імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ПАЛАГЕЧА РОМАН МИКОЛАЙОВИЧ

УДК: 581. 84: 581.1: 582.677

СТРУКТУРНО – ФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ ЗИМОСТІЙКОСТІ ДЕЯКИХ ВИДІВ РОДУ MAGNOLIA L.

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2006

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі фізіології та екології рослин біологічного факультету та у Ботанічному саду ім. акад. О.В. Фоміна Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Таран Наталія Юріївна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

завідуюча науково-дослідної лабораторії фізіологічних

основ продуктивності рослин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Силаєва Алла Михайлівна,

Інститут садівництва УААН,

головний науковий співробітник

лабораторії фізіології рослин

кандидат біологічних наук,

Мартин Геннадій Ігнатович,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,

старший науковий співробітник відділу фітогормонології

Провідна установа: Національний Ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 27 лютого 2006 р. о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 27 січня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збереження генофонду рослинного світу, особливо реліктової флори, є одним із пріоритетних напрямків сучасного етапу розвитку людської цивілізації. Під час інтродукції рослин важливо прогнозувати успішність цього процесу, особливо для таких екзотів, як магнолії — найдавніші квіткові рослини (Тахтаджян, 1966). У наш час залишились лише невеликі природні ареали магнолій у Східній та Південно-Східній Азії, на південному сході Північної Америки та в Центральній Америці. Це — переважно субтропічні рослини, хоча деякі листопадні види можуть витримувати низькі температури (Коршук, 2004; Петухова, 2003; Sponberg,1998).

Найчутливішими до температурних коливань, особливо в зимово-весняний період, є однорічні пагони магнолій, про що свідчить утворення морозобоїн та зимове висихання пагонів. Отже, для успішної інтродукції магнолії в помірних кліматичних умовах Лісостепу і Полісся України, де головним лімітуючим чинником є саме низькі температури взимку та весняні приморозки, слід добирати види, здатні перебудовувати свої фізіологічні процеси у напрямку підвищення холодостійкості, що сприяє виживанню інтродуцентів у нових умовах існування.

Актуальність дослідження зимостійкості деревних порід зумовлена не лише великими збитками, що їх завдають господарству різноманітні фактори зимівлі, але й недостатністю вивченості фізіологічних та біохімічних механізмів стійкості багаторічних рослин до несприятливих чинників навколишнього середовища.

Дослідження анатомічної будови, фізіологічних та біохімічних пристосувань різних тканин пагонів до дії низьких температур передбачає скринінг стійких видів магнолій для культивування у нових кліматичних умовах. В Україні протягом багатьох років проводяться ботанічні та фізіологічні дослідження магнолій (Минченко, Коршук, 1987; Григоренко, Головня та ін., 2000). Однак інформація про стійкість магнолій до кліматичних факторів Лісостепу та Полісся України неповна, що потребує детального комплексного дослідження. У світовій практиці більшість робіт спрямовано на вивчення ботанічних характеристик представників даного роду (Callaway, 1994; Nooteboom, 1998; Lin, 1998; Петухова, 2003

З’ясування особливостей фізіологічних й біохімічних процесів та формування анатомічних структур пагонів дасть змогу встановити рівень зимостійкості магнолій у нових кліматичних умовах з метою поширення декоративних екзотів в озелененні міст нашої країни.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною наукових тем Ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Збереження інтродукованого та аборигенного різноманіття рослин в умовах культури” (№ ДР 010U002470) й кафедри фізіології та екології рослин “Адаптивні реакції рослин в системі моніторингу агро- та фітоценозів за умов дії факторів довкілля та антропогенного забруднення” (р/№ 0101U003581).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати особливості внутрішньовидових анатомо-морфологічних, фізіологічних та біохімічних механізмів пристосування пагонів листопадних магнолій в зв’язку з їх інтродукцією у кліматичних умовах Полісся та Лісостепу України.

Для досягнення поставленої мети було визначено наступні завдання:

·

·

·

·

·

·

Об’єкт дослідження — Зимостійкість листопадних магнолій при інтродукції у більш холодних (порівняно з їх природним ареалом) умовах.

Предмет дослідження — Особливості анатомо-морфологічних та фізіологічних адаптаційних пристосувань пагонів магнолій при інтродукції у зоні Полісся та Лісостепу України.

Методи дослідження — люмінесцентна та світлова мікроскопія, гістохімічні методи; диференційний термічний аналіз; тонкошарова хроматографія, спектрофотометрія та денситометрія; статистичний аналіз та математична обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для десяти видів листопадних магнолій встановлено взаємозв’язки між структурно-функціональними перебудовами пагонів та зимостійкістю інтродукованих рослин. Виявлено, що секреторні сполуки у вакуолях клітин та в ідіобластах містяться переважно у паренхімі кори, а у деяких видів — і у серцевині пагонів. Ці сполуки також накопичуються у зоні механічних руйнувань кори та під сочевичками, що в сукупності створює надійну систему біохімічного захисту нижче розташованих тканин у найбільш вразливих ділянках пагонів. Показано, що кількість води у пагонах різних видів магнолій та їхня водоутримуюча здатність у зимово-весняний період залежать від рівня сформованості покривних тканин пагонів, а саме: товщини кутикули, кількості шарів фелеми, рівня виповнення сочевичок та їх кількості. З’ясовано, що невеликі амплітуди тепловиділення в результаті заморожування пагонів у найменш зимостійких видів пов’язані відповідно із найменшою кількістю води у тканинах пагонів, що може призвести до зимового висихання та загибелі останніх. Визначено, що особливості формування анатомічних структур пагонів можуть слугувати важливою систематичною ознакою, на основі якої можна ідентифікувати вид магнолії ще на ранніх етапах морфогенезу, оскільки ці рослини входять у генеративну фазу на 8—28 рік. Вперше досліджено сезонну динаміку вмісту біохімічних сполук (флавоноїдів та ліпідів), що суттєво впливають на процеси морозо- і зимостійкості інтродуцентів. Встановлено залежність між зниженням температури навколишнього середовища і сезонним накопиченням ліпідних та флавоноїдних сполук.

Практичне значення одержаних результатів. Визначено особливості формування покривних, паренхімних, механічних та запасаючих тканин пагонів контрастних за зимостійкістю видів магнолій, дані про яких можуть бути використані для оцінки зимостійкості рослин в умовах інтродукції. На основі системного фізіологічного та біохімічного аналізу адаптаційних реакцій пагонів магнолій за умов низькотемпературного стресу рекомендовано нові надійні маркери (формування покривних тканин пагонів, проморожування пагонів для встановлення рівня морозостійкості різних за фізіологічною значимістю тканин, дослідження рівня морозостійкості методом диференційного термічного аналізу, вміст біохімічних сполук — флавоноїдів та ліпідів) для прогнозування зимостійкості декоративних екзотів — магнолій. Встановлено також, що пагони різних видів магнолій суттєво відрізняються за анатомічною будовою тканин, що може слугувати діагностичним критерієм для ідентифікації видів. Результати досліджень можуть бути використані у науково-дослідній і навчальній роботі. Досліджені види доповнюють асортимент високодекоративних гарноквітучих рослин для створення зелених зон та рекреаційних насаджень.

Особистий внесок здобувача. Розробку програми досліджень й основної гіпотези виконано спільно з проф. О.В. Брайоном та науковим керівником — д.б.н. Н.Ю. Таран. Здобувач особисто опрацював численну літературу; самостійно оволодів відомими методиками досліджень та модифікував деякі з них до завдань дисертаційної роботи; планував та проводив експерименти, підготував матеріали до друку. Експериментальні дані, висновки та узагальнення опрацьовано здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати, викладені у дисертації, доповідались на XI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001); міжнародній конференції “Роль ботанічних садів в зеленому будівництві міст, курортних та рекреаційних зон” (Одеса, 2002); міжнародній конференції “Сучасні проблеми інтродукції рослин та збереження біорізноманіття екосистем” (Чернівці, 2002); науковій конференції “Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно-змінених територіях” (Кривий ріг, 2002); на XXXII та XXXIIІ щорічній міжнародній конференції “European society for new methods in agricultural research” (Warsaw, Poland, 2002 та Viterbo, Italy, 2003); II міжнародній конференції з анатомії і морфології рослин (Санкт-Петербург, Россия, 2002); IV міжнародній науковій конференції “Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” (Донецьк, 2003); на ІІІ міжнародній науковій конференції “Биологическое разнообразие. Интродукция растений” (Санкт-Петербург, Россия, 2003); на ІІІ міжнародній конференції “Растения в мусонном климате” (Владивосток, Россия, 2003); на ІІ міжнародному симпозіумі “Рlant health in urban horticulture” (Berlin, Germany, 2003); ІІ міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 19 праць, з них 7 статей в періодичних наукових спеціальних виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України.

Структура і обсяг роботи. Дисертація містить 183 сторінки друкованого тексту і складається зі вступу, 5 розділів, заключної частини, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 78 рисунками, містить 7 таблиць та 1 додаток. Список використаних джерел включає 238 найменувань, у тому числі 79 праць іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У огляді літератури проаналізовано сучасні уявлення про поширення, біоекологічні, анатомо-морфологічні, фізіологічні, біохімічні властивості й декоративну цінність реліктових рослин, представників роду Magnolia L.; розглянуто структурно-функціональні параметри пагонів (формування покривних та механічних тканин пагонів, секреторних вмістищ у паренхімі кори та серцевині пагонів, водообмін, динаміка накопичення вторинних метаболітів —флавоноїдів та основних складових клітинних мембран — ліпідів), котрі є важливими показниками для визначення рівня зимостійкості інтродуцентів у кліматичних умовах Лісостепу та Полісся України.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведено протягом 2000—2005 рр. на рослинах листопадних магнолій, що ростуть у природних умовах на території Ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Досліджували однорічні пагони (як найбільш вразливі органи деяких магнолій у суворі зими) десяти видів та одного гібриду (M. soulangiana ’Alexandrina’) роду Magnolia L., що належать до п’яти секцій за систематикою Дж. Денді (Dandy, 1971). Секція Buergeria (Sieb. et Zucc.) Dandy: M. kobus Sarg. var. borealis, M. salicifolia (Sieb. et Zucc.) Maxim., M. stellata (Sieb. et Zucc.) Maxim. Секція Tulipastrum (Spach) Dandy: M. acuminata L., M. liliflora Desr. Секція Rytidospermum Spach: M. obovata Thunb., M. officinalis Rehd. et Wils., M. tripetala L. Секція Yulania (Spach) Dandy: M. denudata Desr. Секція Oyama Nakai: M. sieboldii K. Koch.

Для анатомічних досліджень органів і тканин зазначених рослин використовували метод флуоресцентної мікроскопії (Брайон, 1973). Визначення рівня лігніфікації клітинних оболонок деревини та сезонної динаміки крохмалю у тканинах пагонів магнолій визначали за методикою Барської Є.О. (1967). Гістохімічні дослідження ліпідів проводили за методикою Конарева В.Г. (1966).

Потенційну і ситуативну морозостійкість вивчали на базі відділу фізіології та біотехнологічних досліджень Інституту садівництва УААН після проморожування в холодильній камері “Frigera”. Мікроскопічну оцінку інтенсивності побуріння окремих тканин на поперечних зрізах пагонів проводили за 6-бальною шкалою, запропонованою Соловйовою М.О. (1982), у модифікації (Палагеча, Грохольський, та ін., 2005). Досліди виконували в період спокою рослин (грудень – лютий). Швидкість зниження температури в камері “Frigera” становила 5 о/год. Тривалість проморожування при кожній із температур (–25, –30, –35 оС) становила 4—6 год. Модифікація за Грохольським полягає у присвоєнні емпіричних коефіцієнтів тканинам (враховуючи фізіологічну нерівноцінність у життєдіяльності і регенераційній здатності тканин), для кори — 6, камбію (найважливішої тканини) — 8, деревини — 4, серцевини — 2. Сума всіх коефіцієнтів дорівнює 20, що при перемноженні на вищий бал пошкодження окремої тканини (5,0) становить 100 балів. Таким чином, за умов повного пошкодження всіх тканин, констатується 100 % - ва загибель об’єкта.

Втрату води пагонами визначали ваговим способом за методикою Гусєва (1962); процеси льодоутворення у тканинах пагонів магнолій – за методикою Китаєва (2003); скринінг, виділення, ідентифікацію та визначення динаміки флавоноїдів здійснювали за методикою, розробленою Санкт-Перербурзькою хіміко-фармакологічною академією (2000).

Екстракцію, розділення і кількісне визначення ліпідів у корі пагонів проводили за методом Зілла та Хармона (Zill, Harmon, 1962) у модифікації Яковенко та Міхно (1971). Розділення ліпідів на фракції здійснювали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на силікагелі. Кількісний аналіз ліпідів проводили шляхом денситометрування за калібрами відповідних речовин (Yamomoto, 1980). Кількісний вміст сульфоліпіду визначали за методикою Кіна Kean, 1968 спектрофотометричним способом. Статистичну обробку даних проводили за допомогою програм “Excel 7.0” і “Statistica 5.0”. Достовірність різниці між варіантами оцінювали за критерієм Стьюдента при рівні значущості P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Вплив зимових умов на особливості формування покривних тканин у однорічних пагонах магнолій.

Проведені нами фенологічні спостереження за магноліями у осінньо-зимовий період виявили зовнішні пошкодження однорічних пагонів. Зокрема, у суворі зими спостерігали утворення морозобоїн на однорічних приростах деяких видів магнолій або ж відбувалося зимове висихання пагонів видів з низькою зимостійкістю (M. liliflora, М. stellata) (Палагеча, Грохольський, 2005). Дослідження анатомічної будови пагонів магнолій методом люмінесцентної мікроскопії характеризує структурно-функціональний стан рослини, що дає змогу з’ясувати рівень пристосувальних механізмів контрастних за зимостійкістю видів листопадних магнолій. Застосування цього методу дало нам можливість встановити, що у зимостійких видів магнолій (M. kobus, M. acuminata, M. obovata, M. officinalis, M. tripetala) найкраще сформованою є покривна тканина пагонів, а саме: товщина кутикули сягає 10—15 мкм, перидерма — багатошарова (включає 4—6 шарів фелеми), а кількість сочевичок — найменша серед досліджених видів (9—35/10 см2 поверхні пагонів) (табл.1).

Виняток становить не менш морозостійкий вид M. salicifolia, в пагонах якої перидерма відсутня, натомість наявна гомогенна досить товста кутикула (28 мкм), котра, певним чином, заміщує функції корка, та запобігає надмірному випаровуванню води пагонами. Наявність великої кількості сочевичок (103/10 см2 поверхні пагонів) зумовлено, на нашу думку, необхідністю у активнішому газообміні в результаті формування товстого шару кутикули, через яку процес газообміну майже не відбувається.

Таблиця 1

Анатомо-морфологічні параметри тканин однорічних пагонів досліджуваних видів листопадних магнолій

№ | Вид магнолії | Товщина кутикули, мкм | Кїлькість шарів фелеми, шт. | Кількість сочевичок на 10 см2 поверхні пагона, шт. | Діаметр пагона, мм | Зимостійкі види

1 | M. acuminata | 12 | 2—4 | 35 | 5 | 2 | M. salicifolia | 28 | відсутня | 103 | 3 | 3 | M. kobus | 15 | 2—4 | 31 | 4 | 4 | M. tripetala | 15 | 4—6 | 9 | 8 | 5 | M. obovata | 10 | 4—6 | 30 | 11 | 6 | M. officinalis | 9—10 | 4 | 29 | 9 | Середньозимостійкі види

7 | M. denudata | 8—9 | 4—6 | 69 | 6 | 8 | M. sieboldii | 12 | 4 | 45 | 3—4 | 9 | M. soulangiana | 14 | 2—3 | 66 | 5 | Найменш зимостійкі види

10 | M. stellata | 10 | 4 | 44 | 3 | 11 | M. liliflora | 10 | 1—2 | 71 | 4 | НСР | 0,05 | 0,03 | 0,05 | 0,04 |

У середньостійких видів M. denudata, M. sieboldii наявні інші особливості формування покривно-захисних структур. Для першого виду характерною ознакою є формування великої кількості сочевичок (69/10 см2 поверхні пагонів) із яскраво флуоресціюючим сочевичним фелогеном, внаслідок просякнення його оболонок кутином та суберином, що створює додатковий захист від надмірного випаровування води. На поверхні пагона M. sieboldii сочевичок небагато (45/10 см2 поверхні пагонів), натомість вони нещільно запаковані. Перидерма багатошарова, проте кутикула (12 мкм) переривчаста, що зменшує шанси на успішну зимівлю в умовах низькотемпературного стресу. Виявлено, що рівень заповнення виповнювальними клітинами сочевичок певним чином узгоджується із щільністю їх розміщення. Якщо сочевички пагонів M. kobus нещільно заповнені виповнювальними клітинами (рис. 1), то їхня кількість відносно невелика (31/10 см2 поверхні пагонів).

Приблизно така сама щільність розміщення сочевичок у найморозостійкішого виду M. acuminata (35/10 см2). Слабко зимостійкі види M. stellata та M. liliflora мають видоспецифічні відмінності у формуванні захисних шарів. У першого виду розвиненою є багатошарова перидерма (4 шари фелеми), що додатково захищена шаром відмерлої епідерми, однак пагони мають кутикулу переривчастого типу (кількість сочевичок 44/10 см2 поверхні пагонів), що робить їх вразливішими до несприятливих умов навколишнього середовища.

Найменш зимостійким видом є M. liliflora, пагони якої вкриває лише один, рідше два шари фелеми. Товщина кутикули типова для однорічних пагонів магнолій (10 мкм). Велика кількість сочевичок (71/10 см2), із великою площею розриву поверхневих шарів і нещільним заповненням може спричинити утворення морозобоїн та зимового висихання однорічних пагонів.

Таким чином, анатомічний та морфологічний аналіз однорічних пагонів різних за зимостійкістю видів магнолії дозволяє виділити специфічні структурні пристосування для перенесення рослинами низьких температур та інших несприятливих погодних умов у кліматичних умовах Києва.

2. Характеристика механічних тканин кори пагонів магнолій як пристосувальна ознака до осінньо-зимових умов регіону інтродукції. На поперечних зрізах товстіших пагонів M. obovata, M. officinalis, M. tripetala та М. denudata (від 6 до 11 мм у діаметрі) (рис. 2) вперше встановлено додаткову арматурну структуру у вигляді суцільного шару склерифікованих елементів субепідермального розміщення. Цей шар своєрідних товстостінних клітин з лігніфікованими оболонками, що характеризується яскраво-зеленою флуоресценцією, додатково зміцнює каркас товстіших пагонів. У інших досліджуваних видів такий шар клітин відсутній. Стереом кори однорічних пагонів складається із волокон та склереїд.

Виділено три типи його будови: 1) стереом, представлений групами луб’яних тяжів та розміщеними між ними склереїдами; у паренхімі кори склереїд набагато менше, ніж в зоні лубу (M. kobus, M. acuminata, M. salicifolia); 2) поряд із групами волокон, що контактують зі склереїдами, у паренхімі кори є згруповані та поодинокі склереїди (M. denudata, M. stellata); 3) стереом, представлений твердим лубом, склереїдами, що розміщені в паренхімі кори та між луб’яними волокнами (M. оbovata, M. officinalis, M. tripetala). Додатковою ознакою механічних тканин пагонів є склеренхімний шар клітин субепідермального розташування в пагонах більшої товщини (див. рис. 2). Такий шар клітин за місцем розташування є подібним до коленхіми, оскільки вона майже завжди міститься на периферії органа і утворюється раніше, ніж інші механічні тканини. Однак зелена флуоресценція потовщених оболонок клітин, а також флороглюцинова реакція свідчать про лігніфікацію клітинних оболонок, а отже, це — мертві склеренхімні клітини. Як вказує Езау К. (1980), у старих частинах рослини коленхіма може перетворюватись у склеренхіму шляхом утворення вторинних здерев’янілих оболонок.

Встановлено, що найменша кількість механічних тканин розміщена у корі пагонів M. kobus. Пагони цього виду відзначаються більшою ламкістю під вагою снігового покриву або ж льодової кірки і є чутливішими до механічних ушкоджень, що може бути додатковою причиною загибелі і пошкодження пагонів та гілок у особливо суворі зими. Відзначено, що магнолії із товстішими пагонами виробили додаткові механічні структури для кращої їх міцності. Їхні пагони більш пружні і не відзначаються ламкістю за дії незначного сезонного фізичного навантаження на них.

Таким чином, особливості формування механічних тканин суттєво впливають на зимостійкість магнолій.

3. Особливості накопичення вторинних метаболітів у пагонах магнолій. Досліджуючи особливості формування запасаючих тканин та клітин, ми виявили велику кількість секреторних вмістищ, переважно у корі пагонів (10—20 клітин у полі зору мікроскопа за збільшення об’єктива Ч20), що мають специфічний колір флуоресценції (від яскраво-жовтого до жовто-зеленуватого). Жовто-зелене світіння клітин, за даними Брайона О.В. (1973), зумовлене накопиченням у них продуктів як фенольної, так і терпеноїдної природи. Секреторні вмістища з характерною жовтою флуоресценцією схожі на масляні резервуари. Вони також зосереджені у зоні механічних руйнувань кори та під сочевичкою. Таким чином, вони можуть виконувати роль хімічного бар’єра на шляху можливого проникнення патогенних організмів. Ще більшу кількість секреторних вмістищ ми спостерігали на тангентальних зрізах кори. В цьому випадку вони мали вигляд кулястих клітин, приблизно однакових за розмірами. Наявність секреторних структур з яскраво-жовтою флуоресценцією у клітинах серцевини пагонів є характерною ознакою лише для трьох видів (M. obovata, M. officinalis та M. tripetala) із досліджених десяти. Ці види відрізняються пізнішим виходом зі стану спокою навесні та деякими анатомічними особливостями (пориста серцевина із великими клітинами). Накопичуючись субепідермально, фенольні сполуки долучаються до захисту покривних тканин у разі екстремальних умов навколишнього середовища. Велика кількість клітин із інтенсивно флуоресціюючою оболонкою накопичується також у зоні механічних пошкоджень. У такій зоні пагону відбувається прискорений процес коркоутворення, активація процесу поділу клітин з інтенсивною їх суберинізацією, а також насиченням оболонок залишками клітинного вмісту (в першу чергу продуктами метаболізму флавоноїдних речовин), утворення раневої перидерми. Такий захист на структурно-функціональному рівні має місце і при зимових пошкодженнях однорічних пагонів.

4. Гістохімічні дослідження морозостійкості тканин пагонів магнолій. Гістохімічний аналіз визрівання деревини у пагонах магнолій восени показав сильну флороглюцинову реакцію клітинних оболонок добре диференційованої деревини, серцевинних променів, камбію і перимедулярної зони. Яскраво-червоного кольору набули клітинні стінки виповнювальних клітин у сочевичці та під нею (сочевичний фелоген), тяжі первинного та вторинного лубу, клітини-склереїди. У пагонів M. obovata, M. tripetala, M. officinalis та M. denudata відзначено інтенсивну флороглюцинову реакцію склеренхімного шару клітин, а також клітин із секреторним вмістом.

Локалізацію крохмалю в тканинах пагонів виявляли гістохімічно за допомогою розчину Люголя. Значне накопичення крохмальних зерен восени (вересень—жовтень) зафіксували у паренхімі кори, серцевинних променях та перимедулярній зоні (5 балів). У зимовий період (грудень—лютий) крохмальні зерна виявили вже у невеликих кількостях (1—2 бали) у серцевинних променях та в перимедулярній зоні. Це характерно для усіх досліджених видів. Зосередження крохмальних зерен спостерігали також в зоні механічних пошкоджень кори та під сочевичками, поява яких може бути специфічною реакцією паренхімних клітин кори на кращі умови аерації та безпосередню дію інших зовнішніх чинників. Тому можна говорити про індукований синтез крохмалю в місцях, які безпосередньо контактують з навколишнім середовищем. Порівняння наших та літературних даних (Васильєв, 1956; Эзау, 1980; Souter, 1994; Григоренко та ін, 2000 та ін.) про накопичення крохмалю в тканинах деревних рослин восени та перетворення його в холодну пору року в цукри, жири, геміцелюлози та інші сполуки (глікозиди, смоли та ін.), свідчить, що всі ці перетворення мають безпосереднє відношення до процесу морозостійкості рослин.

Цитохімічним методом також було виявлено локалізацію ліпідних сполук в окремих клітинах, клітинних стінках, групах клітин і тканин. У пагонах більшості видів зафіксували накопичення ліпідних сполук у оболонках клітин фелеми (корку), камбіальному шарі клітин, а також у секреторних вмістищах, що розташовані у паренхімі кори, а для деяких — і у серцевинній паренхімі.

5. Визначення порівняльної морозостійкості окремих тканин однорічних пагонів магнолій методом лабораторного проморожування. Цей метод дозволяє оцінювати морозостійкість тканин за об’єктивними ознаками пошкодження – побурінням (некрозом) окремих клітин або груп клітин у тканинах, при дії низьких температур (-25, -30, -35 0С). Мікроскопічну оцінку рівня морозостійкості тканин за цим методом здійснювали за бальною шкалою (див. стор. 4) В результаті проморожування при температурі –25 0С проявилась специфічність у рівні пошкодження тканин даним стресором. Зокрема, тканини верхівок пагонів M. salicifolia виявились чутливими до дії морозу (рис. 3 А). Індекс пошкодження тканин кори становив 6,6 балів (із можливих 30 балів), камбію - 5,6 (із 40), деревини – 6 (із 20), серцевини – 3,2 (із 10). Сумарний індекс пошкодження верхівок пагонів становив – 21,4 бали за 100-бальною шкалою, або 21,4%. Таким чином, найбільшого ушкодження (відповідно до коефіцієнтів важливості тканин) зазнала деревина і серцевина, меншого - кора, і незначних пошкоджень зазнали клітини камбію. Пошкодження камбію є більш небезпечним показником, ніж пошкодження кори або деревини. Оскільки камбій є ембріональною тканиною, що відповідає за регенерацію. Характерним для всіх видів магнолії було те, що ушкодження тканин біля бруньки були менш суттєвими у порівнянні з таким верхівок пагонів , проте більші, ніж у середній частині (рис.3 Б). Тривале (4-6 год.) проморожування пагонів при температурі –30° і –35°С виявило суттєвіші пошкодження тканин. Індекс сумарного пошкодження верхівок пагонів зріс відповідно до 23-26 %. (див. рис. 3).

А Б

Найменші пошкодження визначили для середньої частини пагонів за температури проморожування –25оС. Сума пошкоджених тканин становила: M. liliflora — 4,8; M. kobus — 3,4 (див. рис. 4Б); M. salicifolia — 6,6 (див. рис. 3Б); M. denudata — 15,4 бали (див. рис. 4А). Суттєвіших ушкоджень зазнали тканини пагонів M. denudata: кора — 4,8, камбій — 5,6, деревина — 3,6, серцевина — 1,4 бали (рис. 4 А).

А Б

Середня частина пагону у міжвузлі усіх досліджених видів є найстійкішою, пошкодження її тканин зменшились у 2—3 рази порівняно з тканинами верхівок пагонів. Аналізуючи пошкодження тканин середньої частини пагонів біля бруньки за температури –25оС, відмітили найбільші ушкодження для пагонів M. denudata (24,2) (див. рис. 4 А), найменші — для пагонів незимостійкого виду M. liliflora (5,6). Характерно для всіх видів, що ушкодження тканин біля бруньки були меншими від верхівок пагонів, проте більші, ніж у середній частині (рис. 5). Це пов’язано із більшою метаболічною активністю тканин у зоні біля бруньки. Пошкодження останньої були максимальними для M. denudata (28), найменші — для M. salicifolia (8).

Таким чином, встановлено, що пошкодження пагонів, які відбирали в природних умовах (за температури –10 …–12оС), та й після штучного проморожування їх за –25оС були несуттєвими, а тканини — здатними до відновлення за рахунок поділу камбіальних клітин. Показано, що за не надто низьких температур проморожування найменш зимостійкий вид M. liliflora демонстрував високу морозостійкість як камбію, так і інших тканин.

Проте, після проморожування пагонів цього виду до нижчих температур (–30, –35оС), спостерігали пошкодження усіх тканин на рівні інших видів, а пошкодження бруньок виявилось максимальним, сягаючи 40 балів.

Отже, температури –30 та –35оС можна вважати критичними, здатними ускладнити нормальний розвиток та ріст цього виду, що призводить до втрати його декоративності і зимостійкості в цілому. Пошкодження тканин зимостійких видів M. kobus та M. salicifolia відбувалось поступово зі зниженням температури. На кінець експерименту (при –35 оС) у верхівках та середній частині тканини пагонів M. kobus виявились найменш пошкодженими. Вид із середньою зимостійкістю (M. denudata) характеризувався низькою морозостійкістю кори та камбію на всіх етапах зниження температури порівняно з іншими видами. Встановлено, що найчутливішими до дії морозу є верхня частина пагона та тканини біля бруньки, а найстійкішою — середня частина у міжвузлі. Проморожуванням при –30 та –35єС виявлено також зниження рівня морозостійкості тканин пагонів в наступній послідовності: кора > камбій > деревина > серцевина.

Пошкодження низькими температурами тканин пагонів визначали також методом флуоресцентної мікроскопії. Пошкоджена клітина вирізняється такими особливостями: вакуоля втрачає чіткий контур, а вміст її розпливається по всьому препарату, утворюючи флуоресцентну вуаль. Хлоропласти також змінюють свої властивості: інтенсивність їхньої червоної флуоресценції різко зменшується, зникають чітко видимі до цього грани. У більшості досліджених видів магнолії за температури проморожування –30 та –35єС виявлено, що найстійкішими є кора та камбій (крім М. denudata), а найвразливішими — деревина та серцевина.

6. Залежність рівня обводнення пагонів магнолій від сформованості покривної тканини в зимовий час. На думку багатьох авторів (Frisch, 1991; Baur, Schonherr, 1995; Riederer, Schreiber, 2001), основним бар’єром неконтрольованої втрати води листками, пагонами, плодами та іншими органами вищих рослин є кутикула. На нашу думку, активність випаровування води через покривні тканини пагонів різних видів магнолії залежить не лише від товщини кутикули, але й від формування шарів фелеми, їх кількості, а особливо — від формування сочевичок, котрі переважно забезпечують газообмін у тканинах пагонів на різних стадіях спокою рослин. У зв’язку із цим ми провели серію дослідів із вивчення процесу втрати води пагонами дев’ятьох видів магнолій. На рис. 6. представлено чотири контрастні за зимостійкістю види. Випаровування води пагонами більш стійких видів M. kobus та M. acuminatа проходило менш інтенсивно, ніж у слабко зимостійких видів — M. stellata і M. liliflora. Так, за перший місяць експерименту зимостійкі види втратили трохи більше 10 % води. Натомість пагонами найменш зимостійких видів (M. stellata та M. liliflora) втрачено відповідно до 20 та 27 % води. За анатомічною будовою пагони зимостійких видів вкриті кутикулою (15—16 мкм завтовшки) та багатошаровим корком, що, ймовірно, зменшує інтенсивність процесу водовіддачі. Таким чином, водовіддача може відбуватись лише через сочевички. Кількість сочевичок у зимостійких видів невелика (див. табл. 1) і становить: M. kobus — 31/10 см2 поверхні середньої частини пагону та M. acuminatа — 35/10 см2. До того ж сочевички пагонів M. acuminatа щільно запаковано виповнювальними клітинами, що суттєво зменшує шанси надмірного випаровування. Пагони менш зимостійких видів (M. stellata, M. liliflora) втратили найбільше води. Кутикула пагонів M. stellata — переривчастого типу, завтовшки 12 мкм. Перидерма і сочевички компактно заповнені виповнювальними клітинами, проте сочевичок у порівнянні із попередніми видами більше — 44/10 см2 поверхні пагону. У найменш зимостійкого виду M. liliflora в суворі зими пошкоджується однорічний приріст. Нами встановлено, що під кутикулою (10 мкм) вищезгаданого виду розміщується одношарова фелема. Сочевичок у 2—3 рази більше (71/10 см2), ніж у зимостійкіших видів, і для них характерні великі площі розриву поверхневих шарів.

Переважна кількість води знаходиться у тканинах рослин у зв’язаному стані, тобто її випаровуваність за нормальних умов знижена або неможлива. Основні механізми зв’язування її — це гідратація біоколоїдів та бар’єрна функція мембран. На рис. 7 показано, що найбільшу кількість зв’язаної води містили пагони M. acuminata, M. obovata та M. denudata (15—18,3 % від кількості усієї води в пагоні).

Можливо, саме через впорядковану та збалансовану систему на клітинному та тканинному рівнях пагони згаданих видів випаровували найменше води серед досліджених видів, що свідчить про їх кращу пристосованість і життєздатність в умовах водного дефіциту. У пагонів M. tripetala, M. sieboldii та M. kobus відзначено меншу водоутримуючу здатність. Кількість зв’язаної води становила близько 10 %. Пагони цих видів вкриті товстим шаром добре вираженої кутикули (до 15 мкм). Багатошарова перидерма вказує на високоорганізовану захищеність розташованих нижче тканин від зимового висихання. В зоні сочевичок — яскраво-жовте свічення, пов’язане з інтенсивним утворенням молодих виповнювальних клітин та просякненням їх оболонок кутином та суберином. На 10 см2 площі кори їх від 9 (M. tripetala) і до 45 шт., як у M. sieboldii.

Отже, наведені порівняння різних за будовою покривної тканини видів магнолій показали, що види з добре розвиненою перидермою (2—4 шари, що додатково захищені відмерлою епідермою) і кутикулою (15—28 мкм), а також щільно заповненими сочевичками втратили менше води, ніж інші. На нашу думку, пагонами M. liliflora та M. stellata було втрачено найбільше води саме через недостатнє формування покривно-захисного шару: велика кількість сочевичок (71/10 см2) із розривом поверхневих шарів та одношаровий корок у M. liliflora; переривчаста кутикула та відносно значна кількість сочевичок (44/10 см2) у M. stellata. Ці дані добре узгоджуються із багаторічними фенологічними спостереженнями, адже вищезгадані магнолії — слабко зимостійкі в наших кліматичних умовах.

Оскільки морозостійкість рослин пов’язана із фізичним станом води у клітинах та міжклітинниках і її кількістю у різних за фізіологічною функцією тканинах пагона, доцільно було з’ясувати проходження процесу льодоутворення у тканинах пагонів контрастних за морозостійкістю магнолій.

7. Дослідження процесів льодоутворення у пагонах різних за морозостійкістю магнолій методом диференційного термічного аналізу. Процес входження рослин у стан спокою забезпечує незворотність їх аклімації, яка супроводжується зневодненням тканин передусім надземної частини рослин унаслідок підвищення проникності для води мембранних структур їхніх клітин. Розвиток морозостійкості та її втрата істотно пов’язані зі змінами стану води в тканинах рослин. Для оцінки цих змін все частіше використовують диференційний термічний аналіз (ДТА) процесів льодоутворення в органах та тканинах (Quamme, 1991; Китаєв, 2003). Льодоутворення в цілісних зразках (з корою та деревиною) представлено достатньо дифузним спектром тепловиділення у широкому інтервалі температури –10 ... –35,5оС (швидкість зниження температури — 1°С/хв). При цьому на спектрах тепловиділення практично завжди присутні дві смуги: перша припадає на –10 ... –20оС (високотемпературна екзотерма, ВТЕ), друга — на –20 ... –35оС (низькотемпературна екзотерма, НТЕ).

На рис. 8 наведено результати визначення екзотерм льодоутворення в однорічних пагонах контрастних за зимостійкістю видів магнолії: незимостійкої M. liliflora (А) та високозимостійкої M. kobus (Б).

Ініціація льодоутворення у першого виду розпочалася після досягнення температури –14°С. ВТЕ тут демонструє два піки: перший, що припадає на –16°С і має амплітуду 0,8°С, відповідає замерзанню води у судинах ксилеми, а другий (на –19°С, з амплітудою 1°С) — у тканинах кори. Для НТЕ також характерна наявність двох піків, хоча і не так чітко виражених: на –23°С з амплітудою 0,5°С і на –31°С з амплітудою 0,3°С. Вважається, що НТЕ пов’язана з замерзанням внутрішньоклітинної води у ксилемі. Схожий характер екзотерм спостерігався і у середньостійких магнолій (M. denudata та гібрида M. soulangiana).

У зимостійкого виду M. kobus льодоутворення розпочалося з температури –12°С, а амплітуда ВТЕ була загалом уп’ятеро більшою, ніж у M. liliflora. Максимум льодоутворення в ксилемі припав на –15°С, а у корі — на –18°С. Амплітуда першого максимуму становила 5°С, другого — 4,8°С. Такі високі значення амплітуд ВТЕ свідчать про наявність у пагонах M. kobus значних запасів утримуваної води, що уберігає їх від зимового висихання, хоча і підвищує ризик пошкоджень за рахунок позаклітинного утворення льоду. Діапазон НТЕ охоплює від –29 до –35°С, а максимум з амплітудою 0,6°С припадає на –33°С. Аналогічні результати були отримані для іншого зимостійкого виду — M. salicifolia.

Порівнюючи екзотерми льодоутворення зимостійких і незимостійких видів магнолії, можна дійти висновку, що для перших характерна більша величина відношення середніх амплітуд ВТЕ до НТЕ (7,0 … 8,3 проти 2,0 … 2,5 для останніх). Крім того, у зимостійких видів інтенсивність льодоутворення у корі нижча, ніж у деревині (співвідношення 0,80 … 0,96), тоді як у незимостійких — навпаки (співвідношення 1,25 … 1,50). Це загалом узгоджується з оцінкою методом ДТА морозостійкості різних сортів яблуні (Пасічний, Пономарьова, Цепков, 1977) і підтверджується нашими даними про вміст випаровуваної та зв’язаної води у пагонах різних видів магнолії.

8. Динаміка флавоноїдів у органах магнолій як показник стійкості рослин проти дії факторів навколишнього середовища.

Первинний скринінг та ідентифікація речовин у корі пагонів показали наявність 5 флавоноїдів, з яких ідентифіковано рутин і кверцетин, речовини з Rf = 0,19; 0,38; 0,58 - не ідентифіковано. Встановлено також органоспецифічність вмісту флавоноїдів у рослинах магнолій: найбільше їх міститься у листках (3,62%), менше у корі (0,98%) (рис. 9). У фотосинтезуючих органах (листки і кора) флавоноїди беруть участь у поглинанні ультрафіолетового випромінювання і запобігають руйнуванню хлорофілу.

Встановлено, що вміст флавоноїдів упродовж року в корі досліджуваних видів магнолій змінювався залежно від стадій росту й розвитку рослин та температури навколишнього середовища, а також рівня зимостійкості виду. У пагонах магнолій протягом активної вегетації до жовтня місяця флавоноїди накопичувалися в корі. В осінньо-зимовий період, зі зниженням температури повітря (від +3,2оС 29 листопада до –10оС 2 грудня) спостерігали значне зменшення вмісту флавоноїдів, яке тривало