НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КЛЕСТОВА Зінаїда Сергіївна

УДК 619:578.891:575.113: 576

ТЕОРЕТИЧНЕ ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ КОНТРОЛЮ ГЕНОМУ КЛІТИН ПРИ ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЯХ ТВАРИН ТА В ПРОЦЕСІ РОЗРОБКИ ЗАСОБІВ ЇХ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

КИЇВ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії вірусології та лабораторії по розробці технології виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней Інституту ветеринарної медицини УААН

Наукові консультанти :

доктор ветеринарних наук, професор, член-кор. УААН і РАСГН

Собко Анатолій Іванович, Інститут ветеринарної медицини УААН;

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Фукс Поліна Павлівна, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної

медицини УААН

Офіційні опоненти :

доктор ветеринарних наук, професор

Скибицький Володимир Гурійович,

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор

Берднік Василь Петрович,

Полтавська державна аграрна академія Мінагрополітики України,

завідувач кафедри анатомії та фізіології

доктор біологічних наук, професор, член-кор.НАНУ

Співак Микола Якович, Інститут мікробіології та вірусології ім.

Д.К.Заболотного НАН України,

завідувач відділом проблем інтерферону та імуномодуляторів

Провідна установа - Одеський державний аграрний університет Мінагрополітики

України, кафедра епізоотології та паразитології, м.Одеса.

Захист дисертації відбудеться “ 29 “ червня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою : 03041, м.Київ-41, вул.Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд.65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою : 03041, м.Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус 4, к.41

Автореферат розісланий “27“ травня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради _______________________________Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вірусні інфекції сільськогосподарських тварин широко розповсюджені в світі і часто завдають значних економічних збитків промисловому тваринництву. Вони є серйозною загрозою для сприйнятливих біологічних обґєктів через циркулювання великої кількості патогенів, а також і через відсутність або недосконалість, у деяких випадках, ефективних, безпечних заходів профілактики і боротьби з ними.

Серед поширених інфекційних хвороб, спричинених патогенними РНК-вмісними вірусами тварин, є ротавірусна хвороба свиней (РВХС), лейкоз великої рогатої худоби, класична чума свиней (КЧС), трансмісивний гастроентерит свиней (ТГС), а також патологія відтворення у свиней, яка пов’язана із синдромом SMEDI енте-ровірусної етіології (Dunn H.W. et all., 1965; Ercegan M., 1975; Kubin G. et all., 1979; Собко А.І., 1981; Гаврилов Н. та інш., 1983; Debouck F. Et all., 1984; Нахмансон В.М., 1986; Белянко Л.В., 1991; Alfieri A., 1991; Depner K.R. et all., 1996; Dodet B. et all., 1997; Сюрін В.М. та інш., 1998; Шиков О.Т., 2005). Наприклад, серед п’яти хвороб, що в останні роки лідирують в тваринництві Росії, реєструються КЧС і ТГС, незважаючи на по-силені заходи профілактики та боротьби з ними. Так, за період 1997–2001 роки ле-тальність серед поголівґя свиней від ТГС становила 59,9 % (кількість неблагополу-чних пунктів – 42), від КЧС – 58,8 % (кількість неблагополучних пунктів – 66) (Рахманов А.М., 2003).

В Україні у 1988 – 1998 рр. ситуація по КЧС була неоднозначною (Прискока В.А., 2000; О.Т. Шиков, 2005). Так, за даними В.А. Прискоки із співавторами (2000) у 1994 році захворювання було діаг-ностовано в 51 неблагополучному пункті, у 1995 – в 21, у 1996 році – лише в од-ному, а у 1997 – 1998 - в жодному. Зусиллями О.Т. Шикова із співробітниками (2005) проведені тривалі дослідження розповсюдження КЧС в Україні: створено кадастр неблагополучних пунктів по КЧС за період 1961 – 2004 рр., і також показано тенденцію до зменшення поширення даної інфекції в останні роки. Але, слід звернути увагу на застереження О.І. Бузуна та інших (наведені В.А. Прискокою, 2000) про те, що відсутність хвороби серед поголівґя свиней через 5–7 років на території ліквідо-ваного вогнища інфекції, ще не означає відсутно-сті там збудника захворювання, а лише показує, що на цій території немає його віруле-нтної форми.

Відмітимо негативні наслідки, які відомі крім основних клінічних ознак, при деяких із вищезгаданих хвороб, причини виникнення яких досі не досліджені. Так, організм тварин вразливий до дії збудника класичної чуми в пренатальний період розвитку. Хвороба сприяла виникненню абортів, муміфікації, водянки плодів та їх загибелі (Сюрін В.М., 1991; Курінов В.В., 1995; Floegel G., 1999). Існують дані, що при ТГС у 3 % випадків свиноматки абортували, а ті що перехво-ріли – втрачали репродуктивну здатність на 30–40 %. Перехворілі поросята нерідко відставали в рості і розвитку (Гаврилов Н., 1983; Mayer A., 1984; Сюрін В.М., 1998).

Ентеровіруси, що спричиняють патологію відтворення у свиней із синдромом SMEDI, також сприяють муміфікації, мертвона-родженню плодів, загибелі ембріонів і безпліддю у тварин (Dunn H.W., 1965). Встановлена в свинарських господарствах України їх ци-ркуляція (Тацька В.Н., 1997; Клестова З.С., Тацька В.Н., 2003), а також і циркуляція збудника ротавірусної хвороби свиней (Клестова З.С., 2003). Крім того, нерідко спостерігають перебіг вірусних інфекцій у тварин, спричинених двома патогенами, наприклад, при сумісному перебігу гастроентеритів, рота- та коронавірусної етіоло-гії (Апатенко В.М., 1978; Theil K.W. et all., 1979; Bohl E.H., 1979; Слободенюк В.К. та інш., 1984; Собко А.І. та ін., 1988).

Для багатьох країн СНД: Росії, Білорусії, Узбекистану, Таджикистану, Ка-захстану, України все ще залишається актуальною проблема лейкозу вели-кої рогатої худоби (Валіхов А.Ф. та інш., 1980; Лемеш В.М. та інш., 1987; Бусол В.А., 1988; Бурба Л.Г. та інш., 1988; Коломицев А.А. та інш., 1995; Епачинцева О.В., 1995; Цимбал В.І., 1998; Аранчій С.В., 1999; Коромислов Г. Ф. та інш., 1999; Мандигра М.С., 1999, 2000;. Нагаєва Л.І. та інш., 2003; Атамась В.Я., 2003; Кісера Я.В.,2005). Але, початковий етап взаємодії ретровірусу лейкозу і геному клі-тин ще малодосліджений.

Віруси, які викликають вищеоз-начені захворювання відрізняються між собою морфологією, хімічним складом, способом реплікації і трансляції, тропізмом до чутливих клітин, взаємодією з ними і сприйнятливими організмами тварин, багато аспектів якої залишилось поза ува-гою дослідників, таких, наприклад, як вплив вірусів на геном інфікованих клітин. Це важливо також із-за постійної небезпеки спалахів як відомих, так і нових вірусних хвороб.

Система вірус-клітина виступає в ролі унікальної живої системи, кардина-льною відмінністю якої від всіх інших систем, є наявність двох геномів, здатних одночасно реалізувати свій генетичний код, що утруднює дослідження їх впливу на перебіг внутрішньоклітинних процесів. Питання матеріальних основ спадковості соматичних клітин є складовою як загальнобіологічної проблеми – організації і функціонування геному евкаріотичних організмів, так і ветеринарної медицини, бо значною мірою повґязані із станом здоровґя продуктивних тварин. Але відомі різні чинники, що порушують ці матері-альні основи спадковості тваринних клітин. Так, відомо, що віруси, як атенуйовані (які використовують для вакцинації), так і польові вірулентні штами, а також інтегровані в геном клітин хазяїна належать до мутагенів біологічної природи (Блюмкін В.Н., 1973; Гершензон С.М., 1975; Засухіна Г.Д., 1983; Ільїнських А.А.,1984; Бужієвська Т.І., 1984,), генотоксична дія яких спричиняє значне пошкодження ге-ному уражених клітин.

На даний час генотоксична дія РНК-вмісних патогенів тварин – ротаві-русу свиней, ентеровірусів свиней, що спричиняють синдром SMEDI, вірусу класичної чуми свиней, вірусу лейкозу великої рогатої худоби майже не досліджена. Це слід заува-жити, оскільки наслідки впливу цих вірусів, у комплексі із дією негативних факторів зовніш-нього середовища, можуть бути значними і небезпечними для геному клітин як продуктивних, так і племінних тварин, що може призвести не тільки до спадкових патологій, а й до порушень нормального функціонування на рівні клітин та організмів. Тому дослідження біологічних властивостей вірусів, в тому числі і мутагенної активності, виявлення змін в їх популяціях сприятиме встановленню особливостей перебігу інфекційних хвороб та розкриттю особливостей взаємодії патогена і чутливого до нього біологічного обґєкта. Від цього залежить і ефективність розробки та створення засобів специфічної профілактики вірусних хвороб тварин.

Комплексний підхід, поєднуючий генетичну, діагностичну та профілактично-лікувальні методології, сприятиме розробці нових ефективних схем та засо-бів профілактики вірусних хвороб продуктивних та племінних тварин, захисту ге-ному їх клітин від негативних чинників. Тому виявлення нових мутагенів біологіч-ної природи, в тому числі і розповсюджених патогенних РНК-вмісних вірусів тва-рин, як і розробка та створення препаратів з протективною, антимутагенною дією, допоможе у збереженні здоров’я тварин. Тестування виявлених вірус-інду-кованих змін (під впливом патогенних вірусів тварин) у клітинах і популяціях тва-рин, особливо племінних, створить додаткові контрольні заходи з біобезпеки при застосуванні лікувально-профілактичних засобів у тваринництві, що сприятиме розвитку ветеринарної медицини в сучасних умовах.

Вищеозначене вимагало вирішення цих проблем, що і зумовило вибір теми.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною досліджень, передбачених тематичними планами Ін-ституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук:

“Розробити і впровадити технологію виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней та визначити перспективу її використання в системі специфічної профілактики” (1988–1992) (Постанова ДКНТ №290 від 10 серпня 1988 року); державна реєстрація № 03.06/007-92 “Вивчити епізоотологію найбільш поширених інфекційних захворювань свиней, розробити сучасні методи діагнос-тики, профілактики та терапії “(Постанова ДКНТ від 4 травня 1992р.) (1992–1996); державна реєстрація № 01.04 “Діагностика, корекція і профілактика структурних пошкоджень генетичного апарату клітин тварин, зумовлених дією інфекційних, технологічних та екологічних факторів” (1993–1996); державна реєстрація № 0197U012751 “Вивчити вплив патогенів на генетичний апарат тваринних клітин та розробити методи його корекції при дії інфекційних, технологічних та екологічних факторів” (1996–1998); державна реєстрація № 0201U001345 “Розробити засоби діагностики та системи профілактики корона-, ентеро-, парвовірусної інфе-кції та SMEDI свиней” (1996–2000); державна реєстрація № 0101U000871 “Розро-бити та впровадити засоби діагностики гастроентеритів у свиней вірусної етіології” (2001–2004); державна реєстрація № 0197U012749 “Створити нові лікувально-про-філактичні засоби на основі лікарської рослинної сировини” (1996–1998); державна реєстрація № 0197U012747 “Розробити засоби і методи діагностики та профілак-тики вірусного артереїту, грипу і вивчити епізоотологію енцефаломієліту коней” (1996–2000).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи полягала у визначенні впливу патогенних РНК-вміс-них вірусів тварин (представників родин Reoviridae, Picornaviridae, Сoronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) на геном інфікованих клітин; виявленні особливостей їх взаємодії з чутливими біологічними системами (клітинами і організмами тварин); використанні цих особливостей для індикації та спрямованої зміни біологічних властивостей збудників при розробці та створенні нових засобів специфічної профілактики вірусних хвороб тварин.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження : - взаємодія патогенних РНК-вмісних вірусів тварин (ротавірусу свиней, коронавірусу свиней, ентеровірусів свиней групи SMEDI, ві-русу кластичної чуми свиней, вірусу лейкозу великої рогатої худоби) і чутливих біологічних систем на генетичному, клітинному, організменному, популяційному рівнях; - стан спадкового апарату соматичних клітин свиней та великої рогатої худоби під дією РНК-вмісних вірусів тварин; - способи виявлення і зниження мутагенної дії вірусів тварин; - спо-соби спрямованої зміни біологічних властивостей збудників інфекційних хвороб тварин;- антимутагенні та антивірусні властивості рослин;- технологія виготов-лення засобів специфічної профілактики ротавірусної хвороби свиней та класичної чуми свиней.

Предмет дослідження :- штами РНК-вмісних вірусів тварин: ротавірусу свиней, коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней, вірусу класичної чуми свиней, ентеровірусів свиней, причетних до синдрому SMEDI, лейкозу ВРХ; - кров; - інфіковані, РНК-вмісними вірусами тварин, клітини та тварини; - метафазні пластинки хромосом клітин свиней; - ділянки ДНК лімфоцитів великої рогатої худоби; - морфологічні особливості структури РНК-вмісних вірусів тваринг та морфогенез в інфікованій клітині; - популяція ротавірусу свиней в інфікованій клітині та культурі клітин; - показники гуморального імунітету (постінфекційного та поствакцинального) у сви-ней; - інфекційна активність вірусів; - первинні та перещеплювані культури клітин свиней; - хімічні речовини; - рослини.

Методи дослідження : - біологічний експеримент (відтворення захворю-вання у біопробі на безмолозивних поросятах та тваринах-гнотобіотах з метою ви-ділення збудників, відтворення клінічної картини захворювання, визначення віру-лентності ізолятів вірусів, отримання і відбір матеріалу для електронно-мікроскопі-чних і цитогенетичних досліджень); - мікроскопічні (для контролю стану клітин у моношарі при культивуванні та характеристики цитопатичної дії вірусів in vitro, для дослідження метафазних пластинок хромосом соматичних клітин тварин, для виявлення вірусу КЧС у культурі клітин за імунофлуоресцен-цією); -електронно-мікроскопічні (дослідження морфології і структури вірусів інфекційних хвороб свиней та ВРХ: родин Coronaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Picornaviridae); - вірусологічні (виділення вірусів з органів хворих тва-рин та з патологічного матеріалу загиблих, культивування та атенуація вірусів, пе-ревірка на реверсибельність, визначення стійкості вірусів проти дії різних чинни-ків, титрування вірусів, виявлення змін інфекційної активності вірусів під дією хі-мічних речовин та в процесі адаптації до чутливих систем культивування); -серологічні (визначення титрів антитіл до збудників вірусних хвороб тварин при дослідженнях сироваток крові, молозива, молока і типування збудників); - бактеріологічні (при перевірці контролю на стерильність очищених вірусних суспензій та фітопрепаратів); - клінічні (виявлення у тварин симптомів ротавірусної хвороби, класичної чуми, трансмісивного гастроентериту свиней); -імунологічні (дослідження показників гуморального і колострального імунітету тварин, одержання специфічних гіперімунних сироваток, застосування ФІТЦ-іму-ноглобулінів для виявлення вірусу КЧС в інфікованих клітинах); - цитогенетичні (для каріотипування, виявлення пошкоджень хромосомного апарату клітин тварин, виявлення геномних мутацій); - молекулярно-біологічний (для виявлення змін у локусах ДНК); - біотехнологічні (при культивуванні калусної культури кореня же-ньшеню, вирощування культур клітин тварин, тестуванні вірусних патогенів у чут-ливих системах, культивуванні сировини для виробництва вакцин); - хімічні (екст-рагування біологічно активних речовин рослин); -статистичні методи (підрахунки ймовірності одержаних результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлений ранній етап взаємодії коронавірусу і ротавірусу з ентероцитом кишечника свиней: пошкодження структури мікроворсинок цих клітин, що відбувається до моменту адсорбції на специфічних рецепторах клітинної мембрани.

Вперше встановлена структура популяції ротавірусу свиней та її зміни при довготривалій адаптації (протягом 85 пасажів) до чутливих систем культивування. Виявлена гетерогенність популяції збудника (за S-ознакою та методом електронної мікроскопії), в якій постійно присутня стабільна мікро-популяція патогену.

Вперше встановлена генотоксична дія патогенних РНК-вмісних вірусів, збу-дників інфекційних хвороб тварин.

Виявлений і порівняний мутагенний ефект патогенних РНК-вмісних вірусів свиней при моно-та асоційованих інфекціях (у випадку сукупного та роздільного інфікування епізоотичними штамами рота- та коронавірусу свиней) в умовах in vivo. Встановлено пошкодження хромосомного апарату клітин свиней (in vivo та in vitro) при застосуванні живих вакцинних противірусних препаратів. Виявлено, що одночасний вплив двох РНК-вмісних вірусів підсилює генотоксичний ефект в клітинах свиней порівняно з дією одного патогену.

Встановлена відмінність впливу вакцинних штамів вірусу класичної чуми свиней (живого і інактивованого) на хромосомний аппарат клітин цих тварин.

Виявлені зміни інфекційної активності коронавірусу і ротавірусу свиней (інгібіцію та підвищення) під дією настою кореня женьшеню, отриманого з калусної культури, що можливо використовувати у виробництві інакти-вованих і живих вакцин.

Встановлена можливість зниження мутагенного впливу РНК-вмісних вірусів тварин за допомогою фітопрепаратів.

Пріоритет роботи, наукова новизна досліджень підтверджена Державним департаментом України з інтелектуальної власності патентами: № 95125530 від 4.03.97 “ Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини для вироб-ництва біологічних препаратів”; № 95052507 від 15.07.97 “Спосіб інакти-вації вірусів”; № 95073164 від 15.07.97 “Способ получения экспресс-мо-дели испытания антимутагенных препаратов при вирусных повреждениях геномов клеток свиней”; № 96030913 від 04.11.97 “ Спосiб очищення основи для приготування поживних середовищ”.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлення мутагенного ефекту дії вірулентних і вакцинних штамів ротаві-русу свиней, вірусу класичної чуми свиней, ентеровірусів свиней, причетних до патології відтворення із синдромом SMEDI, вірусу лейкозу ВРХ, а також сукупної дії двох збудників, набуває важли-вого практичного значення у збереженні здоров’я, продуктивних якостей і генофо-нду тварин, у селекційній роботі, створенні нових підходів у профілактично-ліку-вальній справі при запобіганні та боротьбі з вірусними хворобами тварин. Це має теоретичне та важливе практичне значення при виявленні нових аспектів патогенезу цих хвороб та розробці і створенні нових високоефективних та безпечних вакцинних препа-ратів.

Виявлення ранньої вза-ємодії між вірусом і чутливою клітиною, що призводить до пошкодження останньої, важливе у зґясуванні розвитку інфекційного процесу, а також при створенні но-вих захисних противірусних препаратів.

Результати електронно-мікроскопічних досліджень допомогли в діагностиці вірусних хвороб при спалахах інфекцій в господарствах, при підтвердженні резуль-татів біопроби, при визначенні оптимальних строків відбору матеріалів для віру-сологічних досліджень, а також при дослідженні ультраструктурних змін в інфіко-ваній клітині та виявленні особливостей морфогенезу РНК-вмісних вірусів тва-рин, що важливо для пояснень механізмів патогенезу вірусних хвороб на ранніх стадіях.

Отримані результати серологічного моніторингу дозволили встановити цир-кулювання збудників ротавірусної хвороби, патології відтворення свиней ентерові-русної етіології із синдромом SMEDI в тваринницьких господарствах, а також в оцінці постінфекційного та поствакцинального імунітетів у свиней при дії вакцинних і вірулентних штамів корона- і ротавірусів свиней.

Проведені дослідження створили базис для подальшого розширення на-пряму з біобезпеки в галузі тваринництва, особливо у племінній справі, для чого запропоновано використання розроблених нами “Методичних рекомендацій по ви-явленню, обліку аберацій хромосом клітин свиней при вірусних інфекціях” (2005). Крім того, одержані результати допомогли створити тест-систему для перевірки антимутагенних властивостей препаратів та довести можливість зменшення мута-генного інфекційного навантаження на спадковий аппарат соматичних клітин тва-рин, викликане патогенними РНК-вмісними вірусами, застосовуючи природні ре-сурси рослин, безпечні для тварин, що важливо для зниження ризику генетичних порушень.

Виявлення стабільної частини популяції ротавірусу свиней при змінах чут-ливих біологічних систем (культур клітин) слугує моделлю для створення переду-мови нового підходу досліджень біологічних складових епізоотичного процесу, а також сприяє новим шляхам у розробці противірусних вакцин.

Розроблені методи застосування препаратів з кореня женьшеню дають мо-жливість спрямовано змінити інфекційну активність вірусів, що запропоновано вико-ристовувати при виробництві противірусних засобів.

Відібрано хімічну речовину (хлороформ), розроблені методи її застосування для інактивації вірусу класичної чуми свиней, що використано при розробці інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней.

В результаті досліджень встановлені оптимальні системи та параметри куль-тивування збудників, патогенних РНК-вмісних вірусів тварин, що допомогло змінити їх біологічні властивості при розробці технологій виготовлення про-тивірусних препаратів.

Результати досліджень використовуються у навчальному процесі у ВУЗ-ах біологічного та ветеринарного профілів при підготовці вірусологів, фахів-ців ветеринарної медицини, біотехнологів.

У технологію виготовлення вакцини проти ротавірусної хвороби свиней закладений штам “К” ротавірусу, який був нами адаптований до чутливих культур клітин при визначених оптимальних параметрах, охарактеризований за морфоло-гією, імуногенні-стю, мутагенною активністю, структурою популяції.

При розробці технології створення та виготовлення інактивованої хлоро-форм-ад’ювант вакцини проти класичної чуми свиней із лапінізованого вірусу ви-користані дослідження біологічних властивостей збудника та його чутливість до різних хімічних речовин, результати з інфекційного мутагенезу вірусу КЧС віруле-нтного та вакцинних штамів (“Ши-Минь”, “Малазія”, “ЛК-ВНДІВВіМ”, лапінізо-ваний штам “К”).

Для поліпшення епізоотичної ситуації в Україні з ротаві-русної хвороби свиней та класичної чуми свиней, запропоновані розроблені і ство-рені вакцини: 1) “Вірусвакцина ліофілізована із штаму “К” проти ротавірусної хво-роби свиней для парентерального застосування”, ТУУ 19024865, термін введення до дії з 1.12.93 р., застосування якої необхідно здійснювати згідно з розробленими нами “Настанови на застосування вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хво-роби свиней для парентерального застосування” та “Інструкції по виготовленню і конт-ролю вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хво-роби свиней для парентерального застосування”, затверджених у 1993р. Державним департаментом ветеринарної медицини України;

2) “Хлороформ-ад’ювант вакцина проти чуми свиней із лапінізованого ві-русу”, ТУУ 15-15/3, термін введення до дії 1.01.93 р. Зразки препарату застосову-вали згідно з розробленими нами “Настанови по застосуванню хлороформ-ад’ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого ві-русу” 1992 р. та “Ін-струкціїї по виготовленню і контролю хлороформ-ад’ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого ві-русу”, затвердженою у 1992 р. Державним де-партаментом ветеринарної медицини України.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто за участю наукових консу-льтантів докторів ветеринарних наук, професорів, член-кор. УААН і РАСГН А.І. Собко та академіка УААН П.П. Фукс обґрунтовано науковий напрям, визначена тематика та програма досліджень, шляхи її вирішення. Самостійно розроблені наукові положення, схеми наукових експериментів, проведені науково-виробничі та лабораторні до-сліди, виконано патентний пошук, проведено аналіз одержаних результатів та їх інтерпретація, аналіз літературних даних, виконано статистичну обробку матеріалів, сформульовано висновки.

Здобувач розробила наукові положення, самостійно виконала весь обсяг методичних та експериментальних ро-біт з виявлення пошкоджуючої дїї патогенних РНК-вмісних вірусів тварин на гене-тичний апарат соматичних клітин тварин in vivo та in vitro (окремого вірусу, так і сумісній дії двох вірусів); по спрямованій зміні інфекційної активності рота-, коро-навірусів, пестивірусу (ВКЧС) свиней дією різних чинників; з індикації та адаптації вірусів у чутливих системах культивування; при застосуванні настою калусної куль-тури кореня женьшеню для змін інфекційних властивостей двох представників родини РНК-вмісних вірусів; з дослі-дження біологічних властивостей та змін у популяції ротавірусу свиней при його взаємодії з популяціями чутливих клітин; з проведення серологічного моніторингу розповсюдження збудника ротавірусної хвороби свиней; з розробки принципів створення та застосування антимутагенних препаратів з використанням природної сировини рослин для зменшення генотоксичної дії при інфекційному му-тагенезі.

Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із старшим нау-ковим співробітником ІВМ, кандидатом медичних наук Л.Г.Купчинським та завідува-чем сектору електронної мікроскопії ІВМ, кандидатом ветеринарних наук І.П.Олексієнко. Дослідження з впливу вірусу лейкозу на стан діля-нок ДНК соматичних клітин великої рогатої худоби виконані за участю аспіранта ІВМ Р.А. Голубця та кандидата біологічних наук Інституту свинарства УААН (м. Полтава), завідувача лабораторією В.М. Балаць-кого.

Автор висловлює щиру подяку професорам, докторам ветеринарних наук В.П. Риженко, Старчеусу А.П., доктору ветеринарних наук, В.А. Прискоці, завідувачам лабораторіями ІВМ, співробітникам лабораторії вірусології ІВМ, лабораторії по розробці технології виготовлення інак-тивованої вакцини проти класичної чуми свиней ІВМ, лабораторії анаеробних ін-фекцій ІВМ за методичну допомогу при виконанні частини експериментальних досліджень, а саме: кандидатам ветеринарних наук Ф.С. Вабіщевичу, І.В. Сидорову, кандидату медичних наук В.Н.Тацькій, кандидату сіль-ськогосподарських наук Є.І.Марчишиній, кандидату хімічних наук Т.М. Таїровій, науковим співробітникам О.В. Макаренко, М.В. Білоусу, Н.М. Буканевій, ветлікарям В.І. Кирилову, В.Ю. Гапусенко, С.С. Сергеєву, інженеру А.І. Горік, всьому технічному персо-налу цих лабораторій, хто допомагав у підготовці до дослідів, а також кандидату біологічних наук В.М.Стефановій Російського інституту генетики та розведення тварин (м. Пушкін, Санкт-Петербург, Росія) за методологічну допомогу у дослідженнях геному клітин свиней.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень за темою дисер-таційної роботи доповідались і обговорювались на засіданнях вченої ради Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (1991–2004), а також на 30 наукових форумах різного рівня, в тому числі:

10-му з’їзді товариства мікробіологів України (м. Одеса, 15–17 вересня 2004 р); IV міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (м. Киів, 27–30 вересня 2004 р.); Міжнародному семінарі з біобезпеки і непоширення для Центральної Азії і Кавказу (м. АлмаАти, Казахстан; 20–21 вересня, 2004 р.); науково-практичному семінарі “Проблеми отримання та використання генетично-модифікованих і клонова-них організмів” (м. Біла Церква, 11 березня 2004 р.); Міжнародному семінарі “Biotehnoloqy, commercialization and security” (м. Ташкент, Узбекистан, 14–17 жовтня 2003 р.); Европейській конференції “4th European Cytogenetics conference“ (Bologna, Italy; September 6–9 2003); Европейській конференції “European Humen Genetics Conference” ( Strasbourq - France; May 25–28, 2002); Міжнародній конфере-нції “ WAСRA EUROPE e.v., XIX International conference long term responsibility for sustainable life” ( BRNO, Czeech Republic, August 7–11 2002); науково-практичній конференції “Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рога-того скота” (м. Володимир, Росія, 27–28 лютого 2002 р.); Міжнародному семінарі “Workshop: GIS emergency preparedness and health reduction” (м. Будапешт, Угор-щина, квітень 2001 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми інфекційної патології тварин”, присвяченої 70-річчю з дня народження член-кор. УААН, РАСГН, проф. А.І. Собко” (смт. Новий Світ, Автономна республіка Крим, Україна, 17–21 вересня 2001 р); Міжнародному семінарі “On Children and Genotoxicity Networks” (м. Копенгаген, Данія, 12–14 січня, 2001р.); Міжнародній конференції “Phytosfere”- 99/ Nighlights in European Plant Biotehnology research tehnoloqy transfer” (Rome, Italy, June 7–9 1999); Міжнародній конференції “ Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных”, присвяченої 100-річчю з дня народження В.Т. Котова (м. Воронеж, Росія, 19–21 травня, 1999 р.); Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (м. Одеса-Київ, жовтень 1998 р.); II міжнародній конференції “Біоресурси і віруси” (м. Київ, 7–10 вересня 1998 р.); Міжнародній конференції “15th International Conference of WACRA –EUROPE e.v. environmental Management in Statas with loastal Problems: Through research, education and leadership to sustainable developmtnt” (Riga, Latvia, July 8–12 1998); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветери-нарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва” (м. Львів, 9–11 жовтня 1997 р.); Міжнародному семінарі “IFAC International Federation of Automatic Control.Mathematical and control application in agriculture and horticulture” (м. Ганновер, Німеччина, 28 вересня – 2 жовтня 1997 р.); конференції “Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (м. Володимир, Росія, 27–31 жовтня 1997 р.); Міжнародному симпозіумі “YIII Simpozium of the international society for veterinary epidemiology and economics” (м. Париж, Франція; 1997 р.); Міжнародній конференції “First European cytogenetics conference” (м. Афіни, Греція; 1997 р..); конференції “ Биология и культивирование вируса КЧС” (м. Москва-Покров, Росія, 1996 р.); Міжнародному симпозіумі “The third ESVV Simposium of pestivirus infection” (м. Лелістад, Нідерланди, 19–20 вересня 1996 р.); Всесвітньому конгресі “ХХ1 World Congress of Small Animal Veterinary Association “ (м. Єрусалим, Ізраїль, 20–23 жовтня 1996 р.); науково-практичній конференції ВНІІВВіМ “Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики” (м. Покров, Росія, 1995 р.); Міжнародній науковій конференції “Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы” (м. Харків, 20–25 вересня 1995 р.); Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (м. Львів, 1994 р.); Українській конференції “Сучасні проблеми ве-теринарної медицини” (м. Київ, 1994 р.); Міжнародному симпозіумі “Молекуляр-ная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с/х животных” (м. Санкт-Петербург – Пушкін, Росія, 24–25 травня 1994 р.).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в 64 науко-вих працях, із них: у 28 наукових статтях, опублікованих у фахових наукових ви-даннях, затверджених переліком ВАК України (18 із них написані одноосібно), у 4 деклараційних патентах на винаходи, та у 24 матеріалах симпозіумів та конферен-цій, з яких 14 – у закордонних.

Матеріали дисертаційної роботи увійшли до затверждених заключних восьми наукових звітів державних науково-дослідних робіт : ДКНТ № 290 (1988–1992), ДКНТ № 03.06/007-92 (1992–1996), № 01.04 (1993–1996), № 0197U012751 (1996–1998), № 0197U012749 (1996–1998), № 0201U001345 (1996–2000), № 0197U012747 (1996–2000), N 0101U00871 (2001–2004).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу; огляду літератури; вибору напрямків досліджень, матеріалів і методів виконання роботи, результатів експериментальних досліджень; аналізу і узагальнення, висновків, пропозицій для практики, списку використаних джерел і додатків. Робота викладена на 415 сторінках компґютерного тексту і вміщує 19 таблиць та 54 рисунки. Список літератури включає 788 джерел, у тому числі 449 іноземних. До додатків увійшли: акти виробничих випробувань, паспорти на штами вірусів, методичні рекомендації, технічні умови, настанови, інструкції з виготовлення і застосування вакцин, патенти та інші документи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ

Дисертаційна робота виконана упродовж 1991-2006 років. Експериментальна частина роботи, апробація та виробнича перевірка результатів досліджень була проведена в Інституті ветеринарної медицини УААН: в лабораторії вірусології, лабораторії по розробці технології виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней, секторі по вивченню генетичної резистентності тварин, Державному науково-виробничому підприємстві “Біоветпрепарат”, тваринницьких господарствах Молдови, Вірменії, Північно-Осетинської Республіки та України (Одеської, Херсонської, Дніпропетровської, Луганської, Донецької, Львівської, Вінницької, Івано-Франківської, Тернопольської, Черкаської, Київської областей) .

Матеріалом для досліджень слугували проби органів і тканин хворих, інфікованих (РНК-вмісними вірусами) збудниками хвороб, забитих з діагностичною метою та контрольних тварин різних вікових груп свиней (тонкий відділ кишечника, печінка, нирки, легені, серце, селезінка, кров, фекалії, лімфовузли, мигдалики, кістковий мозок грудної кістки). Проби крові використовували для серологічних, імунологічних досліджень, отримання культур лімфоцитів. Визначення імуноглобулінів в крові свиней досліджували методом імунодифузії в гелі (Mancini G.J. et all., 1963; Тихомірова О.А., 1977). Вірусовиділення, культивування, атенуацію, титрування вірусів, реакції нейтралізації, дифузійної преципітації здійснено, застосовуючи загальноприйняті методи (Сюрін В.М.,Фоміна Н.В., 1979; Лярські З., 1980). При культивуванні і титруванні вірусу класичної чуми свиней використовували метод прямої і непрямої імунофлуоресценції із застосуванням ФІТЦ-імуноглобулінів до вірусу КЧС у відображенному синьому світлі на люмінісцентних мі-кроскопах різних марок (МЛ-1, МЛ-3, МЛ-4, МЛД-1, ЛЮМАМ та інші) із збуджую-чими світлофільтрами ФС-1-2, СС-І5-2, БС-8-2, (СЕС-14) і замикаючим №1 або №2 (Ж-18, ЛС-1). Реакцію імунодифузії проводили згідно “Наставления по применению наборов для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота” (затвердженого Департаментом ветеринарії Мінсільхозпроду РФ, 1997). Використанні первинно-трипсинизовані та перещеплювані культури клітин (КК) тестикулів, нирок, щитовидної залози (СН, СНЕВ, СНЕВ-М, ПСН, ПТП, КЩС, РК-15), лімфоцитів поросят, вирощених за “Методичними вказівками…” ІВМ (розробленими: Субаєвим Г.Х., 1981 та Жуковським А.М. із співробітниками, 1987).

Використані тварини : 479 кролів породи шиншила масою 2,5 – 3 кг, 80 кроленят 1-3- добового віку, 739 голів свиней (поросята-гнотобіоти, безмолозивні неімунні поросята, 3-5- місячні підсвинки, живою масою тіла в межах 35-70 кг, свиноматки), 20 голів великої рогатої худоби чорно-рябої породи віком 2-2,5 роки живою масою тіла в межах 300-350 кг. Свиней інфікували вірусумісними рідинами (вільними від бактеріального забруднення) у відповідних дозах. При постановці біопроб на поросятах-гнотобіотах використовували стерильний корм та створювали особливі умови для попередження потрапляння сторонніх мікроорганізмів. Дослідні і контрольні тварини, утримували в однакових умовах, виключаючи можливість контакту. При необхідності створювали додатково групу контактуючих тварин.Перевірку вірусів на патогенність і реверсибельність здійснювали на поросятах-гнотобіотах із щоденним клінічним оглядом і термометрією, відбором дослідного матеріалу.

Специфічні імунні сироватки до досліджуваних референтних, вакцинних і епізоотичних штамів РНК-вмісних вірусів свиней отримували від клінічно здорових кролів та підсвинків 3-5 -місячного віку. Для виявлення свіжих випадків захворювання тварин в господарствах використовували дослідження зразків парних сироваток крові (відібраних перший раз через 4-5 днів після прояву перших симптомів хвороби, другий- через 14 днів). Серологічні дослідження з виявлення підвищення титрів антитіл до збудників проводили паралельно з обома сироватками в однакових умовах в реакції нейтралізації.

Для роботи використані штами РНК - вмісних вірусів тварин: - ентеровірусів свиней (родини Picornaviridae, роду Enterovirus) - референтні штами, які викликають синдром SMEDI, одержані з колекції патогенних мікроорганізмів тварин Ветеринарного науково-дослідного інституту м.Брно (Чехія), люб’язно передані для дослідження, з відповідними паспортами, провідним науковим співробітником лабораторії вірусології ІВМ, к.м.н. В.Н. Тацькою: - штам “PS 34” / CAPM v-305/, серотип 1(SMEDI C);- штам “02 b“/ CAPM v-248/,серотип 3 (SMEDI B);- штам “PS 37” / CAPM v-251/,серотип 6 (SMEDI E);- штам “PS 27” / CAPM v-252/, серотип 8 (SMEDI A ). Ці штами були адаптовані до перещеплюваних культур клітин СН , СНЕВ, ПСН (до 31 пасажу) з титром інфекційності 5,5 -7,5 lg ТЦД 50 / смі , (штами із відповідними паспортами);

-

-

- пестівірусу класичної чуми свиней (родини Flaviviridae, роду Pestivirus): - вакцинні штами “ЛК-ВНДІВВІМ”, лапінізований штам “К”, “Малазія”, вірулентний - ”Ши-Минь”, передані для досліджень завідуючим лабораторією по розробці технології виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней ІВМ, д.в.н. В.А. Прискокою. Зразки лапінізованого штаму “К” вірусу КЧС отримували і із Сумської біологічної фабрики з титром інфекційності 104 ІД50/ см3 , “ЛК-ВНДІВВіМ” - із ліофілізованої вакцини Покровського заводу біопрепаратів серій № 15 та № 95).

При встановленні структури популяції ротавірусу свиней за S-ознакою досліджено і проаналізовано 6711 негативних колоній ротавірусу під агаровим покриттям (за методом Ysiung G.D. i Melnick J.L., 1957). Стійкість вірусів до дії жиророзчинників визначали обробкою вірусумісних рідин 5 %-вим розчином хороформу.

Дослідження морфологічної структури вірусів тварин, їх морфогенезу в інфікованих клітинах, виявлення вірусів в пробах патологічного матеріалу від тварин та виділених з культур клітин проводили, застосовуючи методи електронномікроскопічних досліджень: прямої електронної мікроскопії, негативного контрастування із використанням 2-4 % -го розчину фосфорно-вольфрамової кислоти, 2-4 %-го розчину молібденовокислого амонію, 0,5 - 1 %-го розчину уранілацетету.

При вирощуванні біомаси калусної культури кореня женьшеню за основу брали виготовлення поживного середовища (Т. Murashige, F. Skoog, 1962) з використанням наступних етапів: приготування маточних розчинів солей № 1 та № 2, хелату заліза, альфа-нафтилоцтової кислоти, тіамінхлориду, кінетину; приготування наважок мезоінозиту, гідролізату казеїну, сахарози; приготування агарового гелю; формування остаточного варіанту поживного середовища.

Вивчення спадкового апарату клітин свиней проводили із застосуванням цитогенетичних методів досліджень метафазних пластинок хромосом клітин тварин (по 200 на одне дослідження) за методами (Moorhead P.S. et all., 1960; Дарлінгтон С.Д., Кур Л.Ф.,1980; Яковлев О.Ф., 1981; Макгрегор Г., Варлі Д., 1986). Всього проаналізовано 7150 метафазних пластинок хромосом соматичних клітин свиней. Полімеразну ланцюгову реакцію виконували згідно прийнятих методів (K.Mullis, F.Faloona F., 1987; L.A.Donehower, 1990; A.Limansky, O.Limanskaya, 2002). Використані водні екстракти рослин: Rosmarinum officinalis L., (Lamiaceae), Angelica silvestris L. (Apiaceae), Brassica oleracea: Broccoli (Brassicaceae), Hyppophae rhamnoides (Elaeagnaceae), Panax radix ( Araliaceae), приготовані за відомими прописами фармакологічних довідників.

Бактерицидну і лізоцимну активності сироватки крові визначали за методами, описаними О.О. Смірновою, Т.А. Кузьміною, 1966; В.Е. Чумаченко та ін., 1990. Статистична обробка результатів – за методом Стьюдента, Д.У.Стедекора, 1961; Г.Ф.Лакіна, 1980.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Виділення та індикація РНК-вмісних вірусів тварин-збудників інфекційних хвороб

В результаті комплексу досліджень із застосуванням біопроб на поросятах-гнотобіотах та безмолозивних одноденних поросятах, електронної мікроскопії, серологічної діагностики виявлено наявність збудників: рота- та коронавірусів свиней в пробах матеріалів від інфікованих, хворих і загиблих свиней при спалахах вірусних гастроентеритів в господарствах України, Вірменії, Молдови. Виділені віруси представлені: на рис.1 - польовий ізолят ротавірусу свиней, виділений з фекалій хворих тварин радгоспу “Заря” Любашівського району Одеської області; на рис.2 – коронавірусні часточки, виділені від поросят-гнотобіотів з біопроби; на рис.3 - польовий ізолят вірусу ТГС, виділений від поросят Советошинської свинофабрики (Вірменія). Встановлено, що взаємодія вірусів і чутливих клітин відбувалась постадійно. Кожна