює мембранний потенціал, динаміка якого описувалась таким рівнянням:

,

де Itot=GCa(VCa)Na(VNa)K(VK) – пасивний сумарний струм; ICapump=Fч([Ca] 2+]i)/(вtpump(V)) - струм, через електрогенні Ca-насоси; [Ca]=100 нМ – концентрація реверсії кальцієвого струму через насоси; tpump(V)=20exp(5V/7) константа часу; ч – товщина примембраного шару; Ri, Cm та d – питома провідність, питома ємність і діаметр клітини, відповідно.

Мембранні провідності по відношенню до основних іонів описувались такими формулами: GCa=q(z,t)NMDA,Ca, GNa=Gm,Na+q(z,t)(GAMPA,Na+GNMDA,Na), GK=Gm,K+q(z,t)(GAMPA,K+NMDA,K). Іонотропна активація AMPA та NMDA рецепторних каналів визначалася за допомогою параметра q(z,t)=p(z,t)e(z,t)/est, де безрозмірний параметр p(z,t) визначав інтенсивність пресинаптичної активації, а est визначав середню подовжню щільність рецепторів. Ці формули провідностей є справедливими тільки в тому випадку, коли провідності AMPA і NMDA каналів однакові. Провідність NMDA каналів по відношенню до іонів кальцію описувалась формулою GNMDA,Ca(V)=Gmax,Ca/(1+[Mg2+]exp(50 ), де концентрація магнію [Mg2+]=2 мМ.

3. Потоки кальцію через NMDA рецепторні канали, через насоси плазматичної мембрани та через насоси мембрани депо змінюють концентрацію кальцію всередині клітини в примембранному шару товщиною ч. Динаміка кальцію, викликана потоками та дифузією описувалася, таким рівнянням:

,

де JCapass=вICapass/F - пасивний потік кальцію через мобільні NMDA канали ICapass=q(z,t)GNMDA,Ca(V _Ca); JCapump=d([Ca] _ [Ca2+]i)pump(V) - активний потік кальцію через насоси; і Jd=гd[Ca2+]i(0,2 _2+]i)([Ca2+]i – 1,4) – кальцій – керований потік кальцію з внутрішньоклітинного депо через ІP3-чутливі Ca2+_ керовані канали. Параметр г визначає швидкість спустошення депо в результаті активації ІP3-чутливих Ca2+_ керованих каналів (мс_1).

Система рівнянь - описує одномірну просторово-часову динаміку щільності AMPA та NMDA каналів, мембранного потенціалу та внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Початком формування стаціонарної гетерогенної концентрації кальцію та кластеризації глутаматних рецепторів _ каналів служить спонтанне локальне підвищення концентрації кальцію, яка активує потік кальцію з депо Jd. За умови, коли Jd /[Ca2+]i>0, спонтанна неоднорідність концентрації кальцію, із часом, перетворюється з нерегулярної в просторово - періодичну й стабілізується, утворюючи області з великою та малою концентрацію кальцію. Періодична стаціонарна концентрація кальцію формує періодичний розподіл мембранного потенціалу з локальними областями гіперполяризації та деполяризації. В областях локальної деполяризації в результаті електродифузії збільшується із часом щільність глутаматних рецепторів, які утворюють кластер. У результаті в нейронах утворюється періодичний розподіл концентрації кальцію та глутаматних рецепторів. Просторовий період розподілу цих кластерів, які збільшують локальну провідність мембрани, описується формулою:

.

Ця формула отримана за допомогою лінійного біфуркаційного аналізу базової системи рівнянь -.

У формулі коефіцієнт m11 визначає швидкість зміни потенціалу зі зміною мембранного струму, а коефіцієнт m22 визначає швидкість зміни потоку кальцію при зміні концентрації кальцію. Швидкість зміни концентрації кальцію, а тому й період просторового розподілу концентрації кальцію та щільності рецепторів, залежить від розміру примембранного шару . Чим більше , тим більша відстань між кластерами. Якщо величина стане такою великою, що період між кластерами стане більшим, ніж розмір клітини, то в клітині утвориться тільки один кластер, який буде нестабільний і з часом перетвориться в однорідний розподіл рецепторів.

Кластеризація AMPA та NMDA рецепторних каналів, у свою чергу, веде до збільшення ефективності одних синапсів та зменшення ефективності інших. Зміна зовнішніх умов, які модифікують коефіцієнти m11 або m22, призводить до просторового перерозподілу кластерів рецепторів (див. формулу ) і, таким чином, змінює ефективність синапсів. Одні синапси збільшують свою ефективність, у термінах постсинаптичного струму, за рахунок збільшення щільності AMPA та NMDA каналів. Інші синапси зменшують свою ефективність у результаті латерального відтоку рецепторів з їх постсинаптичних зон.

Швидкість перерозподілу каналів і тривалість нового розподілу на поверхні мембрани залежить від двох факторів – коефіцієнта латеральної дифузії і ємності кальцієвого депо. Коефіцієнт дифузії каналів визначається в’язкістю мембрани та кінетикою зв’язування рецепторів із цитоскелетом. Ємність депо залежить від рівноважної концентрації кальцію в депо Cr і від фізичного об’єму цього депо Vd. Коефіцієнти дифузії мембранних компонент установлені для багатьох іонних каналів , а ємність депо ще не встановлена. Тому подальша мета роботи була визначити, комбінуючи експериментальні та теоретичні методи, верхню оцінку ємності депо в клітинах нервової системі в термінах максимальної кількості молекул кальцію (CrVd), яке це депо може зберігати в умовах, коли клітина находиться в спокої. Для оцінки верхньої межі кількості молекул кальцію в депо було виконано такі етапи роботи.

Рис.  Механізм Ca2+-гомеостазу в модельній гліальній клітині.

PMCA - АТФ - керований насос Ca2+ у плазматичній мембрані; SERCA – АТФ - керований насос кальцію мембрани внутрішньоклітинного депо; metRs - метаботропні рецептори плазматичної мембрани, які приймають участь в синтезі (ІP3); ІІCR - ІP3-кероване вивільнення Ca2+; CІCR - Ca2+-кероване вивільнення Ca2+, В - цитоплазматичний буфер.

По-перше, була синтезована біофізична модель динаміки кальцію в гліальній клітині на основі експериментальних результатів, отриманих на культивованих астроцитах. Ця модель, на відміну від попередньої , включала більш детальні механізми витоку кальцію з депо Jd через АТФ - керовані насоси Ca2+ (SERCA) і IP3-керовані Ca2+- чутливі Ca2+ канали (IICR). Модель також включала реакцію кальцію з буфером (Ca2+ CaB) та потік кальцію через АТФ - керовані насоси плазматичної мембрани (PMCA) (рис. 5).

По-друге, за допомогою синтезованої моделі розраховувалась динаміка концентрації кальцію в різних умовах. Параметри депо підбирались таким чином, щоб модельна динаміка кальцію відповідала тій динаміці, яка реєструвалась в експериментах з використанням барвників, що чутливі до кальцію . Модель адекватно описувала спостережувану в експерименті динаміку кальцію у відповідь на окремі й повторні метаботропні стимули. Інші параметри моделі вибиралися з тих фізіологічних значень, які відомі в інших клітинах нервової системи .

По-третє, за допомогою модельних розрахунків установлювалась емпірична залежність між ємністю кальцієвого депо й біофізичними параметрами, відомих з попередніх експериментів . Стратегія обчислення ємності