НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

СИБІРНА Наталія Олександрівна

УДК 577.15: 616.379-008.64-07:616-008.

852+616-008.851+616.115.34-07

МОЛЕКУЛЯРНІ ОСНОВИ ЗМІН СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ КЛІТИН КРОВІ ЗА УМОВ

ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ 1-го ТИПУ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий консультант – доктор біологічних наук, професор

ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович,

Київський національний медичний університет

імені О.О.Богомольця,

професор кафедри біоорганічної, біологічної та

фармацевтичної хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

КУЧЕРЕНКО Микола Євдокимович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

головний науковий співробітник кафедри біохімії;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

МИКОША Олексій Степанович,

Інститут ендокринології та обміну речовин

імені В.П. Комісаренка АМН України,

головний науковий співробітник лабораторії

гормональної регуляції обміну речовин;

доктор біологічних наук, професор

КІБІРЄВ Володимир Констянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії білка.

Провідна установа - Інститут фізіології імені О.О.Богомольця НАН України,

відділ експериментальної кардіології

Захист відбудеться „ 28 ” лютого 2005 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України ( 01601, Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В.Паллладіна НАН України ( Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий „ 27 ” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) є однією з найголовніших проблем медицини і належить до трійки захворювань, які найчастіше виявляються причиною ранньої інвалідності і летальності серед населення практично у всіх країнах світу. ЦД супроводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до формування ряду ускладнень, зокрема, інтенсифікації процесів зсідання крові при одночасному гальмуванні механізмів фібринолізу. Для мікро- та макроангіопатії, які розвиваються за умов ЦД, поряд із прискореним прогресуванням атеросклерозу характерним є порушення кровообігу та підвищення ризику тромбозу, що може бути причиною раптової смерті. Найбільш важливими функціональними змінами, що викликають ангіопатії є підвищення проникності судинної стінки, гемодинамічні розлади, зміни в’язкості крові, субактивація нейтрофільних гранулоцитів (НГ) і порушення адгезивної та агрегаційної здатності тромбоцитів, які є узалежненими від їхнього морфофункціонального стану.

Аналіз біохімічного та патофізіологічного профіля системи крові ссавців та людини при цукровому діабеті показав, що залежність проліферативної і функціональної активності її клітин від інсуліну є функцією еволюційного часу даної системи, а сам гормон володіє властивостями спільного гемопоетину. Вивчення функціонального стану системи еритрона за умов інсулінзалежного цукрового діабету є актуальним, оскільки для цієї патології харктерне посилення гіпоксії тканин пропорційно до розвитку діабетичних ускладнень.

Кров’яним пластинкам, еритроцитам та нейтрофілам належать провідні ролі у патогенезі пізніх діабетичних ускладнень. Підтвердження гіпотези про первинність порушень функціонального стану ендотеліоцитів у патогенезі ангіопатій за умов цього захворювання та включення у комплексну терапію антиагрегантів послужило поштовхом до дослідження молекулярних механізмів активації тромбоцитів та НГ, опосередкованих впливом оксиду азоту, продуктами вільнорадикального окислення і змінами в процесах сигналювання під дією індукторів агрегації. Виявлення змін у функціонуванні протеїн- та ліпідкіназ, з'ясування причин підвищеної чутливості кров'яних пластинок та НГ до агоністів дозволить вести ефективний пошук нових медичних препаратів скерованої дії для лікування діабетичних ангіопатій.

Підвищена агрегаційна здатність кров’яних пластинок при цукровому діабеті є наслідком дії ряду факторів. Сповільнення швидкості метаболізму NO, інгібування активності основних ферментів антиоксидантного захисту та пов’язана з цим інтенсифікація процесів перекисного окислення ліпідів призводять до зниження плинності плазматичної мембрани. Зростання рівня глікозилювання рецепторів на поверхні клітин крові, інтенсифікація обміну фосфоінозитидів, зміна активності NO-синтази (NOS), підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ спричиняє активацію сигнальних мереж, що забезпечують реалізацію біологічних відповідей, включаючи зміни в архітектурі цитоскелету, адгезії і метаболізмі клітин. Провідна роль у перебудові актинового цитоскелету належить сигнальним шляхам, залежним від низькомолекулярних GTP-зв’язуючих білків (G-білків). Порушення функціонування сигнальних білків є однією з основних причин, що пояснюють підвищену чутливість тромбоцитів до дії агоністів.

Тривала гіперглікемія спричиняє збудження НГ, аналогічне стану активації. Під впливом гіперглікемії відбувається лише попередня, неповна активація клітин, яка супроводжується чітко вираженим станом пониженої функціональної активності нейтрофілів у хворих на ЦД. У свою чергу перехід у збуджений стан поліморфноядерних лейкоцитів спричиняє суттєве посилення екстрацелюлярних патологічних процесів, які руйнують організм.

За умов ЦД чітко виражений зв’язок між рівнем продукування NO в організмі і проявами окислювального стресу, який характеризується різким зниженням вмісту оксиду азоту в кров’яному руслі на фоні накопичення вільних радикалів кисню і перекисів. З’ясування особливостей функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ) та NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану клітин крові дозволить розширити наші уявлення про механізми виникнення і розвитку мікро- та макроангіопатій за умов ЦД 1-го типу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету ім. Івана Франка згідно плану науково-дослідної роботи кафедри за темами: 1). “Діагностика та розробка засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держреєстрації 0193U024092); 2). „Регуляторна дія NAD та гістидинумісних дипептидів у корекції метаболічних порушень при гіпоксії різної етіології” (№ держреєстрації 0100U001443 ); 3). „Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).

Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було дослідження молекулярних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин крові ( тромбоцитів, еритроцитів, мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитів) та пошук шляхів корекції патологічних змін метаболічних процесів, які викликають виникнення і розвиток ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Дослідити активність NO-синтази в тромбоцитах, еритроцитах та лейкоцитах у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам per os її субстрату (L-Arg) та неселективних конкурентних інгібіторів L-NAME (Nщ–nitro-L-arginine methyl ester) і L-NMMA (Nщ-nitro-monomethyl-L-arginine) та селективного неконкурентного інгібітора iNOS – AG (аміногуанідину).

2. Оцінити вплив L-Arg, L-NAME та AG на стан системи антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів у кров’яних пластинках та еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального стрептозотоцинового діабету.

3. Дослідити роль внутрішньоклітинних сигнальних білків (фосфатидилінозит-3-кінази , с-Src протеїнкінази, високоафінних GTPаз Rac, Rho та Cdc42) в активації тромбоцитів при ЦД 1-го типу.

4. Вивчити вплив селективного інгібітора фосфатидилінозит-3-кінази ( РІ-3-кінази) вортманіну на активність NOS та агрегаційну здатність тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

5. Дослідити ультратонку структуру тромбоцитів після впливу L-Arg, L-NAME, AG та вортманіну in vitro та in vivo у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

6. Дослідити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

7. З метою дослідження процесів депонування NO за умов модельного ЦД 1-го типу дослідити динаміку вмісту лігандних форм Hb та процес нітрозування Hb in vitro, а також проаналізувати електронні спектри HbNO у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення селективного інгібітора iNOS – аміногуанідину.

8. Дослідити зміни структурно-функціонального стану лейкоцитів периферичної крові за умов ЦД 1-го типу, охарактеризувавши фагоцитарну активність, стан бактерицидної системи, клітинного і гуморального імунітету, вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів нейтрофільних гранулоцитів, апоптоз імунокомпетентних клітин та активність і локалізацію ключового фермента глюконеогенезу - фруктозо-1,6-дифосфатази.

Об'єкт дослiдження: тромбоцити і еритроцити контрольних щурiв та тварин із експериментальним стрептозотоциновим діабетом, а також еритроцити, лейкоцити та кров’яні пластинки здорових донорів та людей, хворих на ЦД 1-го типу, з констатованими ангiопатiями.

Предмет дослiдження: ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та індуцибельна NOS) і ферментативна система антиоксидантного захисту (супероксиддисмутаза - СОД, каталаза, глутатіонпероксидаза - ГПО, глутатіонредуктаза - ГР, рівень продукції оксиду азоту - NO2Ї та NO3Ї) і перекисного окислення ліпідів ( ПОЛ - ТБК-позитивні продукти), агрегаційна здатність тромбоцитів та нейтрофільних гранулоцитів, ультраструктура кров’яних пластинок на фоні впливу досліджуваних речовин in vitro та in vivo, РІ-3-кіназа, с-Src протеїнкіназа, високоафінні GTPази - Rac, Rho та Cdc42, лігандні форми гемоглобіну, функціональний стан лейкоцитів, фруктозо-1,6-дифосфатаза.

Методи дослiдження: біохімічні, молекулярно-біологічні, методи трансмісійної електронної мікроскопії та абсорбційної спектроскопії, цитологічні, імуноцитохімічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Застосування сучасного методу дослідження агрегації тромбоцитів за декількома параметрами дозволило встановити, що тромбоцити в периферичній крові при ЦД 1-го типу знаходяться в активованому стані та виявляють підвищену чутливість до дії агоністів агрегації – ADP та тромбіну.

Отримані результати свідчать, що еNOS не є домінуючою в регуляції агрегаційної активності тромбоцитів при діабеті. Вперше показано, що високий рівень продукції оксиду азоту в тромбоцитах за умов досліджуваної патології забезпечується активацією індуцибельної NO-синтази, значна експресія якої була продемонстрована імуноцитохімічно та за допомогою імуноблотингу з використанням моноклональних антитіл.

Вперше виявлено, що в основі активації тромбоцитів лежать зміни їхньої ультраструктурної організації та кількісний перерозподіл фракцій білків цитоскелету. Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних ефекторних білків з низькомолекулярними G–білками підродини Rho за умов ЦД 1-го типу. Встановлено підвищення рівня фосфорилювання по тирозину ряду специфічних білків тромбоцитів у хворих на ЦД 1-го типу та проаналізовано динаміку його зміни в процесі агрегації, індукованої тромбіном. Виявлені закономірності фосфорилювання білків кров’яних пластинок при даній патології свідчать про активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, які залучені у процес агрегації тромбоцитів.

Вперше продемонстровано динаміку перерозподілу внутрішньоклітинного пулу ключових сигнальних білків с-Src-кінази та РІ-3-кінази у тромбоцитах хворих на ЦД 1-го типу між цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями. Встановлено, що процес транслокації с-Src кінази у цитоскелетну фракцію тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу опосередковується SH3-доменом молекули ферменту. Посилення включення протеїнкінази с-Src у цитоскелетну фракцію у кров’яних пластинках при ЦД 1-го типу свідчить про її активацію.

Вперше показано коригуючий вплив AG - інгібітора індуцибельної ізоформи NOS та неферментативного глікозилювання - на активність ферментів антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів та кров’яних пластинок щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості у периферичній крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та при ЦД 1-го типу на фоні введення основного субстрату та інгібіторів NO-синтази. Показано, що за умов ЦД у еритроцитах значно зростає активність іNOS та інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.

Встановлено, що ЦД 1-го типу супроводжується змінами функціонального стану лейкоцитів і перерозподілом вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів НГ та зростанням активності NOS у мононуклеарних та поліморфноядерних клітинах білого ряду. За здатністю нейтрофільних гранулоцитів до лектиніндукованої агрегації показано збільшення вмісту N-ацетил-?,D-глюкозамінo- та N-ацетилнейраміновмісних і зменшення ?,D-манозо-, ?,D-глюкозо-, N-ацетил-?,D-галактозамінo- та ?,D-галактозовмісних глікокон’югатів у складі вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів цих клітин у хворих на ЦД 1-го типу.

Виявлено суттєве зростання частоти морфологічних ознак апоптозу та збільшення числа CD95-позитивних нейтрофільних гранулоцитів і CD95 -позитивних мононуклеарних клітин крові за умов ЦД 1-го типу.

Досліджено активність та внутрішньоклітинну локалізацію фруктозо-1,6-дифосфатази – ключового фермента глюконеогенезу у мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитах людей у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

Практичне значення одержаних результатів. Оскільки введення AG викликало зниження рівня глюкози, глікозильованого гемоглобіну і вмісту продуктів ПОЛ, нормалізувало активність ферментів системи антиоксидантного захисту та здійснювало коригуючий вплив на морфофункціональний стан клітин крові та депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання Hb за умов ЦД 1-го типу, доцільно на його основі вести пошук та розробку нових фармакологічних препаратів для комплексної терапії ЦД, скерованих на нормалізацію функціональної активності кров’яних пластинок та системи транспорту кисню.

Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних ефекторних білків з низькомолекулярними G–білками підродини Rho за умов ЦД 1-го типу можуть бути покладені в основу молекулярної діагностики генетичних передумов маніфестації і прогресування захворювання.

Комплексне цитохімічне вивчення функціонального стану нейтрофілів з використанням у якості індукторів агрегації лектинів є новим напрямком розробки діагностичних і прогностичних підходів у терапії даної патології. Використаний нами набір лектинів для дослідження агрегаційної здатності нейтрофілів є оптимальним з точки зору інформативності отриманих результатів для характеристики вуглеводної специфічності рецепторного апарату НГ. Така тест-система є перспективною для з’ясування патогенезу даної патології.

Співпадіння напрямленості та пропорційність змін величини апоптичних індексів за морфологічними апоптичними ознаками та за визначенням CD95-позитивних лейкоцитів, може бути основою для рекомендації щодо використання у клінічній лабораторній практиці морфологічного аналізу апоптозу як дешевшого і більш доступного, але водночас достовірного критерію.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах, які читаються на кафедрах біохімії біологічних факультетів університетів.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Дисертаційна робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1992-2004 рр. Дисертантом особисто обгрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних літератури, запропоновано гіпотетичні схеми. Основні положення і висновки обговорено та сформульовано разом із науковим консультантом - доктором біологічних наук, професором кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Київського національного медичного університету імені О.О.Богомольця Великим М.М. Робота виконана у межах держбюджетних тематик, які виконувалися на кафедрі біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка, науковим керівником однієї з яких є автор. Частина досліджень була виконана у відділі сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України у рамках договору про співпрацю між відділом і кафедрою біохімії. Електронно-мікроскопічні дослідження виконано в Міжфакультетській лабораторії електронної мікроскопії Львівського національного університету імені Івана Франка спільно із завідувачем лабораторії к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Співучасть співробітників кафедри біохімії , відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології та лабораторіі електронної мікроскопії у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені на Українських біохімічних з’їздах: VІ ( Київ, 1992), VІІ (Київ, 1997), VІІІ (Чернівці, 2002), на V Між-народній конференції „Биоантиоксидант” (Москва, 1998), на науково-практичних конференціях - Международные дни диабета „ Диабет-проблема общечеловеческая” (Дніпропетровськ 1999, 2003), на VІІІ Конгресі Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Трускавець-Львів, 2000), на VI Всеукраїнському з’їзді ендокринологів (Київ, 2001), на V Європейському конгресі з ендокринології (Турин, Італія, 2001), на ІV конференції імені Парнаса (Вроцлав, Польща, 2002), на ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), на науково-практичній конференції “Актуальні проблеми тромбозу і порушень гомеостазу в клінічній медицині” (Київ, 2003), на ІІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2004), на Установчому З’їзді Українського Товариства клітинної біології (Львів, 2004), на ІV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), на 29 конгресі Федерації Європейських біохімічних товариств - FEBS (Варшава, Польща, 2004), на Пленумі з клінічної лабораторної діагностики (Київ, 2004), на міжнародній науково-практичній конференції „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 46 робіт, з яких 26 - статті у фахових наукових журналах і збірниках, 20 - тези доповідей у матеріалах наукових з’їздів, конференцій та конгресів.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладеня на 321 сторінці друкованого тексту і складається зі вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення досліджень, висновків та списку літератури. Текст дисертації ілюстрований 48 рисунками та 30 таблицями. Перелік використаних джерел становить 452 посилання.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано сучасні дані стосовно виникнення і розвитку цукрового діабету 1-го типу. Охарактеризовано систему L- аргінін/ оксид азоту та її вплив на ферментативну антиоксидантну систему, а також на морфофункціональний стан тромбоцитів, еритрону та лейкоцитів у нормі і за умов цукрового діабету.

Матеріали і методи досліджень. У роботі були викopиcтaні моноклональні анти-р85 антитіла, люб’язно надані д-ром І. Гутом (Людвігівський інститут ракових досліджень, Лондон, Велика Британія), моноклональні анти-iNOS антитіла (“Sigma”, США), поліклональні анти-FBPase (“Sigma”, США), анти-мишачі IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Sigma”, США), анти-кролячі козячі кон’юговані з золотом антитіла ( Anti-rabbit IgG gold conjugated, Sigma, США), анти-мишачі IgG кон’юговані з золотом антитіла (Anti-mouse IgG, Sigma, США), анти с-Src поліклональні антитіла (“Santa Cruz Biotechnology” CША ), нітроцелюлозна мембрана (“Osmonics”, США), реагенти для посиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика Британія) та набори реактивів для виділення плaзмідної ДНК “NucleoSpin System” (“NT”, Велика Британія).

Бактерії E.coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene” США) вирощували в середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії штаму BL-21 з плазмідою резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі LB з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл, відповідно) на шейкері при 370С. Для трансформації E. coli штаму Bl-21 використовували відповідні pGEX-2T плазмідні вектори, люб’язно надані д-ром І. Гутом.

Забір крові проводили з пальця або вени у стерильні силіконізовані пробірки. При дослідженні фунціонального стану сегментоядерних нейтрофілів процесу згортання запобігали попередньо додавши в посуд гепарин (кінцеве розведення 1:100). Для оцінки імунного статусу використовували кров, яку отримували з вени, у якості антикоагулянта використовували 1,5% водний розчин ЕДТА (на 2 мл крові брали 0,1 мл розчину).

Експериментальний цукровий діабет у щурів викликали введенням стрептозотоцину фiрми “Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969]. В експериментi використовували тварин із рівнем глюкози 14-16 ммоль/л. Вплив L-аргініну, L-NMMA, L-NAME та AG оцінювали in vitro: при інкубації периферичної крові людей з цими речовинами та in vivo: при введенні цих речовин per os з питною водою щурам. У дослідах in vitro проби інкубувалася 10 хв при 37С з L-аргініном (“Reanal”, Угорщина) - субстратом досліджуваного фермента, а також з інгібіторами: з L-NMMA (“Beckenham”, Велика Британія), L-NAME (“Beckenham”, Велика Британія) та з аміногуанідином (“Sigma”, США). Кінцева концентрація усіх речовин, використаних для інкубації – 10 мкМ. У експериментах in vivo з моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини з питною водою : L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів; L-NMMA та L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких групах:1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + L-NMMA; 5. К + AG; 6. Діабет (Д); 7. Д + L-аргінін; 8. Д + L-NAME; 9. Д + L-NMMA; 10. Д + AG.

Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий О.І., 1998]. Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту, який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні розчинів NaNO2 та аскорбінової кислоти [Gross S.S., 1999].

Забір крові для отримання тромбоцитів людей, хворих на ЦД 1-го типу, проводили зранку (натще і до прийому інсуліну) у силіконізовані пробірки, що містили 1:10 об’єму 3,8%-ного розчину цитрату натрію у якості антикоагулянту і 1,5 од/мл апірази (“Fluka”, Швейцарія). Агрегаційну здатність кров’яних пластинок досліджували у збагаченій тромбоцитами плазмі на автоматичному аналізаторі “Биола” (Росія) згідно з [Gabbasov et al., 1989]. Збагачену тромбоцитами плазму інкубували з вортманіном (кінцева концентрація 100 нМ) протягом 30 хв.при кімнатній температурі.Тромбоцити виділяли шляхом диференційного центрифугування згідно роботи [Ferrell et al., 1989]. Лізис тромбоцитів проводили протягом 30 хв на льодяній бані холодним буфером лізису такого складу: 10 мМ трис-HCl, 150мМ NaCl, 1% тритон Х-100, 5мМ ЕДТА, 50мМ NaF, 1мМ фенілметилсульфонілфторид (“Fluka”, Швейцарія), 5мМ бензамідин (“Sigma”), 10мкг/мл апротиніну (“Sigma”), 10мкг/мл лейпептину (“Sigma”), 2мкг/мл пепстатину (“Fluka”), 0,25 мМ Na3VO4 1:10 за об'ємом. Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням при 12000 g і 40С протягом 15 хв. Дослідження активності ферментів проводили в супернатанті. Концентрацію білка вимірювали за методом [Peterson, 1977]. Супероксиддисмутазну активність (СОД, КФ 1.15.1.11) визначали методом, який ґрунтується на відновленні нітросинього тетразолію супероксидними радикалами [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6) визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (ГПО, КФ 1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] оцінювали за зменшенням вмісту NADPH [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали за методикою [Тимирбулатов и др., 1981]. Активність NO-синтази визначали як описано в роботах [Онуфриев М.В.,1995, Сумбаев, 2000] у нашій модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967]. Глікозильований гемоглобін визначали колориметричним методом [van Kampen, 1983]. Білки лізатів тромбоцитів розділяли електрофорезом в блоках градієнтного (5-18%) поліакриламідного гелю в присутності SDS [Laemmli, 1970] з наступним імуноблотингом [Towbin, 1979]. Денситометричний аналіз результатів імуноблотингу здійснювали з використанням пакету програми “Image Tool”.

Білок-білкові взаємодії вивчали in vitro з використанням кон’югованих з глутатіон-S-трансферазою (GST) рекомбінантних форм GTPаз. Очистку GST-кон’югованих білків із оброблених на ультразвуковому дезінтеграторі (УЗДН-1, Росія) бактерійних лізатів здійснювали за допомогою глутатіон-сефарози 4B (“Pharmacia Biotech”, Швеція) згідно протоколу фірми - виробника. Білки, що специфічно зв’язались із глутатіон-сефарозою, розділяли електрофорезом в блоках градієнтного (5-18%) ПААГ в присутності SDS. Для оцінки рівня неспецифічного зв’язування лізати тромбоцитів інкубували з GST-глутатіон-сефарозою. Зафарбовування електрофореграм проводили за допомогою азотнокислого срібла [Wray, 1981]. Для визначення молекулярної маси білків використовували білкові стандарти фірм “Pharmacia” та “TRIZМA”.

Дослідження ультратонкої структури тромбоцитів проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії на зрізах за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100. Виділення, відмивання та фіксацію тромбоцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою [Васильева, 1982, Slot J.W.1983,].

Цитологічні методи дослідження клітин периферичної крові та кісткового мозку виконувались згідно [Сибірна Н.О.,1997], імунологічні [Лаповець Л.Є.,2002].

Статистичну обробку даних проводили з використанням коефіцієнту t Ст’юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на морфофункціональний стан тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу. Дослідження впливу L-аргініну та інгібіторів NOS на морфофункціональний стан тромбоцитів проведено у експериментах із введенням досліджуваних речовин per os контрольним тваринам та на фоні стрептозотоцинового діабету. У таблиці 1 зведені показники агрегаційної здатності тромбоцитів та суми вмісту кінцевих продуктів метаболізму оксиду азоту: нітритів - NO2Їта нітратів - NO3Ї, у збагаченій тромбоцитами плазмі, адже саме цей показник є індексом продукції NO. У нормі введення L-аргініну викликало збільшення продукції NO, який здійснював властивий йому фізіологічний вплив: знижується агрегаційна здатність тромбоцитів і збільшується час агрегації. Підтвердженням дії конкурентних інгібіторів у контрольній групі тварин є достовірне зниження продукції оксиду азоту, що, відповідно, призводило до зростання агрегації тромбоцитів більше ніж у два рази і до скорочення часу агрегації у порівнянні до контролю. Незначне інгібування продукції NO аміногуанідином свідчить про невеликий вклад iNOS у здійснення фізіологічної регуляторної функції цією ізоформою у нормі.

При введенні L-аргініну, L-NMMA та L-NAME тваринам із експериментальним діабетом ми не спостерігали яскраво вираженого регуляторного впливу NO на агрегаційну здатність тромбоцитів. Основний і вирішальний вклад у продукцію NO за умов інсулінзалежного цукрового діабету має аміногуанідинзалежний синтез оксиду азоту, тобто синтез за участю iNOS.

Нами була досліджена ультраструктура тромбоцитів у нормі та за умов інсулінзалежного цукрового діабету. При порівнянні мікроелектронограм слід відмітити, що тромбоцити, виділені з крові хворих тварин, мають характерні ознаки активації та деградації. Процес супроводжується втратою тромбоцитами дископодібної форми, утворенням численних псевдоподій. В самих клітинах відбувається зменшення електронної густини та зниження кількості -гранул. Вони переміщаються до центру клітини та зливаються з вакуолями поверхневовакуолярної системи, де їхній вміст секретується у міжклітинний простір.

При введенні L-аргініну значно зростав рівень глюкози у крові тварин (табл.1.), тобто усугублявся їхній патологічний стан. Електронограма тромбоцитів цієї дослідної групи наглядно демонструє значні пошкодження кров’яних пластинок. Введення AG знижувало рівень глюкози в крові і вміст глікозильованого гемоглобіну за рахунок пригнічення неферментативного глікозилювання білків, що, незаперечно, має протекторний вплив на увесь організм за умов даної патології.

Отримані дані, на нашу думку, свідчать не просто про зміну рівня продукції NO у тромбоцитах, а про перерозподіл вкладу у цей синтез різних ізоформ NOS при інсулінзалежному ЦД, а також про зміну шляху його утилізації. У нормі основну роль у продукції NO відіграє еNOS. Це ендотеліальна конститутивна кальцій-кальмодулін (Са2+- СаМ)-залежна ізоформа, котрій притаманна фізіологічно-регуляторна функція, яку вона здійснює через продукцію помірних кількостей оксиду азоту (пікомолі). За умов гіперглікемії, яка супроводжує ЦД, глікозилювання СаМ є однією з причин зниження активності еNOS. Додатковим фактором зниження активності цього ферменту є розвиток гіпоксичного стану, характерного для ЦД, оскільки утворення оксиду азоту з L-аргініну за участю цієї ізоформи відбувається в присутності кисню.

Таблиця 1

Зміни досліджуваних показників in vivo при введенні L –аргініну, L-NMMA,

L-NAME та аміногуанідину щурам у нормі і при стрептозотоциновому діабеті,

( Мm, n=14) |

Показники | Групи

NO2- + NO3- мкM |

Вміст Hb A?c,

% |

Ступінь агрегації, у.од. |

Час агрегації, с | Рівень глюкози в крові, ммоль/л | К | 23,25 ± 0,45 | 4,53 ± 0,05 | 24,8 ± 0,42 | 192,5 ± 5,4 | 5,6 ± 0,5 | К + L–арг | 27,42 ±0,51* | 4,47 ± 0,11 | 21,16 ± 0,3*206,75± 9,4*5,8 ± 0,6 | К +

L-NAME | 19,65 ±0,44*4,60 ± 0,12 | 50,46 ± 0,7*51,2 ±4,3*6,9 ± 0,7*К +

L-NMМА | 14,53 ±0,62*4,39 ± 0,23 | 48,7 ± 0,23*48,5 ± 3,4*5,8 ± 0,4 | К + AG | 21,7 ± 0,51 | 4,49 ± 0,07 | 30,8 ± 1,2*120,3 ± 6,8*5,16 ± 0,9 | Д | 32,6 ± 0,61*8,81 ± 0,41*61,7 ± 1,5*62,3 ± 3,2*12,5 ± 0,5*Д + L–арг | 29,3 ± 0,42**9,92 ± 0,63**55,4 ± 1,2**89,5 ± 4,1**14,2 ± 1,1**Д +

L-NAME | 13.5 ± 0.71**8.01 ± 0.47 | 58.2 ± 0.9 | 49.8 ± 2.2**12.2 ± 0.4 | Д +

L-NMМА | 10,7 ± 0,60**7,92 ± 0,39 | 59,5 ± 1,1 | 43,1 ± 2,1**11,9 ± 0,5 | Д + AG | 24,8 ± 0,80**6,03 ± 0,28**67,6 ± 1,5**46,4± 4,2**8,6 ± 0,4**

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

** - різниця вірогідна порівняно із стрептозптоциновим діабетом, р<0.05

Натомість у тромбоцитах за умов ЦД 1-го типу відбувається значне посилення експресії іNOS, що показано нами методом імуноблот-аналізу ( рис.1.) Індуцибельній ізоформі NO-синтази властива висока продуктивність оксиду азоту (наномолі), а також О?-2. Взаємодія цих двох радикалів призводить до утворення нового, потужного оксиданта - пероксинітриту (ONOО-), і таким чином виключається сигнальна функція нестійкого оксиду азоту.

У нормі нейтралізація ONOО- відбувається завдяки зв’язуванню його з тіолвмісними сполуками, такими як глутатіон. При ЦД вміст глутатіону в тромбоцитах знижується. Оскільки пероксинітрит є високореактивною сполукою, він приймає участь у внутрішньотромбоцитарних пошкодженнях білків, плазматичних мембран, ДНК, порушуючи тим самим функцію кров’яних пластинок.

При патологічній гіпергенерації NO імовірність утворення ONOО- збільшується. У цих умовах NO з фактора регуляціі перетворюється у ланку патогенезу.

Таким чином, у наших дослідженнях показано, що інгібітори NOS не виявляють антиагрегаційного впливу на кров’яні пластинки, але мають протекторний вплив на структуру тромбоцитів за умов інсулінзалежного ЦД. Найбільш яскраво виражену протекторну дію виявляв AG. Вплив L-аргініну мав протилежну напрямленість: він характеризувався зниженням агрегаційної здатності тромбоцитів, але мав посилюючу патологію дію на структуру цих клітин за рахунок підвищення продукції NO індуцибельною ізоформою NO-синтази.

Рис. 1. Виявлення іNOS методом імуноблот-аналізу в лізатах

тромбоцитів здорових (1) та хворих на ЦД 1-го типу донорів (2).

Дослідження впливу L-аргініну, L-NAME та AG на активність NOS, рівень ПОЛ та стан системи АОЗ тромбоцитів щурів за умов експериментального діабету. NO у високих концентраціях може стати фактором, який відіграє важливу роль у перебігу патологічних станів. Характер рівноваги ПОЛ-АОС відображає рівень ендогенної інтоксикації в організмі і значною мірою узалежнений від рівня продукції NO.

У хворих на ЦД 1-го типу порушена рівновага між інтенсивністю процесів ПОЛ та можливостями антиоксидантного захисту організму, а швидкість перекисного окислення перевищує здатність АОС нівелювати вплив надлишкової кількості вільних радикалів. Підвищення рівня NO сприяє ушкоджуючій дії продуктів ПОЛ і суттєво підсилює ефект вільнорадикального окислення. Ця обставина диктує необхідність пошуку і застосування усе нових антиоксидантів у комплексній терапії ЦД. Аналіз відомих способів і засобів послаблення токсичної дії NO і корекції патологічних станів, пов’язаних з його гіперпродукцією в організмі, свідчить про те, що лише використання інгібіторів NOS вибіркової дії, які пригнічують, передусім, індуцибельну ізоформу ферменту, є перспективним для усунення значної загальнотоксичної дії продуктів метаболізму NO, властивої їм як антиметаболітам.

При зростанні концентрації NO вище наномолярного рівня оксид азоту функціонує як внутрішньоклітинна пастка для О?-2, адже це єдина молекула, яка конкурує із СОД за даний субстрат. Це може модулювати активовані АФК сигнальні шляхи або залучати альтернативні, які активуються NO. Тому стан антиоксидантної

системи за досліджуваних умов нами розглядався у ракурсі зміни активності NOS.

У таблиці 2 представлені дані активності NOS у тромбоцитах щурів у нормі та за умов ЦД, а також на фоні введення досліджуваних речовин. Характеризуючи динаміку змін цього показника у нормі, слід вказати, що введення L-Arg викликало збільшення активності NOS, а неспецифічний інгібітор - L-NAME, який є структурним аналогом L-Arg і конкурентно інгібує усі ізоформи NOS, значно знижував вихідний рівень активності фермента. AG – селективний інгібітор іNOS, мав дуже слабку дію, що свідчить про незначний вклад індуцибельної ізоформи у сумарну активність NOS у нормі.

За умов індукованого стрептозотоцином діабету ми спостерігали іншу картину. Введення L-Arg викликало зниження активності NOS. Імовірно, такий ефект можна пояснити інгібуванням активності фермента за принципом негативного зворотного зв’язку за умов значного збільшення концентрації NO. Оксид азоту має здатність зв’язуватися з гемовою групою ферменту, знижуючи тим самим його активність [Albakri Q.A.,1996].

При введенні інгібіторів за умов ЦД спостерігалося пригнічення активності NOS у тромбоцитах щурів. Цікаво відзначити, що зниження активності цього ферменту при введенні AG за умов ЦД є у три рази стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов патології.

Аналіз вмісту ТБК-позитивних продуктів та активності СОД, каталази, ГР і ГПО в тромбоцитах (табл. 2.) свідчить про порушення рівноваги між інтенсивністю процесів ПОЛ і функціонуванням системи антиоксидантного захисту за умов цукрового діабету 1-го типу.

Введення L-аргініну та інгібіторів NO-синтаз як у нормі, так і за умов ЦД мало ефект підвищення супероксиддисмутазної активності різного ступеня. Каталаза реагувала на запропоновані модельні ситуації подібним чином. Глутатіонпероксидазна активність у випадку індукованого стрептозотоцином діабету на фоні введення L-Arg не зазнавала суттєвих змін, в той час як інгібітори мали нормалізуючий вплив, тобто підвищували її активність. Введення аргініну призводило до підвищення активності ГР лише у нормі, тоді як інгібітори NO-синтаз однаковою мірою знижували цей показник тільки у випадку ЦД. Аналізуючи зміни активності ферментів системи АОЗ організму в контексті динаміки змін вмісту ТБК-позитивних продуктів на фоні введення інгібіторів NO-синтази, слід відмітити антиоксидантні властивості L-NAME та AG, введення яких супроводжувалося нормалізацією співвідношення процесів ПОЛ та інактивації АКМ.

Таблиця 2

Умови | Показники | NO-синтаза, нмоль NADPH за 1хв на 1 мг білкаСОД,

ум. од. на

1 мг білкаКаталаза, мкмоль Н2О2 за 1 хв на 1 мг білкаГПО,

нмоль GSH за 1 хв на 1 мг білкаГР,

нмоль NADPH за

1 хв на 1 мг білкаТБК – позитивні продукти, нмоль на 1 мг білкаКонтроль | 0,38±0,05 | 1,850,03 | 3,800,10 | 580,2023,50 | 105,118,56 | 3,980,25 | Діабет0,87±0,09 *1,120,09 *2,700,09 *406,1415,10 *161,736,87 *7,080,25 *

К + L-Arg |

0,56±0,05 *2,410,11 *4,030,28 | 638,2217,42 | 137,699,73 * | 4,460,39 |

Д+L-Arg

0,62±0,02**1,410,07**3,530,14** |

458,9429,71 | 153,6413,45 | 7,610,08 | К +

L-NAME

0,21±0,02 *2,220,08 *4,590,17 *661,4351,7 | 129,2810,71 | 4,450,33 | Д +

L-NAME |

0,45±0,04**1,570,09**3,460,29**491,1417,93** 108,549,81**5,090,28**

К + AG |

0,33±0,032,090,13 | 4,740,39*655,6321,81 * | 122,9711,71 | 4,180,23 |

Д + AG 0,48±0,03**1,57 0,12**3,640,29**507,6719,98** 107,118,33**5,060,44**Активність ферментів антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів у тромбоцитах щурів за досліджуваних умов, (Mm, n=8-10)

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,05;

** - різниця вірогідна порівняно із стрептозотоциновим діабетом, р<0,05.

Особливо потрібно відзначити позитивний вплив AG, що може надавати йому статус антиоксиданта.

Детекція рівня p85б ?егуляторної субодиниці PI-3-кінази в лізатах тромбоцитів. Морфофункціональний стан тромбоцитів людини в нормі тісно пов’язаний з функціонуванням як NOS, котра продукує дезагрегуючий фактор - NO, так і РІ-3-кінази, яка сприяє процесам незворотної агрегації кров’яних пластинок [Pigazzi A.,1999]. Такий різнонапрямлений вплив є цікавим у разі дослідження патології, пізні ускладнення якої до певного ступеня зумовлені зміною морфофункціонального стану тромбоцитів, тобто за умов ЦД.

З використанням методу імуноблот-аналізу нами було виявлено, що в лізатах тромбоцитів хворих на ЦД 1-го типу, вміст регуляторної субодиниці p85? РІ-3-кінази значно вищий, ніж у лізатах тромбоцитів здорових донорів (рис.2.). Це може бути однією із причин преактивації кров’яних пластинок за умов досліджуваної патології, яка виявляється у їхній підвищеній чутливості до агоністів агрегації.

Вплив селективного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну на активність NOS, агрегаційну здатність та на ультратонку структуру тромбоцитів.

Дослідження впливу селективного неконкурентного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну на продукцію NO та агрегаційну здатність тромбоцитів здорових донорів та хворих на ЦД 1-го типу представлені в таблиці 3. Отримані показники АDP-індукованої агрегації тромбоцитів здорових людей та хворих на ЦД 1-го типу після інкубації з вортманіном ілюструють ефект падіння агрегаційної здатності кров’яних пластинок у нормі, що є результатом адитивної дії підвищеного вмісту NO та інгібування РІ-3-кінази, і відсутність такого ефекту при патології. Вортманін має, незаперечно, сильно виражений вплив на стан білків цитоскелету тромбоцитів у нормі.

На електронограмах кров’яних пластинок здорових донорів після інкубації з вортманіном видно абсолютно інертні клітини. -гранули та щільні тільця рівномірно розподіляються у цитоплазмі, тромбоцити мають округлу форму, характерну для незбудженої клітини. У хворих донорів кров’яні пластинки залишаються збудженими, їхній грануломер переміщений у центр клітини, є псевдоподії.

Таблиця 3

Вміст нітритів і нітратів та агрегаційна здатність тромбоцитів після інкубації з вортманіном плазми, збагаченої тромбоцитами, здорових донорів та людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу (М±m, n=8-10)

Показники

Умови | Ступінь агрегації, ум.од. | Час агрегації, сек | NO2- + NO3-, мкМ | Контроль | 23,90±0,15 | 220 ±20 | 18,87±0,67 | Контроль+вортманін | 7,60±0,44* | 50±4* | 21,61±0,45* | Діабет | 53,80±2,50* | 54±5* | 24,37±0,50* | Діабет+вортманін | 48,10±2,10 | 41±6** | 23,87±0,87 |

* - p<0,05 щодо здорових донорів;

**- p<0,05 щодо хворих на ЦД 1-го типу.

Вивчення динаміки транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної p85 субодиниці РІ-3-кінази за умов індукції агрегації кров’яних пластинок різними концентраціями ADP. Нами було проаналізовано вплив in vitro різних концентрацій індуктора агрегації ADP (0,5 мкМ; 1 мкМ; 5 мкМ) на рівень р85 тромбоцитів здорових людей та хворих на ЦД 1-го типу.Отримані результати дозволяють прослідкувати, як змінювався вміст р85 у цитозольній фракції тромбоцитів за досліджуваних умов, а також динаміку транслокації регуляторної субодиниці РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію, покажчик якої розраховувався нами як відсоток від вихідного рівня.

У здорових донорів вміст р85 у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів спадає по мірі підвищення концентрації