НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

ШЕПЕЛЕНКО Вадим Миколайович

УДК 577.115+665.322

МІНОРНІ КОМПОНЕНТИ ТА ЖИРНОКИСЛОТНИЙ СКЛАД ПОВЕРХНЕВИХ ЛІПІДІВ ДЕЯКИХ ВИДІВ РОСЛИН

03.00.04 - Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті

Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

ШТЕМЕНКО Наталя Іванівна,

завідувач кафедри біофізики та біохімії

Дніпропетровського національного університету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

СТАРОДУБ Микола Федорович,

головний науковий співробітник

відділу біохімії біосенсорних та регуляторних систем

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник ОКАНЕНКО Олександр Аркадійович,

старший науковий співробітник

лабораторії фізіологічних основ продуктивності рослин кафедри фізіології та біохімії рослин

Київського національного університету

ім. Тараса Шевченка.

Провідна установа - Чернівецький національний університет

ім. Ю. Федьковича МОН, кафедра біохімії.

Захист відбудеться “7” червня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “6” травня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Поверхневі ліпіди (ПЛ) – гетерогенна суміш естерів (восків), алканів, спиртів, оксосполук, жирних кислот та мінорних компонентів, що розташовані на поверхні листя рослин та мають загальну властивість – гідрофобність – завдяки значній величині (С12-С36) вуглеводневого радикалу [Bianchi, 1984, 1989, 1995; Prasad 1990; Post-Beitenmiller, 1996; Kunst, 2003; Reynhardt, 1991, 1994; Barthlott, 1998].

У роботах співробітників кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету [Штеменко, 1997, 1998, 1999, 2000, 2003; Берзеніна, 1997, 2000] проведено детальний огляд свідчень про ПЛ листя рослин, розроблено методичні підходи до вивчення ПЛ, з’ясовано особливості формування ПЛ рослин у процесі онтогенезу. Однак у переважній кількості вищезгаданих робіт не використовувався такий новітній метод досліджень як хромато-мас-спектрометрія. Саме цей метод спроможній визначити структуру біомолекул, що знаходяться в невеликій кількості (мінорні компоненти) навіть у складній суміші. Також практично не застосовувався метод компонент-специфічного ізотопного аналізу ПЛ, який дає можливість вивчати особливості ферментативних реакцій, що є чутливими не тільки до конфігурації молекул, а й до розміру (складу) ядра елемента. Останнім часом доведено, що ПЛ не є інертним нерухомим шаром, якому притаманна тільки бар’єрна або захисна (від ультрафіолетового випромінювання) функції. Показано, що в умовах пристосування до факторів зовнішнього середовища відбуваються певні перебудови ПЛ, які мають за основу біосинтез нових компонентів та зміну гідрофобності шару [Bianchi, 1995; Jetter, 2001]. У цьому аспекті хвойні (Coniferae) є одними з найважливіших об’єктів, оскільки ці види характеризуються широким ареалом розповсюдження, високою стійкістю та використовуються людиною у фіторемедіаційних заходах. Деякі водні рослини є теж цікавим об’єктом досліджень, оскільки склад ПЛ їх практично не вивчався взагалі і вони застосовуються для очистки води [Stottmeister, 2003].

Отже, застосування сучасних методів дослідження для визначення структури компонентів ПЛ рослин та їх змін під впливом факторів зовнішнього середовища є актуальним напрямком досліджень, оскільки вносить суттєвий внесок у розуміння взаємозв’язку структура біомолекул – функція, що є однією з центральних проблем сучасної біохімії.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення складу жирних кислот, мінорних компонентів та проведення компонент-специфічного ізотопного аналізу ПЛ деяких видів хвойних та водних рослин.

Для досягнення мети були поставлені задачі :

· Провести хромато-мас-спектрометричний аналіз сумарної фракції жирних кислот хвойних та водних рослин.

· Визначити зміни молекулярно-динамічних характеристик та складу ПЛ хвойних рослин в умовах адаптації до шкідливих факторів середовища.

· Визначити величину дискримінації важкого ізотопу 13С у компонентах ПЛ хвойних та водних рослин.

· На основі отриманих даних розглянути можливі шляхи біосинтезу окремих компонентів.

Об’єкт досліджень. Особливості жирнокислотного складу та мінорних компонентів поверхневих ліпідів хвойних та водних рослин.

Предмет досліджень. Компоненти поверхневих ліпідів хвойних та водних рослин.

Методи досліджень. У роботі використані методи екстракції поверхневих ліпідів, методи хромато-мас-спектрометрії, компонент-специфічного ізотопного аналізу, диференційного температурного аналізу, інфрачервоної спектроскопії, статистичного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано наявність у фракції жирних кислот поверхневих ліпідів розгалужених (ізо - та антеізо пента - та гептадеканові кислоти), аліциклічних (дициклопропанова кислота), та дикарбонових (дикарбоксинонаноат, дикарбокситридеканоат, 12-метил-тетрадеканоат) кислоти. Серед мінорних компонентів поверхневих ліпідів рослин знайдено терпеноїди класів абієтану та пімарану, фенольні кислоти, функція яких вірогідно полягає у підтриманні впорядкованості структури поверхневих ліпідів та підвищенні температури фазових переходів “кристалічна-аморфна” фази. Показано значну дискримінацію стабільного важкого ізотопу 13С у вищих жирних кислотах та вуглеводнях поверхневих ліпідів рослин, яка найбільш суттєва для довголанцюгових компонентів. Вперше показано значну ненасиченість поверхневих ліпідів водних рослин, яка обумовлена наявністю пальмітоолеїнової, олеїнової та лінолевої кислот. Вперше виявлено, що в умовах пристосування до факторів зовнішнього середовища відбувається перебудова шару поверхневих ліпідів за участю мінорних компонентів та незвичайних жирних кислот, що підкреслює важливість їх функцій у формуванні поверхневого шару з певними молекулярно-динамічними характеристиками. На основі отриманих даних обговорені нові аспекти біосинтезу окремих компонентів поверхневих ліпідів рослин.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень дозволяють більш глибоко проаналізувати причинно-наслідкові зв’язки між складом та хімічною будовою поверхневих ліпідів рослин різного віку і формуванням гідрофобного біохімічного бар’єру, здатного захистити фотосинтетичний апарат від зовнішніх впливів. Зроблені спостереження і висновки значно розширюють уявлення про механізми функціонування різноманітних біосинтетичних процесів в епідермальних тканинах рослин.

Зв’язок роботи з науковими темами. Робота виконувалась в рамках бюджетних тем лабораторії НДІ біології і кафедри біофізики та біохімії ДНУ “Розробка біотехнології отримання речовин із рослинної сировини для практичного використання” (0196U00259), “Дослідження процесів формування ліпідного і білкового комплексів рослин” (0199U00129), які входять в координаційний план № 15 Міністерства освіти і науки. Частина роботи виконувалась згідно гранту Німецької служби академічних обмінів (DААD) № А/03/12911.

Особистий внесок здобувача. Розробка програми й основної гіпотези наукової проблеми виконана разом з науковим керівником – доктором біологічних наук, професором Н.І. Штеменко. Представлена дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених та узагальнених протягом 2001-2004 рр. Автором дисертаційної роботи особисто були проводені експериментальні дослідження, здійснені підбір та обробка літературних даних, статистична обробка результатів. Друковані праці підготовлені за особистою участю здобувача.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи, були представлені на міжнародних конференціях: Sixth International Symposium & Exhibition of Environmental Contamination in Central & Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States 1-4 September 2003, Prague, Czech Republic; 1st European Symposium on Plant Lipids: From Fundamental Biology to Industrial and Field Applications, Aachen, 10-13 September; V Регіональній конференції молодих учених з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2002); ІІ Всеукраїнській конференції молодих вчених з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2004).

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (1 розділ, 7 підрозділів), експериментальної частини (3 розділи, 16 підрозділів), висновків, списку використаних джерел який налічує (157 найменувань). Робота виконана на 133 сторінках і включає 40 рисунків, 22 таблиці.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт, з яких 3 статті, надруковані в спеціалізованих фахових виданнях та за кордоном.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури розглянуті відомі на сьогодні дані про склад жирних кислот та мінорних компонентів поверхневих ліпідів рослин. Розглянуто основні шляхи біосинтезу окремих компонентів поверхневих ліпідів.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалами досліджень були окремі дерева таких видів: Picea abies L. Karst, Picea pungens Engelm, Pinus pallasiana D.Don, Pinus sylvestris, які росли на території Ботанічного саду Дніпропетровського національного університету (контрольна група) та на ділянці з інтенсивним автотранспортним рухом міста Дніпропетровськ (досліджувана група), де спостерігалося часткове пошкодження крони. Відбір проводився на стадії активної вегетації. Вивчалося листя різного віку (першого, другого та третього років), яке було зібране із середнього ярусу південно-східної сторони крони. Також для досліджень були взяті водні рослини Juncus effusus L. та Typha latifolia L., які вирощувались як гідропонічні культури на середовищі: 50 % розчин Хогланда на водопровідній воді у фітолабораторії Цетру вивчення навколишнього середовища (Лейпциг, Німеччина) за Stottmeister [2003]. Експерименти проводились в 3 - 4 біологічних повторностях.

Екстракцію поверхневих ліпідів проводили за схемою Гусакової [1986].

ДТА зразків проводили на дериватографі системи Паулік-Паулік-Ердей марки Q-1500 D (MOM) в динамічному режимі в умовах звичайного теплообміну в інтервалі температур 10-500 0С зі швидкістю нагрівання 10 0С / хв, еталон - Al2O3. при масі зразків 0,1 г і реєстрації кривих диференційного температурного аналізу з максимальною чутливістю.

Аналіз інфрачервоних спектрів поглинання ПЛ проводився на спектрометрі Speсord UR-20 у вигляді суспензії речовини у вазеліновому маслі на оптичному склі з броміду калію.

Гідроліз сумарних ПЛ, реекстракція та отримання двох ліпідних фракцій - неомилюючих речовин та жирних кислот проводили за Кейтсом [1975].

Отримання метилових естерів жирних кислот, дитерпенових кислот та фенольних кислот проводили за Сriestie [1998].

Попередньо метильовані компоненти ПЛ розподіляли методом колоночної хроматографії на силікагелі G 60 [Otto, 2003] з такими розчинниками: гексан– отримували фракцію вуглеводнів; дихлорметан– відкидали; етилацетат– отримували фракцію вільних жирних кислот, фенольних кислот, терпеноїдів у вигляді метилових естерів.

Газову хроматографію жирних кислот проводили за Richnow [2003] на хроматографі НР 6890. Розподіл жирних кислот проводили у вигляді метилових естерів. Газова хроматографія проводилась безперервним способом з терміном очистки 0,16 хв. Ін’єкція проводилась при температурі 180 ?. Проба вносилась в кількості 4 мl.

Газову хроматографію вуглеводнів проводили на тому ж хроматографі й при тих самих умовах розподілення, що для полярних компонентів, але з іншим температурним режимом.

Процес та ідентифікація компонентів при газовій хроматографії здійснювався за допомогою мас-спектрометричної приставки НР 5973 (Hewlett Packard, USA) та програми Enhansed Chem. Stations G 1701 AA Var 03.00.

Визначення співвідношення стабільних ізотопів Карбону в компонентах ПЛ проводили за Schleffus [2003] на хроматографі GC-С-irmMS-gas chromatography / combustion / isotope-ratio-monitoring mass spectrometry – газова хроматографія з наступними розкладанням та мас – спектрометричним визначенням співвідношення ізотопів. (FINNIGAN MAT–252, Bremen, Germany). Співвідношення ізотопів Карбону у індивідуальних компонентах розраховували шляхом порівняння із стандартними СО2 з певним вмістом ізотопів 12С, 13С та 14С з відповідними масами 44, 45 і 46 та наступним визначенням величини іонного потоку.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розробка сучасних методичних підходів до вивчення біохімічних особливостей поверхневих ліпідів рослин. У цьому розділі автором обговорюється застосування методів хроматографічного розподілення і аналізу мінорних компонентів та жирних кислот ПЛ , а також застосування таких методів хромато-мас-спектрометрія, компонент-специфічний ізотопний аналіз, ДТА, ІЧ-спектроскопія для вирішення поставлених задач.

Жирні кислоти поверхневих ліпідів хвойних. Застосування сучасних методичних підходів дало можливість ідентифікувати у фракції жирних кислот ряд нових сполук, які практично не згадуються в оглядових роботах, присвячених біохімії ПЛ. Окрім звичайних кислот у фракції жирних кислот нами знайдені сполуки, наявність яких у ПЛ не обговорювалася раніше.

Розгалужені кислоти мали таку загальну формулу (рис. 1):

n = 11, 13 n = 12, 10

Знайдено дикарбонові кислоти загальної формули:

n = 7, 11 n = 12

та аліциклічна кислота

Рис .1 Незвичайні жирні кислоти поверхневих ліпідів.

Синтез розгалужених кислот відбувається внаслідок залучення до біосинтезу включення розгалужених амінокислот [Mukherji, 2003]. Циклопропановий фрагмент може синтезуватися внаслідок приєднання групи -СН3 до подвійного зв’язку (донор SAM) [Bao, 2003]. Дикарбонові кислоти синтезуються при окисненні кінцевої групи -СН3 відповідної монокарбонової кислоти [Kulattukudy, 1981]. Оскільки вищезгадані сполуки знайдено вперше ПЛ тканинах рослин, це підтверджує існування цих біосинтетичних систем у епідермальних тканинах рослин.

Незвичайні жирні кислот за виключенням аліциклічної кислоти знаходяться у невеликій кількості в ПЛ досліджених рослин (0,12-2,75 % до суми жирних кислот), що дозволяє віднести їх до мінорних компонентів. Аліциклічна кислота не може бути віднесена до таких компонентів, оскільки її вміст відповідає вмісту основних, мажорних кислот (до 28,31 % у ПЛ Picea abies другого року). кількісне визначення незвичайних кислот дало можливість говорити про видоспецифічність та онтогенетичну залежність їх біосинтезу. Наприклад, розгалужені кислоти гептанового ряду повністю відсутні в ПЛ Picea pungens та знайдені в невеликих кількостях тільки в ПЛ листя першого року інших рослин. Вміст аліциклічної кислоти підвищується з віком листя, або залишається на високому рівні у ПЛ листя другого та третього року.

Мінорні компоненти поверхневих ліпідів хвойних. Застосуваня методичних підходів, описаних вище, дозволило виділити та охарактеризувати ряд сполук терпеноїдної природи у ПЛ хвойних, які знаходились у невеликих кількостях і які раніше майже не обговорювались при вивченні ПЛ рослин.

Серед них – похідні абієтанової (1 - 5) та пімаранової (6 - 8) кислот (рис. 2)

Рис. 2 Дитерпенові похідні поверхневих ліпідів

Дитерпени були знайдені лише у ПЛ Picea abies і Pinus pallasiana. Здебільшого у сучасних хвойних знайдено похідні абієтанів, які містять ненасичене шестичленне кільце. За своєю ненасиченістю 4 ,5 сполуки подібні до розповсюджених, але містять замісники (окиснені метилові групи, метокси групи), що не спостерігалося раніше. Також практично відсутні згадки про терпеноїди типу 1,2,3 у яких третє кільце частково відновлене. Отже, усі похідні абієтанової кислоти знайдені нами вперше. Похідні пімарової кислоти є гомологами абієтанів, які відрізняються на одне етиленове угрупування. Такі сполуки також не знайдено в тканинах хвойних [Otto, 2003], отже, вони характерні лише для ПЛ листя. Вміст абієтанової кислоти досягав 23,45 % у ПЛ Picea abies першого року. Показано переважання дитерпенів на першому році онтогенезу. Для дитерпенів, на відміну від тритерпенів, характерний немевалонатний шлях біосинтезу, всі реакції якого проходять в стромі пластид [Martin, 2002].

Існування терпеноїдів з різноманітними функціональними групами в захисному ліпідному шарі може бути пов’язане з необхідністю формування групи речовин, що забезпечують гетерогенну суміш, здатну підтримувати певний “молекулярно-динамічний стан” поверхневих тканин. Такий стан потребує наявності, з одного боку, високомолекулярних гідрофобних речовин, які роблять вагомий внесок в “аморфну” частину ПЛ, з іншого боку - полярних речовин, або частин молекул, що забезпечують здатність до асоціації та формування кристалічної фази.

Показано наявність в ПЛ сквалену та п-кумарової кислоти. Попередник три терпенів сквален був характерний для ПЛ Picea pungens, найбільше його (0,71 %) спостерігалося на першому році онтогенезу. п-Кумарова кислота була характерна для ПЛ лише представника роду Pinus (0,4 %).

Біохімічні характеристики поверхневих ліпідів хвойних з частковим пошкодженням крони. Вивчалися загальні характеристики ПЛ, такі як ІЧ-спектри та ДТА сумарних фракцій ПЛ досліджуваних рослин. Розглянемо їх зміни на прикладі ПЛ Pinus pallasiana (табл. 1).

Таблиця.1

Відносна інтенсивність двох смуг карбонільного поглинання сумарних поверхневих ліпідів контрольних рослин (к) та рослин з частковим пошкодженням крони (д)

Досліджувана рослина | Співвідношення інтенсивностей смуг

(1640-1650 : 1725-1740) (н см-1)

Pinus pallasiana 1рік/к | 1:4,0

Pinus pallasiana 2рік/к | 1:4,10

Pinus pallasiana 1рік/д | 1:1,24

Pinus pallasiana 2рік/д | 1:1,50

Так, ІЧ-спектри контрольних та дослідних рослин відрізнялись областю карбонільного поглинання. Інтенсивність двох смуг поглинання, які відносяться до груп, змінювалися під впливом токсикантів. При цьому, як онтогенетичні, так і екзогенні фактори мали однакове спрямування: збільшувалася інтенсивність поглинання більш короткохвильової смуги (1725 - 1740 см-1) у порівнянні з більш довгохвильовою смугою (1640 - 1650 см-1). Обидві смуги відносяться до валентного коливання карбонільної групи. Оскільки в ПЛ хвойних оксо-сполуки (альдегіди та кетони) відсутні, аналогічні зміни спектральних характеристик свідчили про зміну жирнокислотного складу ПЛ у процесі онтогенезу [Берзеніна, 2000], ми припустили, що в умовах токсичної дії екзогенних речовин відбуваються перебудови ПЛ (синтез de novo одних компонентів, розклад інших, або разом), які включають біосинтез жирних кислот. Необхідно відмітити, що ІЧ-спектральні характеристики застосовані нами вперше для оцінки екзогенного впливу на склад ПЛ.

Таблиця 2

Параметри ендотермічних переходів поверхневих ліпідів листя хвойних різного віку контрольних рослин (к) та рослин з частковим пошкодженням крони (д)

Вид рослини, вік | Ендоефект 1 без втрати маси | Ендоефект 2 без втрати маси

температурний інтервал,0С | мінімум 0С | температурний інтервал,0С | мінімум 0С

Pinus pallasiana 1рік/к | 20-40 | - | 45-55 | 52

Pinus pallasiana 1рік/д | - | - | 38-79 | 74

Pinus pallasiana 2рік/к | 22-43 | - | 45-70 | 56

Pinus pallasiana 2рік/д | - | - | 46-90 | 76

Перший ендотермічний ефект було знайдено тільки для рослин, які вирощувалися у контрольних умовах. Цей низькотемпературний ефект без мінімуму відносять до переходу аморфної фази ПЛ в кристалічну [Reynhardt, 1994]. Отже, відсутність такого переходу у рослин з частковим пошкодженням крони може бути пояснена зниженням інтенсивності біосинтезу тих компонентів ПЛ, які утворюють аморфну фазу (естери, вуглеводні і т. і.) внаслідок впливу токсикантів.

Другий ендотермічний ефект характеризує перехід кристалічної фази в рідку, тобто плавлення ПЛ. Він має чіткий мінімум, що характерний для плавлення кристалічних сполук і відноситься до більш полярних компонентів ПЛ. У ПЛ під впливом токсикантів має місце зміна параметрів цього переходу: він має набагато більший розмір, розтягнутий інтервал, що свідчить про значно більшу гетерогенність полярних сполук. При дії токсикантів також зростає величина температурного інтервалу. Це також характерно для збільшення вмісту більш полярних, здатних до асоціації, сполук (табл.. 3).

Таблиця 3

Вміст низькомолекулярнихх та високомолекулярних жирнихх кислот поверхневих ліпідів Pinus pallasianaх контрольних рослин (к)) та рослин з частковим пошкодженням крони (д) (у % від суми) n = 4, P<0,05)

Клас жирних кислот | Вік рослини

1рік/к | 2 рік/к1 рік/д2 рік/д

Високомолекулярні 90,11±0,24 | 77,17±0,17 | 73,14±0,23 | 88,21±0,28

Низькомолекулярні | 4,28±0,07 | 16,83±0,15 | 20,12±0,29 | 8,45±0,07

У ПЛ контрольних рослин спостерігається збільшення на 12 % вміст високомолекулярних кислот з віком. При пошкодженні крони вміст довголанцюгових жирних кислот на 12 % зменшується. Ці дані співпадають з даними ДТА про зростання гетерогенності при дії токсикантів. Отже, вплив токсикантів викликає гальмування процесу елонгації жирних кислот.

В той же час вміст С18 - жирних кислот (С18:0, С18:1, С18:2) зростає здебільшого у всіх досліджених зразках під дією токсикантів. Для ПЛ Pinus pallasiana зростання характерне для першого року, де під впливом вміст С18 - жирних кислот збільшується на 1,13 %, в той же час вміст ненасичених кислот під впливом токсикантів зростає на 3,25 %.

Вміст аліциклічної кислоти зростає з 0,01 % для рослин контрольної групи до 45 % під дією токсикантів на першому році і, відповідно, зменшується з 18,95 % до 16,55 % на другому році. А вміст дитерпенів зростає з 10,77 % для рослин контрольної групи до 17,45 % під дією токсикантів на першому році і, відповідно, з 1,6 % до 17,8 % на другому році.

Жирні кислоти та мінорні компоненти поверхневих ліпідів водних рослин. У складі ПЛ водних рослин (табл. 3) нами був встановлений підвищений вміст ненасичених жирних кислот, жирних кислот з непарною кількістю атомів Карбону та вмісту кислот з довжиною ланцюга С16, С18 (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст жирних кислот досліджуваних

водних рослин(у % до суми) n = 4, P<0,05 | Жирна кислота | Typha latifolia L. | Juncus effusus L.

C 12:0 | 1,93±0,12 | 1,51±0,09

C 14:0 | 9,05±0,21 | 7,81±0,05

C 15:0 | 4,03±0,08 | 6,07±0,07

C 16:1 | 12,02±0,09 | 18,13±0,12

C 16:0 | 27,21±0,16 | 31,43±0,25

C 17:0 | 1,14±0,08 | 1,63±0,05

C 18:2 | 1,83±0,06 | 2,13±0,03

C 18:1 | 11,66±0,11 | 14,61±0,32

C 18:0 | 11,79±0,54 | 14,74±0,21

C 20:0 | 2,35±0,21 | 3,42±0,06

C 24:0 | 6,69±0,07 | 5,31±0,06

C 28:0 | 7,36±0,12 | 6,33±0,31 | С 30:0 | 8,02±0,02 | 12,51±0,07 | Ненасиченість жирних кислот, яка досягає значення 38 % є незвичайним явищем для ПЛ рослин. На відміну від хвойних рослин, для жирних кислот ПЛ водних рослин відмічається підвищений вміст більш високомолекулярних жирних кислот з довжиною ланцюга С16, С18, що є свідченням більш інтенсивної роботи синтази жирних кислот. Для ПЛ водних рослин характерним є високий вміст кислот з непарною кількістю атомів Карбону (6 - 8 %), які, згідно [Bianchi, 1995], знаходяться не в естерифікованій формі і складають основу фракції вільних жирних кислот.

Нами було показано наявність у складі ПЛ водних рослин ряду незвичайних жирних кислот та мінорних компонентів (табл. 5).

Таблиця 5

Незвичайні жирні кислоти досліджуваних водних рослин

(у % від вмісту у фракції) n = 4, P<0,05

Кислота | Typha latifolia L. | Juncus еffusus L.

антеізо-С15:0 | 5,76,09 | 7,51,12

циклопропаннонаноат,

2(2-бутілциклопропіл)метил | 18,28,04 | 17,66,54

циклогептадеканоат | 7,54±0,06 | 1,15±0,05

дегідроабієтанова кислота | 5,51±0,06 | 1,07±0,03

Відмічається присутність розгалуженої пентадеканової кислоти, аліциклічної кислоти. Дитерпени у ПЛ водних рослин представлені дегідроабієтановою кислотою, Окрім дициклічної кислоти нами була виявлена також кислота з циклогептановим фрагментом, що не було характерно для ПЛ хвойних рослин.

Компонент-специфічний ізотопний склад поверхневих ліпідів водних та хвойних рослин. Для ПЛ вивчених рослин цього типу середні значення дискримінації важкого ізотопу 13С для жирних кислот є характерними для рослин з С3 – типом фотосинтезу (табл. 6).

Таблиця 6

Середній коефіцієнт дискримінації для окремих груп жирних кислот поверхневих ліпідів досліджуваних рослин(?13С0/00)

Група жирних кислот | Picea abies | Typha latifolia L | Juncus effusus L.

Низькомолекулярні | -31,43 | -28,59 | -28,13

Високомолекулярні | -31,77 | -32,61 | -32,64

Для високомолекулярних жирних кислот загалом характерна більша дискримінація важкого ізотопу в процесі біосинтезу. Процес десатурації також є чутливими до ізотопного складу метаболітів. Перехід від С18:0 до С18:1 та С18:2 супроводжується збільшенням компонент-специфічної дискримінації від –27,89 до -28,79 та -28,77 відповідно (Typha latifolia L.) та від –27,66 до –28,38 та –28,97 (Juncus effusus L.). При цьому перший етап десатурації є більше чутливим до ізотопного складу компонентів, ніж другий. Десатурази олеїнової кислоти майже не чутливі до ізотопного складу субстрату, а десатурази пальмітоолеїнової кислоти працюють вибірково в Juncus effusus та невибірково в Typha latifolia.

Середні значення коефіцієнтів дискримінації вуглеводнів стабільного ізотопу 13С набагато більше, ніж жирних кислот (табл.7). Особливо це характерно для вуглеводнів ПЛ листя першого року. Очевидно, що на шляхах біосинтезу цих компонентів із жирних кислот існують ферменти, здатні відрізняти ізотопний склад метаболітів.

Таблиця 7

Середній коефіцієнт дискримінації для окремих груп вуглеводнів

поверхневих ліпідів листя хвойних різного віку ( ?13С0/00)

Групи вуглеводнів | Вік листя

рік

Низькомолекулярні | -35,1278 | -32,8216 | -30,2692

Високомолекулярні | -38,0190 | -33,8000 | -30,6954

Приведена вище закономірність щодо зростання коефіцієнта дискримінації важкого ізотопу 13С в процесі елонгації спостерігається і в даному випадку, тобто, довголанцюгові вуглеводні містять менше важкого ізотопу, ніж коротколанцюгові.

Показано зниження коефіцієнтів дискримінації 13С у вуглеводнях з віком листя, що характерне для всіх індивідуальних компонентів без виключення. Це можна пояснити гальмуванням процесу вибірковості епідермальних елонгаз з віком.

Узагальнення результатів дослідження. Отримані дані дозволяють обговорити деякі аспекти біосинтезу компонентів ПЛ (рис. 3).

Рис. 3 Напрямки використання ацетил Со-А при біосинтезі поверхневих ліпідів та середні коефіцієнти дискримінації 13С окремих компонентів ( - напрямки біосинтезу компонентів, що характерні для формування ПЛ у звичайних умовах вирощування, - напрямки біосинтезу компонентів, що характерні для формування ПЛ при дії токсикантів).

У звичайних умовах вирощування рослин синтаза жирних кислот, розташована у стромі хлоропластів, каталізує синтез жирних кислот з довжиною вуглецевого ланцюга до С16, С18. Стеаринова і пальмітинова кислоти потім транспортуються до епідермальних тканин, де починають працювати елонгази. Дія токсикантів призводить до зменшення продуктів елонгації, вірогідно, внаслідок або порушення транспорту цих жирних кислот, або внаслідок безпосереднього гальмування ферментативної системи елонгаз. На нашу думку, натомість відбувається більш інтенсивне використання фрагментів малоніл-СоА для синтезу незвичайних для ПЛ жирних кислот. Також можлива інтенсифікація процесу біосинтезу терпеноїдів з пірувату при блокуванні використання кінцевого продукту синтазної системи.

При впливові токсикантів нонадеканова, тридеканова та тетрадеканова кислоти, утворені внаслідок функціонування синтазної системи, підлягають поступовому окисненню за кінцевою –СН3 групою з утворенням відповідних дикарбонових кислот. Частина малоніл-СоА, із використанням в якості затравки ізобутіріл-СоА, ізовалеріл-СоА та 2-метилбутіріл-СоА, дають початок відповідним розгалуженим кислотам. Також відбувається інтенсифікація роботи десатураз, внаслідок чого вміст ненасичених жирних кислот зростає. Із ненасичених жирних кислот синтезується аліциклічна кислота.

Середні коефіцієнти дискримінації д13C ненасичених жирних кислот та аліциклічної кислот мають більше значення, ніж відповідні величини для стеаринової кислоти. Цей факт підтверджує, по-перше, зв’язок процесів десатурації та біосинтезу аліциклічної кислоти, по-друге, ці величини свідчать про чутливість процесу десатурації до ізотопного складу субстратів, тобто, процес утворення подвійного зв’язку переважно здійснюється з більш “легких” молекул стеаринової кислоти.

Як показано в літературному огляді та в обговоренні, обидві системи елонгації жирних кислот призводять до довголанцюгових жирних кислот з парною кількістю атомів Карбону (рис. 4).

CH3-(CH2)16-COOH

Ацил-відновний шлях Декарбоксилатний шлях

CH3-(CH2)n-COOH

(n=18-30)

CH3-(CH2)n-COOH CH3-(CH2)n-COOH

CH3-(CH2)n-COH CH3-(CH2)n-1-COOH

CH3-(CH2)n-OH

CH3-(CH2)n-1-COH

CH3-(CH2)n-CH3

CH3-(CH2)n-CH3

Рис. 4 Шляхи біосинтезу компонентів поверхневих ліпідів рослин та середні коефіцієнти дискримінації окремих компонентів (д113C – коефіцієнти дискримінації компонентів ПЛ хвойних рослин; д213C - коефіцієнти дискримінації компонентів ПЛ водних рослин).

Процес елонгації є чутливим до ізотопного складу метаболітів, про що говорить збільшення коефіцієнту дискримінації д13C для довго ланцюгових жирних кислот. Проте, цей процес є видоспецифічним, оскільки для водних рослин д13C збільшується на 4 0/00, а для хвойних рослин на 0,35 0/00. тобто в водних рослин елонгази жирних кислот здійснюють більшу дискримінацію важкого ізотопу Карбону.

Подальші шляхи перетворень вищих жирних кислот до алканів супроводжуються дією ферментів, які здійснюють також значну дискримінацію важкого ізотопу. Значення коефіцієнтів дискримінації для вуглеводнів ПЛ хвойних на 1 0/00 більше, ніж для жирних кислот, з яких починаються процеси відновлення або декарбоксилювання. Коефіцієнти дискримінації компонентів з парною кількістю атомів Карбону відрізняються від значень цих величин для компонентів з непарною кількістю атомів Карбону.

Вуглеводні октакозан (С28) та гептакозан (С27) за відомими схемами повинні синтезуватися з жирної кислоти октакозаноату (С28) за схемою (рис. 5):

CH3-(CH2)26-COOH

Ацил-відновний шлях Декарбоксилатний шлях

CH3-(CH2)26-CH3 CH3-(CH2)25-CH3

Рис. 5 Шляхи біосинтезу октакозану та гептакозану поверхневих ліпідів Picea pungens першого року та коефіцієнти дискримінації (д13C) для окремих компонентів.

Коефіцієнт дискримінації для парного компоненту менше, ніж для непарного. Ця тенденція зберігається для багатьох пар вуглеводнів. Отже, це є доказом різного шляху синтезу цих компонентів та ще одним підтвердженням існування двох систем елонгації жирних кислот в поверхневих тканинах рослин.

Отже, компонент – специфічний ізотопний аналіз ПЛ, застосований нами, дозволяє розглянути нові аспекти біосинтезу компонентів ПЛ рослин та показати чутливість певних ферментативних систем до ізотопного складу метаболітів.

ВИСНОВКИ

1. Вивчено жирнокислотний склад та мінорні компоненти поверхневих ліпідів деяких видів хвойних та водних рослин. Показана наявність розгалужених, аліциклічних, дикарбонових, фенольних кислот, терпеноїдів. Показано значну дискримінацію стабільного важкого ізотопу 13С у компонентах поверхневих ліпідів рослин.

2. У фракції жирних кислот поверхневих ліпідів окрім звичайних кислот виявлені розгалужені (ізо- та антеізо пента- та гептадеканові кислоти), аліциклічні (дициклопропанова кислота), та дикарбонові (дикарбоксинонаноат, дикарбокситридеканоат, 12-метил-тетрадеканоат) кислоти.

3. Серед мінорних компонентів поверхневих ліпідів рослин знайдено терпеноїди класів абієтану та пімарану, фенольні кислоти функція яких, вірогідно, полягає у підтриманні впорядкованості структури поверхневих ліпідів та підвищенні температури фазових переходів “кристалічна - аморфна” фази.

4. В умовах пристосування до факторів зовнішнього середовища відбувається перебудова шару поверхневих ліпідів за участю мінорних компонентів та незвичайних жирних кислот, що підкреслює важливість їх функцій у формуванні поверхневого шару з певними молекулярно – динамічними характеристиками.

5. Показано значну ненасиченість поверхневих ліпідів водних рослин, яка обумовлена наявністю пальмітоолеїнової, олеїнової та лінолевої кислот.

6. Показано компонент – специфічну дискримінацію важкого ізотопу 13С жирних кислот та вуглеводнів поверхневих ліпідів рослин, яка найбільш суттєва для довголанцюгових компонентів та ненасичених жирних кислот, що демонструє специфічність ферментів біосинтезу компонентів поверхневих ліпідів стосовно ізотопного складу метаболітів.

7. На основі отриманих даних обговорені деякі аспекти біосинтезу компонентів поверхневих ліпідів рослин.

СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Берзеніна О.В., Штеменко Н.І., Шепеленко В.М. Методи дослідження поверхневих ліпідів рослин. Вісник ДНУ.-Т.2.-Вип. 10.-2002.-С. 104-109.

2. Штеменко Н.І., Сорочан О.О., Лєонтьева І.С., Журавльова Г.А., Шепеленко В.М. Вплив забруднювачів на формування кристалічної фази поверхневих ліпідів хвойних. Вісник ДНУ.-Т.2.-Вип. 11.-2003.-С. 205-209

3. Shtemenko N.I., Shepelenko V.N., Richnow H., Kuschk P. Surface lipids composition of emergent plants used in constructed wetlands // NATO Science Series: Earth and Environmental Sciences. ISBN: 1-4020-3114-9, 2005.- Part IV.- Vol. 48 .- P. 325-330.

4. Shepelenko V.N., Shtemenko N.I., Bersenina O.V. Composition of surface lipids of leaves of Coniferous under influence of industrial contaminants. Manuscript of the Sixth International Symposium & Exhibition on Environmental Contamination in Central & Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States. Prague, Czech Republic, 2003.- P 473.

5. Shtemenko N.I., Sorochan O.A., Shepelenko V.M. Some biochemical mechanisms that may be involved in the process of phytoremediation. ConSoil, 2003. C-2233.

6. Лєонтьева І.С., Журавльова Г.А., Шепеленко В.М. Поверхневі ліпіди рослин: сучасний стан проблеми. Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції ”Біохімія”.-Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2003.-С.3-5.

7. Леонтьєва І.С., Журавльова Г.А., Шепеленко В.М. Терпеноїди поверхневих ліпідів хвойних (Coniferous) V Регіональна конференція молодих вчених з актуальних питань хімії. Дніпропетровськ: 2002.- С.25.

8. Лозова Н.С., Шепеленко В.М. Мінорні компоненти поверхневих ліпідів рослин. ІІ Всеукраїнська конференція молодих вчених з актуальниї питань хімії. Дніпропетровськ: 2004.- С.38.

9.

АНОТАЦІЯ

Шепеленко В.М. мінорні компоненти та жирнокислотний склад поверхневих ліпідів деяких видів рослин – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ 2005.

У фракції жирних кислот поверхневих ліпідів окрім звичайних кислот виявлені розгалужені, аліциклічні, та дикарбонові кислоти. Серед мінорних компонентів поверхневих ліпідів рослин знайдено терпеноїди класів абієтану та пімарану, фенольні кислоти, функція яких, вірогідно, полягає у підтриманні впорядкованості структури поверхневих ліпідів та підвищенні температури фазових переходів “кристалічна - аморфна” фази. В умовах пристосування до факторів зовнішнього середовища відбувається перебудова шару поверхневих ліпідів за участю мінорних компонентів та незвичайних жирних кислот. Показано значну ненасиченість поверхневих ліпідів водних рослин, яка обумовлена наявністю пальмітоолеїнової, олеїнової та лінолевої кислот. Показано компонент-специфічну дискримінацію важкого ізотопу 13С жирних кислот та вуглеводнів поверхневих ліпідів рослин, яка найбільш суттєва для довголанцюгових компонентів та ненасичених жирних кислот, що демонструє специфічність ферментів біосинтезу компонентів поверхневих ліпідів стосовно ізотопного складу метаболітів.

На основі отриманих даних обговорені деякі аспекти біосинтезу компонентів поверхневих ліпідів рослин.

Ключові слова : поверхневі ліпіди, жирні кислоти, терпеноїди, хвойні, водні рослини, хромато-мас-спектрометрія.

АННОТАЦИЯ

Шепеленко В.М. Минорные компоненты и жирнокислотний состав поверхностных липидов некоторых видов растений - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев 2005.

Во фракции жирных кислот поверхностных липидов хвойных и водных растений кроме обычных кислот найдены разветвленные, алициклические и дикарбоновые кислоты. Среди минорных компонентов поверхностных липидов растений найдены терпеноиды классов абиетана и пимарана, фенольные кислоты, функция которых, возможно, состоит в поддержании упорядочености структуры поверхностных липидов и повышении температуры фазовых переходов кристаллическая - аморфная” фазы.

В условиях приспособления к факторам внешней среды происходит перестройка слоя поверхностных липидов при участии минорных компонентов и необычных жирных кислот. Действие токсикантов приводит к уменьшению продуктов элонгации жирных кислот, что вызвано, либо нарушением транспорта стеариновой и пальмитиновой кислот, либо вследствие непостредственного торможения ферментативной системы элонгаз. В тоже время происходит белее интенсивное использование фрагментов малонил-СоА для синтеза необычных для ПЛ жирных кислот. Нонадекановая, тридекановая и тетрадекановая кислоты, образованые вследствии функционирования синтазной системы, окисляются по концевой –СН3 группе с образованием соответсвующих дикарбоновых кислот. Часть малонил-СоА, с использованием в качестве затравки изобутирил-СоА, изовалерил-СоА та 2-метилбутирил-СоА, дають начало разветвленным кислотам. Также происходит интенсификация работы десатураз, вследствии чего содержание ненасыщеных жирных кислот возрастает. Ненасыщеные жирные кислоты, в свою очередь, при циклизации, дают начало алицикличной кислоте. Также, возможна, интенсификация процесса биосинтеза терпеноидов с пирувата при блокировании использования конечного продукта синтазной системы.

Показана значительная ненасыщенность поверхностных липидов водных растений, которая обусловлена наличием пальмитоолеиновой, олеиновой и линолевой кислот.

Показано компонент–специфическую дискриминацию изотопа 13С в жирных кислотах и углеводородах поверхностных липидов растений, которая наиболее существенна для длинноцепочечных компонентов и ненасыщенных жирных кислот, что демонстрирует специфичность ферментов биосинтеза компонентов поверхностных липидов относительно изотопного состава метаболитов. Этот факт указывает на чувствительность процесса десатурации к изотопному составу субстратов, то есть, процесс образования двойной связи происходит путём вовлечения более “легких” молекул стеариновой кислоты. Процесс элонгации также чувствителен к изотопному составу метаболитов, о чём говорит увиличение коэфициента дискриминации д13C для длинноцепочечных жирных кислот. Но этот процесс видоспецифичен, поскольку для водных ростений д13C увеличивается на 4 0/00, а для хвойных ростений на 0,35 0/00. Таким образом, у водных растений элонгазы жирных кислот осуществляют большую дискриминацию тяжелого изотопа углерода.

На основе полученных данных обсужденные некоторые аспекты биосинтеза компонентов поверхностных липидов растений.

Ключевые слова : поверхностные липиды, жирные кислоты, терпеноиды, хвойные, водные растения, хромато-мас-спектрометрия.

SUMMARY

Shepelenko V.M. Minor components and fatty acids composition of surface lipids some types of plants.

The dissertation to obtain scientific degree of the candidate of biological sciences on speciality 03.00.04 – Biochemistry.- Palladin Institute of the National Academy of Science of Ukkraine. Kyiv, 2005.

Dnepropetrovsk National University, Board of Biophysics and Biochemistry, Dnepropetrovsk, 2004.

Minor components and free fatty acids composition of some types surface lipids of some Coniferae and water plants were investigated. Presence of branched, alicyclic, dicarboxylic acids was shown the fraction of fatty acids. Among minor components of surface lipids terpenoids of pimarane and abietane classes were found, phenolic function of which may be in maintanance in ordering in surface lipids fraction and in increasing of the temperature of fase transition “crystal-amorphous” fases. In condition of adaptation to environmental factors rebuilding of the surface to layer takes with the partitition of minor components and unusial fatty acids. The unsaturation of surface lipids due to palmitooleic, oleic, and linolenic acids presence was shown for water plants. The component specific discriminations of the hard isotope 13C in fatty acids and hydrocarbons was shown especially large for the long-chained components and unsaturated fatty acids, that demonstrates specifity of enzymes of biosynthesis of surface lipids components to isotopic content of metabolites. On the base of obtained data some aspects of surface lipids components biosynthesis are speculated.

Key words: surface lipids, fatty acids, terpenoids, Coniferae, water plants, chromato-mass-spectrometry.