`yІнститут рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН

Сергієнко Ольга Федорівна

УДК 635.132 : 631.527 : 631.47 : 631.53.02

Створення чоловічостерильних компонентів

для гібридів F1 моркви на основі сучасних

методів біотехнології

06.01.05 – селекція рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Харків 2005

Дисертацією

є рукопис

Робота виконана

в Інституті овочівництва і баштанництва Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: |

доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

ЛЄДОВСЬКИЙ Станіслав Якович, Інститут овочівництва і баштанництва УААН, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології

Офіційні опоненти: | доктор сільськогосподарських наук, професор, член-кор. УААН КРАВЧЕНКО Владислав Андрійович, директор Науково-дослідного і навчального Центру закритого ґрунту АК “Пуща Водиця

кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник КОЛІСНИК Ірина Віталіївна, Полтавська державна сільськогосподарська дослідна станція ім. М.І. Вавілова, завідувач науково-технічним відділом селекції, первинного та елітного насінництва

Провідна установа: | Інститут картоплярства УААН

Захист відбудеться 20.12.2005 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.366.01 в Інституті рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН за адресою: 61060, м. Харків, проспект Московський, 142, тел.: (057) 392-23-78.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН, м. Харків, проспект Московський, 142.

Автореферат розісланий 14.11.2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради В.П. Петренкова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед світових комерційних форм моркви переважають гібриди F1 на чоловічостерильній основі, які мають високі врожайність та товарність і захищені від їх несанкціонованого репродукування.

У нашій країні теж розгорнуто програму гетерозисної селекції моркви на основі чоловічої стерильності. Створено перші вітчизняні гібриди F1: Ранок, Довіра, Дарунок, Статус (Терновий Ю.В., 1997; Кривець Д.О., 1998). Однак, материнськими компонентами їх були російські стерильні лінії, розмноження яких в Україні не проводиться. Отже, актуальним завданням стало створення вітчизняних чоловічостерильних ліній, адаптованих до місцевих умов.

Слід зазначити, що цей процес є складним і за традиційною схемою триває 10-12 років (Тімін Н.І., 1986).

Необхідність швидкого створення нових вітчизняних чоловічостерильних ліній вимагає застосування сучасних методів біотехнології, які дозволяють прискорити селекційний процес і підвищити його ефективність (Уралець Л.І., 1997).

Прикладом цього може служити російська селекція моркви, де розроблено і застосовуються методи експериментальної гаплоїдії та генетичної трансформації моркви (Тюкавин Г.Б., Шмикова Н.А., 2000; Поляков А.В., 2004; Крутенко Д.В. та ін. 2000).

В Україні до наших досліджень біотехнологічні методи на моркві не розвивались і в селекції моркви не застосовувались.

Використання методу мікроклонування у гетерозисній селекції моркви може забезпечити швидке і гарантоване розмноження у лабораторних умовах вихідних селекційних форм з корисними властивостями, а метод експериментальної гаплоїдії дозволяє значно прискорити створення гомозиготних ліній.

Розробка практичної системи регенерації рослин моркви in vitro необхідна також, як основа для створення більш складних вітчизняних біотехнологічних методик, таких як клітинна селекція, нестатева трансформація геному та генетичні банки в культурі in vitro.

Необхідність вирішення цих питань і визначило актуальність наших досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконували згідно з державними науковими програмами та планами науково-дослідних робіт Інституту овочівництва і баштанництва УААН:

“Розробити на основі біотехнологічних методів способи одержання вихідних форм для прискореного створення нового покоління високопродуктивних сортів та гібридів овочевих культур” (№ держ. реєстрації UA01001695P, 1991 1995 рр.);

“Встановити селекційно-генетичну детермінацію ознак коренеплідних культур, на основі якої провести ідентифікацію вихідних ліній для створення гетерозисних гібридів F1. Відпрацювати насінницькі прийоми, що гарантують високу якість відтворення батьківських ознак” (№ держ. реєстрації 0196U 017172, 1996 2000 рр.);

“Розробити на основі регуляторів росту нового покоління ефективні і малозатратні біотехнологічні методики для прискореної сортової та гетерозисної селекції овочевих культур” (№ держ. реєстрації 0101U001168, 2001 2005 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета досліджень полягала в створенні вітчизняних чоловічостерильних ліній типу петалоїд за допомогою біотехнологічних методів.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

- створити вітчизняну методику мікророзмноження селекційних зразків моркаи шляхом вдосконалення існуючої методики соматичного ембріогенезу і пристосування її до розмноження рослин у фазі цвітіння, коли можна визначити наявність чоловічої стерильності;

- виявити біолого-генетичні фактори, що впливають на мікророзмножених рослин;

- визначити кореляційні зв’язки морфогенних особливостей тканин моркви в культурі in vitro та кількісних ознак селекційних зразків in vivo;

- створити чоловічостерильні лінії моркви з застосуванням мікророзмноження та експериментальної гаплоїдії.

Об’єкт дослідження – гетерозисна селекція моркви на основі чоловічої стерильності.

Предмет дослідження – створення гомозиготних чоловічостерильних ліній моркви на основі біотехнологічних методів, створення методики мікроклонування селекційних зразків моркви.

Методи дослідження – а) біотехнологічні – для швидкого розмноження вихідних джерел цінних властивостей та отримання дигаплоїдних рослин моркви; б) селекційно-генетичні для створення гомозиготних ліній на базі одержаних in vitro рослин; в) польові – для оцінки створених селекційних форм; г) математико-статистичні – для аналізу достовірності одержаних результатів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. В Україні дослідження по застосуванню біотехнологічних методів у селекції моркви виконані вперше.

Вперше в Україні створено методику мікророзмноження селекційних зразків моркви шляхом вдосконалення способу одержання соматичних ембріоїдів у калюсній культурі на всіх етапах, а саме: дезинфекція рослинного матеріалу, індукція калюсу, проліферація калюсу, індукція соматичного ембріогенезу, одержання рослин першого і другого років життя.

Випробувано способи ранньої яровизації мікроклонованих рослин моркви.

Досліджено морфологічні та кількісні ознаки розмножених в культурі in vitro рослин моркви.

Проведено дослідження впливу різних донорських органів суцвіття (бутонів та листків) та фаз розвитку донорських рослин моркви на морфогенні властивості їх тканин in vitro.

Виявлено кореляційні зв’язки між біометричними параметрами селекційних зразків in vivo та морфогенними властивостями їх тканин in vitro.

Вперше в Україні створено лінії моркви з чоловічою стерильністю за двома прискореними селекційними схемами, що включають такі біотехнологічні методи, як мікророзмноження та експериментальна гаплоїдія.

Практичне значення одержаних результатів. Створено вдосконалену методику мікроклонування селекційних зразків моркви, яка може бути також використана для розмноження та підтримання інбредних ліній моркви.

Подано патентну заявку на живильне середовище для одержання соматичних ембріоїдів у культурі рослинних тканин in vitro.

Шляхом вдосконаленої технології мікроклонування в ІОБ УААН розмножено 14 цінних селекційних зразків моркви і передано селекціонерам для подальшої роботи.

З використанням мікроклонування та експериментальної гаплоїдії створено 13 ліній моркви з чоловічою стерильністю.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертації О.Ф.Сергієнко самостійно провела дослідження по темі, зробила теоретичні узагальнення та практичні висновки.

Дисертантом самостійно розроблено схеми дослідів на основі аналітичного огляду літератури та запропоновано нові, ефективні методичні підходи. Особистий внесок у наукові праці, опубліковані у співавторстві, становить 70 % - 90 % і полягає у виконанні експериментальних досліджень, отриманні селекційних форм, аналізі та узагальненні результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були викладені на науковій конференції “Проблеми і перспективи селекції і насінництва овочевих і баштанних культур”, Борова, 1994 р.; Міжнародному симпозіумі “Біотехнологія рослин та генна інженерія”, Київ, 1994 р.; науковій конференції, присвяченій 50-річчю ІОБ УААН, Харків, 1997 р.; науково-теоретичній конференції “Селекция и семеноводство овощных и бахчевых культур”, Москва, 1998 р.; ЙЙ міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях”, Одеса, 1998 р.; ЙЙ uміжнародному симпозіумі з біотехнології рослин, Київ, 1998 р.; Міжнародному симпозіумі з селекції та насінництва овочевих культур, Москва, 1999 р.; УІІІ Міжнародному симпозиумі “Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье”, Алушта 1999 р; Міжнародній науковій конференції “Оптимізація селекційного процесу на основі генетичних методів”, Харків, 1999 р.; Всеукраїнській конференції молодих вчених “Агроекологія як основа стабільності сільського господарства, Харків, 2000 р.; IV міжнародній конференції “Геном рослин”, Одеса, 2003 р.

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 2 методиках, 5 статтях у наукових тематичних збірниках, 3 статтях у наукових журналах, 1 патентній заявці, 11 тезах наукових конференцій, в яких достатньо повно викладено основні положення дисертації.

Структура і обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладено на 148 сторінках машинописного тексту. Робота містить з вступ, шість розділів, висновки, практичні рекомендації, список використаних джерел, включає 28 таблиць, 18 рисунків та 11 додатків. Список використаної літератури налічує 151 джерело, у тому числі 88 іноземних.

ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Представлено аналіз публікацій, що стосуються використання біотехнологічних методів у селекції овочевих рослин і зокрема моркви. Наведено світові теоретичні та технологічні здобутки у мікророзмноженні моркви, проаналізовано їх ефективність та перспективи використання у вітчизняній селекції. Обґрунтовується вибір мети і завдань досліджень.

Методика і умови досліджень. Дослідження проведено в Інституті овочівництва і баштанництва УААН протягом 1993-2004 років.

Вихідним матеріалом служили сорти і гібриди моркви селекції інституту та колекційні зразки. Використані рослини були вирощені у селекційних розсадниках у незахищеному та захищеному ґрунті.

Дослідження рослинних об’єктів у культурі in vitro проводили за загальноприйнятими методиками (Бутенко Р.Г., 1964; Калінін Ф.Л., Сарнацька В.В., 1980)

Базовою методикою досліджень з мікророзмноження моркви служила процедура одержання соматичних ембріоїдів у калюсній культурі (Кайт Л., 1987, Тиссера Б., 1989).

Для введення в культуру in vitro використовували наступні органи рослин моркви: нерозкриті бутони, листки обгорток зонтиків, молоді листки рослин першого року життя, коренеплоди, насіння.

Добір оптимальних субстратів та умов мікроклонування проводили протягом 1993 – 1997 рр. по наступних етапах:

- дезинфекція рослинного матеріалу;

- утворення та проліферація калюсу in vitro;

- утворення соматичних ембріоїдів in vitro;

- утворення рослин з соматичних ембріоїдів in vitro;

- одержання коренеплодів-регенерантів та насінників-регенерантів.

З метою визначення оптимального донорського органу для мікроклонування рослин моркви другого року життя проводили порівняння коефіцієнтів розмноження при використанні таких донорських органів суцвіття, як бутони і листки обгорток зонтиків з рослин сорту Нантська харківська та лінії 1238.

Визначення впливу фази онтогенезу донорської рослини на морфогенний потенціал її тканин проводили протягом 1997 – 1999 рр. Варіанти досліду представлені трьома фазами онтогенезу рослин: 1) – проросток, 2) – коренеплід, що вегетує, 3) – цвітіння.

В кожному варіанті використано по 10 селекційних зразків моркви, серед яких – сорти, лінії та гібриди F1. В культурі in vitro оцінювали такі морфогенні властивості рослинних тканин, як утворення калюсів, проліферативна активність та енбріоіндуктивна активність.

З метою прогнозування здатності до мікророзмноження різних зразків моркви проведено визначення кореляції між кількісними параметрами селекційних форм in vivo та морфогенними властивостями їх тканин in vitro протягом 1998 – 1999 років. В дослідженнях використано 10 зразків моркви, що належали різним сортотипам. Донорами тканин служили молоді рослини, що мали 2 справжні листки. В культурі in vitro визначали такі властивості рослинних тканин, як утворення калюсів, проліферативна активність та енбріоіндуктивна активність. В умовах in vivo зразки оцінювали за 18 кількісними параметрами згідно (Горова Т.К., 1996).

Проводили кореляційний аналіз зв’язків кожного показника, одержаного in vitro, з кожним показником, одержаним in vivo.

З метою прискореного створення чоловічостерильних ліній моркви для гетерозисної селекції застосовували включення в базову методику створення чоловічостерильних (А) та фертильних (В) аналогів моркви (Тімін Н.І., 1986) мікророзмноження індивідуально дібраних рослин та експериментальної гаплоїдії.

Дібрані рослини характеризувались цінними господарськими якостями, мали оптимальну архітектоніка насінника, чоловічу стерильність типу петалоїд або ж закріплення чоловічої стерильності, підвищений вміст в-каротину.

Математичний аналіз одержаних результатів проводили за загальноприйнятими методиками (Лакін Г.Ф. 1990, Доспєхов Б.А., 1985).

Удосконалення методики мікроклонування селекційних зразків моркви. З метою створення надійної і ефективної методики мікророзмноження селекційних зразків моркви було здійснено удосконалення відомого способу розмноження моркви в культурі in vitro шляхом соматичного ембріогенезу.

В результаті досліджень випробувано вітчизняний комерційний препарат “Білизна” в якості дезинфікуючої речовини для позбавлення від інфекцій рослинного матеріалу перед введенням в культуру in vitro. Встановлено оптимальні режими дезинфекції цим препаратом листків, суцвіть та насіння моркви.

На етапі утворення калюсу in vitro встановлено, що cеред відомих базових живильних середовищ кращими для цього процесу є середовища МS (Murashige T., Skoog F., 1962) та В5 (Gamborg O.L. at al., 1968). Найвищу частоту утворення калюсу (60,6 %) забезпечувало застосування регуляторів росту 2,4-Д (дихлорфеноксиоцтова кислота) і кінетину (6-фурфуриламінопурин) по 1,0 мг/л кожного (табл. 1). Генотипи моркви мали різну здатність до утворення калюсу, що відобразилось в коливанні середньої частоти калюсоутворення від 0 % до 43,6 %.

В результаті добору оптимального базового середовища для проліферації калюсів моркви виявлено, що найбільшого об’єму досягали калюси на середовищах В5S (Schдfer F. та ін., 1998) та В5, а середовища МS та МSМ (Masuda, 1981) не сприяли інтенсивному росту калюсів. Здатність калюсів до проліферації була генотипово обумовлена.

Результати досліджень з добору оптимального базового середовища для утворення соматичних ембріоїдів з калюсів моркви свідчать про істотність впливу живильного середовища, генотипу та їх взаємодії на вихід ембріоїдів з калюсів. Мінімальною дією на утворення ембріоїдів відзначався фактор генотипу (h2 = 6,6 %) середньою – фактор середовища (h2 = 12,1 %), а їх взаємодія мала максимальний вплив (h2 = 24,2 %).

Таблиця 1

Вплив вмісту регуляторів росту у живильному середовищі MS та генотипу експлантів на утворення калюсу з листків суцвіть моркви у 1994 - 1995 рр

Регулятори росту у варіантах досліду

(фактор А) | Концентрація в живильному середовищі, мг/л | Частота утворення калюсу, %

по генотипах (фактор В): | середнє по фактору А

12 | 13 | 14 | 15 | 16

2,4-Д /контроль/ | 1,0 | 16,7 | 44,4 | 18,2 | 0 | 0 | 15,9

2,4-Д | 2,0 | 16,7 | 37,5 | 0 | 0 | 0 | 10,8

2,4-Д,

Кінетин | 0,2

0,2 | 50,0 | 75,0 | 70,0 | 0 | 58,3 | 50,7

2,4-Д,

Кінетин | 1,0

1,0 | 82,4 | 75,0 | 83,3 | 0 | 62,5 | 60,6

Кінетин | 2,0 | 28,6 | 26,7 | 90,0 | 0 | 6,7 | 30,4

Кінетин | 4,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8,3 | 1,7

Середнє по фактору В | 32,4 | 43,1 | 43,6 | 0 | 22,6

НІР0,05 для порівняння середніх по фактору А = 11,21

НІР0,05 для порівняння середніх по фактору В = 10,23

Створено високоефективне середовище МSC для індукції соматичного ембріогенезу моркви шляхом модифікації середовища МS. Вихід ембріоїдів з калюсів на цьому середовищі в середньому у 2,2 рази перевищував результат, досягнутий на контрольному середовищі МS (табл. 2). На цю розробку до Держпатенту України подано патентну заявку № 20040706346.

Таблиця 2

Вплив CaCl2 на соматичний ембріогенез з калюсу моркви у 1996 – 1997 рр

Основне живильне середовище (фактор А) | Вміст CaCl2, мг/л | Вихід ембріоїдів, шт./калюс

по генотипах (фактор В): | Середнє по фактору А | 9 | 17 | 25

MS (контроль) | 333,0 | 16,78 | 15,25 | 13,20 | 15,08

MS | 565,0 | 67,00 | 28,22 | 3,00 | 32,74

MSM | 333,0 | 12,00 | 9,40 | 0,18 | 7,19

MSM | 565,0 | 13,80 | 11,50 | 0,098 | 8,46

Середнє по фактору В | 27,39 | 16,09 | 4,12

НІР0,05 по фактору А = 3,92

НІР0,05 по фактору В = 2,89 |

Оцінено потенціал ембріоіндукції дев’ятнадцяти цінних селекційних генотипів моркви, серед яких виділено 7 генотипів`з високою здатністю до соматичного ембріогенезу. Вони можуть бути використані для створення комерційних форм моркви з високим коефіцієнтом мікророзмноження.

Для регенерації рослин моркви з соматичних ембріоїдів оптимальним визначено рідке живильне середовище Ѕ В5 з вмістом хлориду кальцію 170,0 мг/л, на якому частка нормальних рослин досягала 60,6 ± 6,5 %.

Оптимальним субстратом для вирощування горщикової розсади регенерантів моркви рекомендовано суміш чорноземного ґрунту та піску у відношенні 2 : 1, на якому частка приживлення мікроклонованих рослин становила 75,4 ± 5,2 %.

Виявлено, що найвище приживлення горщикової розсади регенерантів моркви у захищеному ґрунті забезпечувало її висаджування у квітні, травні та вересні (95,8 – 97,4 % приживлення).

Випробувано два способи ранньої яровизації мікроклонованих рослин моркви. Яровизація регенерантів у пробірках протягом 30 днів при +4оС викликала утворення 31,6 ± 10,7 % генеративних пагонів, а горщикової розсади регенерантів протягом 5 місяців при +10 – 14оС сприяла утворенню 47,8 ± 7,4 % генеративних пагонів.

Встановлено, що коренеплоди-регенеранти аналогічно звичайним коренеплодам краще приживлюються в незахищеному ґрунті (78,9 ± 9,4 %), ніж в захищеному (52,5 ± 6,5 %).

Біолого-генетичні фактори мікророзмноження рослин моркви. Встановлено, що у мікроклонованих рослин першого року життя істотно зросла порівняно зі звичайними рослинами мінливість таких ознак, як довжина, діаметр і маса коренеплоду, що пояснюється травмуванням кореневої системи під час пересаджувань регенерантів з пробірок у горщечки, а з останніх ---------у грунт. У рослин другого року життя коефіцієнти варіації основних кількісних ознак були на рівні звичайних насінників.

Умови теплиці сприяли збільшенню діаметра центрального зонтика насінників-регенерантів порівняно з незахищеним ґрунтом.

У мікроклонованих рослин моркви першого року життя морфологічних відхилень листків не виявлено, а у рослин другого року життя відмічено 3,7 ± 1,7 % внутрішньоклонових морфологічних змін. Вони мали як спадковий, так і не спадковий характер.

Морфогенні властивості культивованих in vitro тканин моркви залежали від фази розвитку рослини-донора. Високу здатність до утворення калюсу мали тканини з проростків та технічно зрілих рослин, які в середньому у 3 рази перевищували тканини з рослин у фазі цвітіння за цим показником. Ембріогенний потенціал тканин з проростків в середньому був у 2 рази вищим, ніж у тканин з технічно зрілих рослин і у 4 рази вищим, ніж у тканин, які походили з рослин у фазі цвітіння (табл. 3).

Мінливості калюсогенної та ембріогенної активностей ізольованих тканин моркви були найнижчими у проростків і підвищувались на пізніших етапах онтогенезу рослин-донорів. Мінливість проліферативної активності ізольованих тканин знаходилась на порівняно низькому рівні і не залежала від фази розвитку рослин-донорів.

На морфогенні властивості тканин in vitro істотно впливав також вид донорського органу. Так, калюси, одержані з бутонів, мали у середньому у 2,6 рази вищу здатність до проліферації, ніж калюси з листків обгорток зонтиків.

Таблиця 3

Вплив фази розвитку рослини-донора на морфогенні властивості тканин моркви, культивованих in vitro, у 1998 1999 роках (середні по 10 зразках)

Фаза розвитку донорської рослини | Об’єм первинного калюсу, мм3 | Об’єм вторинного калюсу, мм3 | Вихід ембріоїдів, шт./калюс

1. Проросток | 169,011,9 | 532,023,6 | 4,40,4

2. Коренеплід, що вегетує | 160,016,8 | 486,544,0 | 2,00,5

3. Цвітіння | 48,512,3 | 869,658,1 | 1,00,2

НІР0,05 між варіантами: | 1 – 2 | 35,5 | 82,7 | 0,8*

1 – 3 | 35,7* | 106,6* | 1,5*

2 - 3 | 42,1* | 163,2* | 0,6*

Примітка: * - різниця між двома варіантами істотна при Р = 0,05.

Насіннєві рослини, що походили з бутонів, утворили на 44,4 % більше зонтиків першого порядку, ніж рослини, що походили з листків (табл. 4). Це дає підстави рекомендувати бутони, як джерела тканин при мікророзмноженні рослин моркви, що знаходяться у фазі цвітіння.

Таблиця 4

Вплив донорських органів суцвіття моркви на біометричні показники насінників-регенерантів клону 41 у 1997 р.

Донорсь-кий орган | Кількість гілок І порядку, шт. | Висота централь-ного зонтика, см | Діаметр централь-ного зонтика, см | Тривалість періоду від посадки до початку цвітіння, діб | Тривалість періоду від посадки до початку достигання насіння, діб

Листки | 5,4 ± 0,2 | 52,4 ± 3,9 | 7,9 ± 0,5 | 56,0 ± 0,3 | 113,2 ± 2,1

Бутони | 7,8 ± 0,9 | 57,5 ± 6,9 | 8,8 ± 0,9 | 56,3 ± 1,6 | 108,8 ± 3,9

НІР0,05 | 2,03* | 17,44 | 2,27 | 3,50 | 9,74

Примітка. * - Різниця істотна при Р=0,05.

Зв’язок ознак селекційних зразків моркви in vivo з характеристиками їх тканин in vitro. Для визначення таких кореляцій у культурі in vitro проведено оцінку тканин моркви 28 селекційних зразків за наступними морфогенними властивостями: утворення калюсу, проліферація калюсу, утворення соматичних ембріоїдів. У польових умовах досліджено біометричні та господарські властивості цих зразків. Встановлено, що найбільш інформативними показниками in vitro були об’єм вторинного калюсу та вихід ембріоїдів з 1 калюсу (табл. 5).

Здатність тканин до проліферації (об’єм вторинного калюсу) тісно корелювала з кількістю листків у розетці (r = -0,73) та шириною черешка листка (r = -0,89), посередньо з довжиною коренеплоду (r = -0,53), діаметром головки коренеплоду (r = -0,56) та з висотою розетки (r = 0,47).

Таблиця 5

Коефіцієнти кореляцій між кількісними параметрами селекційних зразків in vivo та морфогенними властивостями їх тканин in vitro у 1998 р.

Параметри зразків моркви

in vivo | Параметри тканин моркви in vitro

Об’єм первинного калюсу | Об’єм вторинного калюсу | Кількість ембріоїдів на 1 калюс

Висота розетки | 0,30 | 0,47 | 0,15

Діаметр розетки | -0,49 | -0,11 | -0,38 | `

Довжина листової пластини | 0,15 | -0,21 | -0,31

Ширина листової пластини | 0,24 | -0,27 | -0,07

Кількість листків у розетці | 0,07 | -0,73* | -0,50

Кількість сегментів листка | -0,23 | 0,43 | 0,44

Довжина черешка листка | 0,31 | 0,36 | 0,42

Ширина черешка листка | -0,22 | -0,89* | -0,73*

Довжина коренеплоду | 0,02 | -0,53 | -0,03

Діаметр коренеплоду | 0,03 | -0,45 | -0,17

Діаметр головки коренеплоду | 0,07 | -0,56 | -0,57

Врожайність | 0,28 | 0,33 | 0,58

Маса коренеплоду | 0,09 | -0,39 | -0,07

Період від посіву до утворення коренеплодів | 0,14 | -0,27 | 0,08

Примітка. * - Коефіцієнт кореляції істотний при Р=0,05.

Вихід ембріоїдів з одного калюсу, який відображає здатність тканин до соматичного ембріогенезу, тісно корелював з шириною черешка листка (r = -0,73), посередньо з кількістю листків у розетці (r = -0,50), діаметром головки коренеплоду (r = -0,57) та урожайністю (r = 0,58).

За результатами цих досліджень рекомендується для мікророзмноження використовувати переважно ті селекційні зразки, які мають до 12 листків у розетці і діаметр черешка до 1,5 см, так як вони матимуть високий коефіцієнт розмноження in vitro.

Для восьми пар тісно та посередньо сполучених ознак in vitro та in vivo побудовано графіки лінійних регресій, які дозволяють в культурі in vitro прогнозувати такі важливі якості майбутніх рослин-регенерантів, як довжина коренеплоду, діаметр головки коренеплоду та врожайність (рис.1) і проводити відповідний добір.

Селекція чоловічостерильних ліній моркви з використанням біотехнологічних методів. З початку 90-х років минулого століття в Україні розгорнуто програму створення гетерозисних гібридів моркви F1 на основі чоловічої стерильності (ЧС). Одним з напрямків селекційної роботи з морквою в Інституті овочівництва і баштанництва УААН є створення чоловічостерильних ліній типу петалоїд на основі вітчизняних сортів Нантська харківська, Оленка та Шантене сквирська, що мають високі господарські та біохімічні якості.

Традиційна схема селекції чс-ліній триває 10 12 років (Тімін Н.І., 1986). Для прискорення цього процесу нами розроблено дві селекційні схеми з залученням методів культури ізольованих тканин.

Перша з розроблених схем включає вдосконалений нами спосіб мікророзмноження рослин чоловічостерильного та фертильного аналогів і розрахована на 7 років (рис.2). Мікроклонування значно підвищило ефективність методики, тому що дозволило гарантовано розмножити цінні рослини, тоді як без мікророзмноження дібрані генотипи могли бути втраченими внаслідок ураження хворобами та рекомбінації при статевому розмноженні. Наявність кількох ідентичних рослин дало можливість значно збільшити кількість схрещувань чоловічостерильних форм з метою створення гетерозисних гібридів F1 та збільшити вихід насіння з кожної комбінації схрещувань, адже при примусовому запиленні однієї рослини моркви вихід насіння часто недостатній для подальшої роботи, а іноді й зовсім відсутній.

Роки | Лінія А – ЧС-аналог | Лінія В – фертильний аналог | 1й | Мікроклонування чс-рослин, дібраних серед гібридів чс-форм з перспективним сортом | Мікроклонування фертильних рослин, дібраних з перспективного сорту

2й – 3й | Міжклонові запилення і одержання покоління F1(А х В) | Внутрішньоклонове запилення фертильних аналогів, одержання R1(I1) і добір типових коренеплодів

4й – 5й | Оцінка прояву ЧС, одержання покоління ВС1 (А х В) і добір типових коренеплодів | Одержання покоління R2(I2) і добір типових коренеплодів

6й – 7й | Одержання покоління ВС2

(А х В) і його конкурсна оцінка | Одержання покоління R3(I3) і добір типових коренеплодів

Рис. 2. Схема створення чоловічостерильних ліній моркви з застосуванням мікророзмноження in vitro.

Друга схема заснована на одержанні дигаплоїдних рослин способом гіногенезу in vitro (рис.3). Вона розрахована на 5 років. Прискорення відбувається за рахунок створення дигаплоїдних (гомозиготних) рослин за методикою Тюкавіна Г.Б. та Шмикової Н.А. (1997), одержання їх насіння всього за 3 роки, що традиційно досягається кількома поколіннями інбридингу.

Роки | Лінія А ЧС-аналог | Лінія В – фертильний аналог

1й | Індивідуальний добір ЧС-насінників серед гібридів перспективного сорту з ЧС- формами і одержання з них дигаплоїдних рослин in vitro | Індивідуальний добір фертильних насінників перспективного сорту і одержання з них дигаплоїдних рослин in vitro

2й – 3й | Міжклонові запилення дигаплоїдних клонів і одержання покоління F1(А х В) | Внутрішньоклонові запилення дигаплоїдних клонів і одержання покоління R1(I1), добір типових коренеплодів

4й – 5й | Оцінка на збереження ЧС, одержання покоління ВС1(А х В) і його конкурсна оцінка | Одержання R2(I2) і добір типових коренеплодів

Рис. 3. Схема створення ЧС-ліній моркви на основі гіногенних дигаплоїдних рослин.

Згідно цих схем одержано 137 насіннєвих рослин, що належать 14 цінним соматичним клонам та 5 рослин, що належать двом дигаплоїдним клонам моркви. На їх основі створено 13 ліній сортотипів нантська, валерія і геранда з чоловічою стерильністю типу петалоїд на рівні 90 100 %.

Проведено конкурсне випробування 8 чс-ліній і за його результатами лінії Мона ВС2 і Райдуга ВС1 визнані кращими і включені в схеми гібридизації. З їх участю одержано гібриди F1 сортотипу нантська, які успішно проходять випробування. Загалом у селекційній роботі Інституту овочівництва і баштанництва УААН у 2004 році знаходилось 38 чоловічостерильних та фертильних зразків моркви, створених з використанням біотехноголічних методів.

ВИСНОВКИ

В дисертації на основі 11-річних досліджень за 1993-2004 рр. наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягає у застосуванні мікророзмноження та експериментальної гаплоїдії в селекції чоловічостерильних ліній моркви шляхом вдосконалення методики розмноження моркви в культурі in vitro з метою її пристосування до мікроклонування селекційних зразків моркви та підвищення загальної ефективності у вітчизняних умовах, а також шляхом виявлення в культурі in vitro морфогенних властивостей рослинних тканин на різних фазах розвитку рослин та виявлення кореляцій між господарськими рослин in vivo та морфогенними властивостями їх тканин in vitro, а також у розробці та застосуванні прискорених схем створення ЧС-ліній моркви, завдяки чому розроблено вітчизняну методику мікророзмноження селекційних зразків моркви та виявлено біолого-генетичні аспекти розмноження in vitro, за допомогою цієї методики та експериментальної гаплоїдії створено ЧС лінії моркви, що має важливе значення в галузі гетерозисної селекції.

На основі одержаних експериментальних даних можна сформулювати наступні основні висновки:

1.Виявлено, що оптимальним режимом поверхневої дезинфекції суцвіть моркви є занурення спочатку у 70 % етанол на 1 хв., а потім у 25 - 33 % розчин “Білизни” на 20 хв. з подальшим п’ятикратним промиванням стерильною водою. Для насіння найефективнішою є обробка спочатку 70 % етанолом протягом 1 хв., а потім - 50 % розчином “Білизни” протягом 40 хв.

2. Встановлено, що для утворення калюсу з суцвіть моркви оптимальними є живильні середовища MS та В5, доповнені регуляторами росту 2,4-Д і кінетином по 1,0 мг/л кожного.

3. Запропоновано модифіковане за допомогою збільшення вмісту CaCl2 до 565 мг/л середовище MS (MSC), яке є оптимальним для утворення соматичних ембріоїдів моркви in vitro.

4. Оцінено ембріогенний потенціал дев’ятнадцяти цінних для селекції генотипів моркви, серед яких виділено 7 генотипів з високою здатністю до утворення соматичних ембріоїдів в культурі in vitro, а саме: F1 (416 ms х Нантська харківська) б. к. 13; F1 (508 ms х Нантська харківська) б. к. 14; F1 (505 ms х Нантська харківська) б. к. 21; Нантська харківська б. к. 28, 37, 38; 1238 ms б. к. 41. Їх потомство може служити для створення селекційних форм з високим коефіцієнтом мікророзмноження.

5. Запропоновано модификацію середовища 1/2 В5 (за допомогою підвищення вмісту хлориду кальцію до 170,0 мг/л) для регенерації рослин з соматичних ембріоїдів.

6. Розроблено два способи ранньої яровизації мікроклонованих регенерантів моркви:

а) витримування рослин-регенерантів з двома справжніми листками у пробірках при температурі 4оС без освітлення протягом 30 діб;

б) культивування горщикової розсади регенерантів при температурі 10-14оС і природньому освітленні протягом 5 місяців.

7. Запропоновано субстрат для одержання горщикової розсади рослин-регенерантів моркви, що складається з чорнозему та піску у співвідношенні 2:1.

8. Встановлено, що кращим періодом для висаджування горщикової розсади регенерантів моркви у теплиці є квітень травень, коли частка рослин, що прижилися, становила 95—97%. Приживлення регенерантів-насінників істотно вище у відкритому ґрунті, ніж у теплиці.

9. Вперше встановлено, що коефіцієнти варіації основних кількісних ознак насінників-регенерантів не перевищували аналогічних показників звичайних насінників.

10. Не виявлено внутрішньоклонових морфологічних відхилень у мікроклонованих рослин 1-го року життя. Серед насінників-регенерантів відмічено 3,7 ± 1,7 % внутрішньоклонових морфологічних відхилень. Вони мали як модифікаційний, так і спадковий характер.

11. Чоловіча стерильність типу петалоїд зберігалась у мікроклонованих рослин на рівні 94 – 100 %.

12. Вперше встановлено, що морфогенні властивості культивованих in vitro ізольованих тканин моркви залежали від фази розвитку рослини-донора. Високу здатність до утворення калюсу мали тканини з проростків і вегетуючих коренеплодів, вона у 3 рази перевищувала аналогічний показник у тканин з рослин у фазі цвітіння. Ембріогенний потенціал тканин з проростків у 2 рази вищий, ніж у тканин з вегетуючих коренеплодів і в 4 рази вищий, ніж у тканин з рослин, що квітнуть.

13. Вперше виявлено, що донорський орган істотно впливав на морфогененні властивості ізольованих тканин. Калюси, одержані з бутонів, мали у 2,6 рази вищу здатність до проліферації, ніж калюси з листків. Насіннєві рослини, одержані з бутонів, утворюють на 44,4 % більше зонтиків першого порядку, ніж рослини з листків. Отже, можна рекомендувати використовувати бутони як джерела тканин при мікроклонуванні насіннєвих рослин моркви.

14. Вперше встановлено, що об’єм вторинного калюсу in vitro мав тісний корелятивний зв’язок з кількістю листків у розетці (r = -0,73) та шириною черешка листка селекційних зразків (r = -0,89), посередній – з довжиною коренеплоду (r = -0,53) та діаметром головки коренеплоду (r = -0,56).

15. Вихід ембріоїдів з одного калюсу тісно корелював з шириною черешка листа (r = -0,73) і посередньо корелював з кількістю листків у розетці (r = -0,50), діаметром головки коренеплоду (r = -0,57) та урожайністю селекційних зразків (r = 0,58).

16. Для прогнозування кількісних властивостей мікроклонованих селекційних доборів за властивостями ізольованих тканин, з яких вони походять встановлено лінійні залежності кількості листків у розетці, ширини черешка, діаметра коренеплоду, довжини коренеплоду та урожайності від об’єму вторинного калюсу та здатності до соматичного ембріогенезу in vitro.

17. Шляхом мікроклонування in vitro розмножено і передано селекціонерам інституту 14 цінних селекційних зразків моркви. Розроблено селекційні схеми створення чоловічостерильних ліній моркви з застосуванням мікророзмноження та експериментальної гаплоїдії in vitro, які дозволяють у 1,5 - 2 рази прискорити селекційний процес. За цими схемами створено 13 ЧС-ліній моркви, з яких лінії Мона б. к. 165 і Райдуга б. к. 193 є перспективними материнськими компонентами для гібридної селекції.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для мікроклонування рекомендуємо використовувати зразки моркви, які мають невелику кількість листків у розетці (до 12 шт.) і неширокий черешок листка (до 1,5 см), так як вони матимуть високий коефіцієнт розмноження in vitrо.

2. При мікророзмноженні рослин моркви першого року життя перед одержанням соматичних ембріоїдів слід проводити 1 2 пасажі калюсів. При використанні донорських рослин у фазі цвітіння кількість пасажів має бути збільшена до 3 4.

3. При мікророзмноженні рослин моркви, що знаходяться у фазі цвітіння як донорський орган слід використовувати бутони, так як вони мають високу калюсогенну активність, а одержані з них рослини – високу кількість продуктивних зонтиків.

4. Листки, суцвіття та коренеплоди моркви перед їх введенням у культуру in vitro слід дезинфікувати шляхом занурення спочатку у 70 % етанол на 1 хв., а потім у 25 - 33 % розчин “Білизни” на 20 хв. з подальшим п’ятикратним промиванням стерильною водою. Насіння обробляти спочатку 70 % етанолом протягом 1 хв., а потім - 50 % розчином “Білизни” протягом 40 хв.

5. Оптимальним живильним середовищем для індукції первинного калюсу моркви in vitro є прописи МS та В5 доповнені 3 % сахарози, 7 г агару, 1 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л кінетину.

Для субкультивування калюсів моркви застосовувати середовища В5S та В5, які містять регулятори росту 2,4-Д та кінетин по 0,2 мг/л кожного.

6. Для одержання соматичних ембріоїдів калюси моркви культивувати спочатку на середовищі MS з 0,2 мг/л 2,4-Д і 0,2 мг/л кінетину протягом одного пасажу, а потім – на середовищі MS з підвищеним вмістом хлориду кальцію 565 мг/л без гормонів (МSC).

7. Оптимальним для регенерації рослин з соматичних ембріоїдів in vitro є середовище Ѕ В5 з вмістом хлориду кальцію 170,0 мг/л.

8. Для вирощування горщикової розсади з мікророзмножених рослин моркви як субстрат слід використовувати суміш чорноземного ґрунту і піску в пропорції 2 : 1.

9. Для ранньої яровизації мікророзмножених рослин рекомендовано наступні два способи:

а) витримування рослин-регенерантів з двома справжніми листками у пробірках при температурі 4оС без освітлення протягом 30 діб;

б) культивування горщикової розсади регенерантів при температурі 10-14оС і природньому освітленні протягом 5 місяців.

10. Висаджувати горщикову розсаду мікророзмножених рослин моркви у захищений грунт у другій половині квітня, першій половині травня та першій половині серпня.

11. Одержання насіннєвих рослин з коренеплодів-регенерантів доцільно проводити у незахищеному ґрунті.

12. Для створення селекційних ліній та гібридів F1 моркви з високим потенціалом мікророзмноження використовувати генотипи, що мають високу здатність до соматичного ембріогенезу: F1 (416 ms х Нантська харківська) б. к. 13; F1 (508 ms х Нантська харківська) б. к. 14; F1 (505 ms х Нантська харківська) б. к. 21; Нантська харківська б. к. 28, 37, 38; лінія 1238 ms б. к. 41.

13. Для прогнозування кількості листків у розетці, ширини черешка, діаметра коренеплоду, довжини коренеплоду та урожайності мікроклонованих селекційних зразків слід використовувати об’єм вторинного калюсу та здатність його до соматичного ембріогенезу in vitro.

14. Для створення чоловічостерильних ліній моркви рекомендується використовувати розроблені селекційні схеми, які включать мікророзмноження та експериментальну гаплоїдію.

Ці практичні рекомендації викладено автором у двох методиках [9, 149].

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Сергієнко О.Ф., Баштан В.Б., Горова Т.К. Методика мікроклонування селекційних зразків моркви. Мерефа: ІОБ УААН, 2004. – 12 с (80 % авторства, особисто досліджено і узагальнено результати).

2. Методика досліджень в культурі ізольованих тканин овочевих рослин / Мірошніченко В.П., Сергієнко О.Ф., Івченко Т.В., Гончарова С.А., Кондратенко С.І., Баштан Н.О. Мерефа: ІОБ УААН, 2004. – 25 с (20 % авторства, особисто досліджено і узагальнено результати).

3. Сергієнко О.Ф. Соматичний ембріогенез у калусній культурі моркви // Овочівництво і баштанництво. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Харків. – 1999. – Вип. 43. С. 53-59.

4. Сергиенко О.Ф. Оптимизация методики микроклонирования моркви // Физиология и биохимия культурных растений. – Киев. – 2000. – Т.32, № 3. – С. 232 235.

5. Сергієнко О.Ф. Мікроклонування селекційних зразків моркви, особливості розвитку рослин-регенерантів in situ // Вісник аграрної науки. – К.: УААН. – 2002. - № 11. – С. 41-43.

6. Сергієнко О.Ф. Вплив фази розвитку рослин моркви на морфогенетичні властивості їх тканин in vitro // Овочівництво і баштанництво. Міжвід. тематичн. наук. зб. – Харків: ІОБ УААН. – 2002. – Вип. 47. – С. 51-54.

7. Сергиенко О.Ф., Горовая Т.К. Корреляционные связи между свойствами растений in vivo и характеристиками их тканей in vitro у моркови столовой // Овочівництво і баштанництво. Міжвід. тематичн. наук.