Національна академія наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН

України

На правах рукопису

Кіштаарі Махмуд

УДК 663.12:663.031:637.127.2

Вивчення фізіолого-біохімічних особливостей дріжджів, що

утилізують лактозу, для отримання етилового спирту.

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі промислових мікроорганізмів інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та на кафедрі мікробіології і загальної імунології Національного університету ім. Тараса Шевченка

Науковий керівник - д.б.н., професор, чл.-кор. НАН України

Валентин Степанович Підгорський

Інститут мікробіолігії та вірусології ім. Д.К.Заболотного

НАН України, завідувач відділом фізіології промислових

мікроорганізмів

Офіційні опоненти - д.б.н., професор, чл.-кор. НАН України

Юрій Романович Малащенко

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного

НАН України, завідувач відділом біології

газоокислювальних мікроорганізмів;

кандидат технічних наук

Вадим Михайлович Поводзинський

Український державний університет харчових технологій,

доцент кафедри біотехнології мікробного синтезу

Провідна установа - Інститут ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України, м.Київ

Захист відбудеться «30» березня 199р. о 10-й годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

(252143, Київ-143, вул.Заболотного, 154. Інститут мікробіології і вірусології ім.Д,К,Заболотного НАН України, зал засідань)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К. НАН України

Автореферат розісланий: « 28 » лютого 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Л.М.Пуріш

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Раціональне використання сировинних ресурсів є основою підвищення ефективності суспільного виробництва. Воно досяга-єть-ся шляхом розробки та запровадження безвідходних і маловідходних технологій.

Переробка молока під час виробництва різноманітних молочно-білко-вих концентратів (сир, твердий сир, казеїн) пов’язана із отриманням сиро-ват-ки як побічного продукту виробництва.

За даними Міжнародної молочної федерації у теперішній час до 50% молочної сироватки не використовується. В Україні переважна більшість мо-лочної сироватки зливається у водойми, викликаючи забруднення довкілля. Саме тому способи промислової утилізації сироватки є предметом вивчення багатьох дослідників.

Відомі різноманітні способи використання молочної сироватки: висушування, отримання лактози, виготовленя напоїв тощо. Останнім часом все більшого поширення у її промисловій переробці набувають біотех-но-логічні способи.

Зараз молочна сироватка використовується для отримання спирту, органічних кислот, ферментів, вітамінів, органічних розчинників, ліпідів, антибіотиків, мікробного білка.

Як продуценти в біотехнологічних процесах для отримання харчових та кормових продуктів на основі молочної сироватки можуть бути викорис-та-ні представники різних таксономічних груп бактерій, дріжджів, мікрос-ко-піч-них грибів, що мають властивість засвоювати лактозу як джерело вуглецю та енергії.

Одним із перспективних напрямків промислової переробки молочної сироватки є отримання на її основі етилового спирту. Виробництво етанолу на основі нативної сироватки пов’язане зі значними енергетичними витра-та-ми на стадії виділення через його низький вміст у бражці. Отримання спирту із концентрованої сироватки пов’язане зі значними витратами на стадії її випарювання та очищення.

Найдоцільнішим є процес переробки молочної сироватки при вико-рис--танні її як розчинника висококонцентрованих джерел вуглеводів, наприклад меляси. Цим досягається економія води, використовуваної для розведення сировини, що містить вуглеводи, збагачення бродильної суміші ростовими факторами і часткове заміщення традиційних видів сировини у виробництві спирту за рахунок лактози, що міститься у сироватці.

Варто зазначити, що відомості про особливості отримання етанолу на основі суміші молочної сироватки та інших джерел вуглеводів обмежені.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер-таційна робота включає дослідження, виконані в рамках плану науково-дослідних робіт відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України з теми 04.3. – «Дослідження систематики, екології і фізіології промислово важли-вих видів дріждів і актиноміцетів».

Мета роботи. Мета полягає в пошуку активних штамів дріжджів, що засвоюють лактозу, вивченні фізіологічних особливостей їх росту в умовах аеробного і анаеробного культивування та в розробці наукових основ отримання етилового спирту на змішаних субстратах.

Основні завдання наукових досліджень:

1. Вивчити здатність зброджувати молочну сироватку представниками різних таксономічних груп дріжджів і відібрати найбільш активний штам.

2. Оптимізувати умови зброджування молочної сироватки дріжджами.

3. Вивчити здатність селекціонованого штаму дріжджів зброджувати різні вуглеводи.

4. Встановити доцільність використання суміші культур дріжджів для зброджування змішаних субстратів.

5. Вивчити особливості росту селекціонованого штаму дріжджів на молочній сироватці в аеробних умовах та оптимізувати режим його культи-ву-вання.

Наукова новизна роботи. Вивчена здатність зброджувати молочну сироватку представниками різних таксономічних груп дріжджів. Селекці-о-но-ва-но штам дріжджів Kluyveromyces lactis 42К, що має здатність активно пере-т-ворювати лактозу молочної сироватки в етанол.

Показана ефективність використання змішаних культур дріжджів при зброджуванні різних вуглеводів.

Вперше встановлено послідовність ферментативного гідролізу суміші лак-този та сахарози чи мальтози дріжджами і подальшого зброджування ни-ми утворених моносахаридів змішаними культурами дріжджів.

Визначені фактори, що впливають на ефективність використання джерела вуглеводного живлення селекціонованим штамом дріжджів. Вста-нов-лений оптимальний режим культивування дріжджів на стадії їх нако-пи-чен-ня в аеробних умовах.

Практична цінність роботи. Селекціоновано перспективний для промислового отримання етилового спирту на основі молочної сироватки штам дріжджів, що засвоює лактозу.

Показана доцільність використання змішаних культур для зброд-жу-ван-ня молочної сироватки в суміші з сахарозою чи мальтозою.

Розроблені підходи щодо підвищення ефективності використання лактози в молочній сироватці селекціонованим штамом в аеробних умовах, що можуть бути використані для отримання дріжджів у спиртовій промис-ловості.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на засі-дан-нях мікробіологічної секції Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. За-болотного НАН України в 1996 та 1998 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 наукові роботи. Одержано два патенти України на винаходи.

Особистий внесок дисертанта. Основна частина роботи виконана автором особисто. Селекцію дріжджів, що зброджують лактозу, та визна-чен-ня послідовності ферментативного гідролізу вуглеводів середовища під час його збродження проведено в Українському державному університеті харчо-вих технологій спільно з професором В.М. Швецом та старшими науковими співробітниками Л.А. Івановою та Т.А. Королюк.

Оптимізація умов періодичного і безперервного культивування селек-ціо-нованого штаму дріжджів виконана в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України спільно зі старшим науковим співро-біт-ником М.М. Гавриленко.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (3 розділи), обговорення результатів експериментів, висновків, списку цитованої літератури, який нараховує 89 джерел. Робота викладена на 105 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 21 малюнком та 12 таблицями.

Зміст роботи

1. Огляд літератури

У розділі наведений склад і властивості молочної сироватки, вказані існуючі способи її утилізації, представлені різні таксономічні групи мікро-організмів, що використовуються при біотехнологічному способі її переробки у цільові продукти, наведені промислові технології одержання етанолу на основі сироватки.

2. Матеріали та методи досліджень

Об’єктами досліджень слугували 74 штами дріжджів родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Cryptococcus, що зберігаються в музеї відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, а також промислові раси дріжджів Saccharomyces cereveisiae V-30, K-81 із музею кафедри біотехнології продуктів бродіння, екстрактів та напоїв Українського державного університету харчових технологій.

Відбір штамів дріжджів, які активно зброджують лактозу молочної сироватки, визначення інтенсивності зброджування вуглеводів селекціо-но-ва-ним штамом та змішаними культурами, вивчення впливу джерел живлення, температури та рН на процес зброджування молочної сироватки проводили в колбах, що мали сірчанокислотні затвори.

Про активність зброджування вуглеводів робили висновок за змен-шен-ням маси колб у результаті виділення діоксиду вуглецю.

Вміст вуглеводів у поживному середовищі, культуральній рідині і бражці встановлювали ферроцианідним методом. Послідовність фермен-та-тив-ного гідролізу та споживання вуглеводів дріжджами досліджували методом паперової хроматографії [Королюк та ін., 1976]. Вміст етилового спирту в зразках бражки та культуральної рідини визначали методом газо-рідинної хроматографії з використанням хроматографа “Chrom-5” із засто-су-ван-ням полум’яно-іонізаційного детектора.

Вивчення процесу зброджування суміші молочної сироватки та ме-ля-си, оптимізацію умов аеробного вирощування селекціонованого штаму дріжд-жів провадили у ферментерах фірми “Biotec” місткістю 3 л.

Вологість дріжджової біомаси та концентрацію дріжджів у куль-ту-раль-ній рідині визначали ваговим методом після висушування наваж-ки при температурі 1050 С. Розрахунок значень питомої швидкості росту, економіч-ного коефіцієнта, продуктивності процесу культивування, ва-лової швидкості утворення етанолу, виходу спирту відносно до теоретичного здійснювали за загальновживаними формулами [Перт, 1978; Яровенко, 1981].

3. Особливості зброджування вуглеводів дріжджами,

які засвоюють лактозу

3.1. Відбір штамів дріжджів, які активно зброджують лактозу. Досліджено 74 штами, що належать до родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Cryptococcus на здатність зброджувати лактозу. Як середовище викорис-то-ву-ва-ли нативну молочну сироватку. У результаті проведених досліджень відібрано 15 штамів дріжджів роду Kluyveromyces, здатних зброджувати лак-тозу молочної сироватки. Найбільшу активність мали штами 42К, 317 і 325 (табл. 1).

Таблиця 1. Хіміко-технологічні показники процесу зброджування молочної сироватки дріжджамт Kluyveromyces lactis.

№ | Штам | Кількість СО2, що виділилась, | Вміст

вуглеводів, %: | Вміст спирту в бражці

п/п- | г/100 мл | почат-ковий | кінцевий | об.% | % до тео-ретичного

1 | 42K | 1,60 | 3,8 | 0,14 | 2,12 | 85,0

2 | 295 | 0,21 | 3,8 | 1,15 | 0,28 | 15,5

3 | 296 | 0,17 | 3,8 | 1,15 | 0,22 | 12,1

4 | 297 | 0,12 | 3,8 | 1,17 | 0,16 | 8,9

5 | 298 | 0,11 | 3,8 | 1,20 | 0,15 | 8,2

6 | 300 | 0,24 | 3,8 | 1,24 | 0,32 | 18,3

7 | 301 | 0,15 | 3,8 | 1,58 | 0,19 | 12,5

8 | 302 | 0,07 | 3,8 | 1,45 | 0,09 | 5,8

9 | 303 | 0,10 | 3,8 | 1,58 | 0,13 | 8,6

10 | 304 | 0,26 | 3,8 | 1,35 | 0,34 | 20,3

11 | 316 | 0,16 | 3,8 | 1,22 | 0,21 | 12,0

12 | 317 | 1,52 | 3,8 | 0,20 | 2,01 | 82,0

13 | 318 | 1,48 | 3,8 | 0,25 | 1,97 | 81,2

14 | 325 | 1,45 | 3,8 | 0,27 | 1,93 | 80,0

15 | 402 | 0,27 | 3,8 | 1,15 | 0,36 | 20,0

Серед штамів, що були відібрані, найкращу здатність зброджувати лактозу має штам Kluyveromyces lactis 42К, тому всі подальші дослідження були проведені саме з цим штамом.

3.2. Оптимізація умов зброджування молочної сироватки дріжджами Kl. lactis 42К. У дослідах було використано нативну молочну сироватку із вмістом лактози 4,0%. Проведено дослідження впливу температури, рН сере-до-вища та додатково внесених джерел азоту, фосфору і магнію на ефек-тив-ність зброджування сироватки. Як такі використовували сечовину, ортофос-фор-ну кислоту і сульфат магнію. Встановлено, що оптимальна тем-пе-ратура зброджування молочної сироватки дріжджами Kl. lactis 42К становить 30-320 С, а рН середовища 4,5-5,0. За таких умов концентрація етанолу в дозрілій браж-ці складала 2,08-2,10 об.%. При цьому у процесі зброджування молочної сироватки немає необхідності в корекції рН середовища. Під час оптимізації складу середовища, яке зброджували, як джерело азоту використовували сечовину в концентрації 0,1-0,6%, фосфор додавали у вигляді ортофосфорної кислоти — 0,1-0,3%, магній у вигляді сульфату — 0,05-0,15%. При додаванні сечовини до молочної сироватки накопичення спирту виявилося найзнач-ні-шим. Найкращі результати було отримано при концентрації сечовини 0,5%. Зба-гачення молочної сироватки дозволяє не лише збільшити накопичення спирту, але і зменшити тривалість процесу її зброджування з 72 год. до 48 год. Ортофосфорна кислота має досить незначний вплив на інтенсивність процесу, а сульфат магнію не виявляє ніякого впливу на процес зброджу-ван-ня лактози. На основі експериментальних даних вибрано оптимальні умови зброджування молочної сироватки дріжджами Kl. lactis 42К: температура — 30-320 С; величина рН середовища — 4,5-5,0; кількість сечо-ви--ни, що додається до сироватки як джерело азотного живлення, становить 5 г/л, а ортофосфорної кислоти, як джерела фосфору — 1,5 г/л.

3.3. Дослідження процесу зброджування різних вуглеводів культурами дріжджів. Зброджування вуглеводів провадили в колбах монокультурами дріжджів Kl. lactis 42К, Sacch. cerevisiae V-30, Sacch. cere K-81 та асоціацією дріжджів Kl. lactis 42К, Sacch. cerevisiae V-30 чи Sacch. cerevisiae K-81 у співвідношенні 1:2 із використанням синтетичного середо-вища Рідер. Вміст лактози, мальтози і сахарози в середовищі складав 4%, що відповідає середньому вмісту цукрів у молочній сироватці.

Процес зброджування дріжджами Kl. lactis 42К окремих цукрів найбільш інтенсивно відбувався протягом 24 год. (рис. 1). За цей період вміст лактози і сахарози в середовищі знижувався на 70 і 75% відповідно. Маль-тоза досліджуваним штамом дріжджів не зброджувалася, а активність зброджування сахарози була нижчою, ніж при використанні Sacch. cerevisiae V-30. Протягом 48 год. Kl.lactis 42К майже повністю зброджує лактозу і саха-розу. Залишковий вміст вуглеводів при цьому не перевищує 0,3%, а концентрація спирту в бражці становить 2,2-2,4 об.%. Ці дані свідчать про те, що дріжджі Kl. lactis 42К не можуть використовуватися для зброджу-ван-ня мальтози.

Встановлено принципову можливість використання Kl. lactis 42К для зброджування поживного середовища, що містить 4% лактози і 8% сахарози. Виявлено, що протягом 72 год. загальний вміст вуглеводів знижується до 0,6%, а концентрація спирту становить 7,1 об.% (рис. 2).

Вивчена здатність змішаних культур зброджувати суміші різних вуг-ле-водів. Показано, що популяція дріжджів, складена з Sacch. cerevisiae V-30 та Kl. lactis 42К, ефективно зброджує середовище, яке містить 4% лактози і 8% сахарози. Тоді ж концентрація залишкових вуглеводів у бражці по закінченні процесу складає 0,4%, а етанолу — 7,5 об.%.

Встановлена можливість асоціації дріжджів Sacch. cerevisiae K-81 та Kl. lactis 42К зброджувати суміш мальтози і лактози. Однак перебіг цього про-цесу менш активний — через 72 год концентрація вуглеводів в бражці становить 0,8-0,9%, а етанолу — 6,9-7,0 об.%.

Під час зброджування лактози і сахарози дріжджами Kl. lactis 42К сахароза гідролізується на початку процесу і вже через 6 год повністю від-сут-ня. Лактоза підлягає гідролізному розщепленню менш інтенсивно, про що свідчить поява галактози лише через 12 год. На 24 год лактоза була майже зовсім відсутня. Варто зазначити, що фруктоза як і галактоза утворені при гідролізі сахарози і лактози відповідно, у незначній кількості виявляються в середовищі після 72 год. Під час дослідження процесу зброджування лак-този і мальтози асоціацією дріжджів Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae К-81 встановлено, що на початку процесу відбувається інтенсивний гідроліз маль-този Sacch. cerevisiae К-81. При цьому лактоза не зброджується дріжджами Sacch. cerevisiae К-81. Її гідроліз штамом Kl. lactis 42К відбувається менш активно — ледь помітні плями лактози виявлені через 48 год. Під час зброд-жу-вання суміші лактози і сахарози асоціацією дріжджів Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae V-30 у зброджуваному середовищі цукрів залишається мен-ше, ніж під час зброджування лактози і мальтози дріжджами Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae К-81. Так, наприкінці процесу в бражці у незначних кількостях присутні фруктоза і галактоза. Лактоза при цьому гідролізується практично повністю. Отже встановлена можливість використання Kl. lactis 42К для зброджування лактози і сахарози та їхньої суміші, але не мальтози. Пока-зана ефективність використання змішаних культур різних штамів Sacch. cerevisiae та Kl. lactis 42К для зброджування лактози із сахарозою чи мальтозою.

За ступенем інтенсивності зброджування дріжджами Kl. lactis 42К цукри можна розташувати у наступій послідовності: глюкоза, сахароза, лак-тоза, фруктоза, галактоза. Дослідження зброджування модельних розчи-нів дають підстави припускати, що цей процес можна прискорити за рахунок постійного перемішування середовища.

3.4. Дослідження особливостей зброджування молочної сироватки у суміші з мелясою. Кількість спирту, отриманого з одиниці об’єму сиро-ват-ки, у порівнянні з іншими традиційними видами сировини незначна, що пояснюється низьким вмістом зброджуваного цукру у ній. Тому доцільно про--вадити зброджування сироватки у суміші із сировиною, що містить цук-ри. Такою сировиною є меляса.

Для проведення експериментів із молочної сироватки і меляси готу-ва-ли середовище, що містило 12% вуглеводів за співвідношення лактози і сахарози 1:2. Додатково у суміш вносили 0,5% карбаміду і 0,15% орто-фос-фор-ної кислоти. Зброджування вуглеводів здійснювали в колбах монокуль-ту-рами дріжджів Kl. lactis 42К і Sacch. cerevisiae V-30, або змішаною куль-турою, що складали із вказаних штамів у співвідношенні 1:2.

Встановлено, що протягом 72 год найменший рівень накопичення спирту відмічений при зброджуванні суміші дріжджами Sacch. cerevisiae V-30. Проте ефективність зброджування вуглеводів є досить високою і сягає 0,6 мл етанолу/год. Значний вміст залишкових вуглеводів в бражці обумов-лений нездатністю вказаного штаму зброджувати лактозу (табл. 2).

Таблиця 2. Покзники процесу зброджування меляси з молочною сиро-ват-кою культурами дріжджів.

Культура | Концентрація, % | Кількість | Вміст

дріжджів | Сухі | Вуглеводи | СО2, | спирту,

речовини | початкова | кінцева | г/100 мл | об.%

Kl. lactis 42K | 19,4 | 11,8 | 1,7 | 4,5 | 6,0

Sacch. cerevisiae V-30 | 19,4 | 11,8 | 3,3 | 3,9 | 5,2

Kl. lactis 42K +

Sacch. cerevisiae V-30 |

19,4 |

11,8 |

0,8 |

5,0 |

6,5

Виявлено можливість використання дріжджів Kl. lactis 42K для зброд-жуван-ня суміші меляси і молочної сироватки. Рівень накопичення спирту в бражці перевищує аналогічний показник при використанні Sacch. cerevisiae V-30 на 15%. Проте вміст залишкових вуглеводів у культуральній рідині досить значний.

Найкращі результати отримані при використанні змішаної культури дріжджів. У зазначений період штами зброджують до 93% вуглеводів. Вод-но-час ефективність утворення етанолу з вуглеводів сягає 0,61 мл/г.

В умовах ферментерів тривалість процесу бродіння становила 64-66 год. (рис. 3). В них протягом першої доби зброджується до 70% вуглеводів. Потім швидкість зброджування знижується, що, вочевидь, пов’язано із пере-хо-дом дріжджів на зброджування продуктів ферментативного гідролізу лактози, зокрема галактози. Вихід етанолу у бражці, що визріла, складає 0,6 мл/г, а валова швидкість утворення спирту — 25,3 мл/л за добу. Отримані результати свідчать про високу ефективність зброджування суміші молочної сироватки і меляси асоціативною культурою дріжджів Kl. lactis 42K та Sacch. cerevisiae V-30.

4. Особливості росту дріжджів Kl. lactis 42K, що засвоюють

лактозу, в аеробних умовах

4.1. Ріст Kl. lactis 42K на середовищі з різними вуглеводами. Вивчено послідовність засвоєння лактози і сахарози штамом, що дослід-жу-вав-ся. В умовах періодичного культивування у середовищі, що містить по 1% сахарози і лактози, встановлено, що спершу дріжджі використовують са-ха-розу, а потім лактозу. Під час використання сахарози максимальне значення питомої швидкості росту штаму сягає 0,42 год-1, а лактози — 0,36 год-1. Отримані дані свідчать про те, що лактоза використовується штамом гірше, ніж сахароза. Пошук температури, що забезпечує максимальну пи-тому швидкість росту дріжджів, ми провадили у періодичному процесі вирощування при рН 5,5 у середовищі Рідер із 1% лактози. Встановлено, що ріст досліджуваного штаму спостерігається в діапазоні температур від 22 до 37 0С. Проте температурний оптимум знаходиться у вузьких межах 28-30 0С. Варто відмітити, що штам досить чутливий до змін температури культи-вування. Так відхилення її на 5 0С від оптимального значення призводить до зниження питомої швидкості росту на 30-35%. Зазначимо, що найсуттєвіше її зменшення відмічено в зоні супраоптимальних величин.

Вплив концентрації водневих іонів (рН 3,0-8,0) на ріст досліджуваної культури вивчали при оптимальній температурі 26-28 0С. Максимальна пито-ма швидкість росту дріжджів спостерігається при рН 5,0-5,5. При рН ниж-че 3,2 і вище 7,5 дріжджі не росли.

Вплив рО2 на питому швидкість росту вивчали при температурі 28 0С та рН 5,5 у середовищі із 1% лактози в умовах турбідостата. Встановлено, що зміни рО2 в межах 20-60% не впливають на питому швидкість, яка до-сягає 0,36 год-1. При зменшенні рО2 від 20 до 10% відмічено зниження зна-чень m до 0,22 год-1.

В умовах хемостатного культивування за швидкості розбавляння 0,3 год-1 вивчено вплив рО2 на величину економічного коефіцієнта. Вста-нов-лено, що при лімітуванні росту джерелом вуглеводного живлення зміни рО2 від 20 до 50% не впливають на ефективність використання лак-то-зи, що становить 0,28 г АСД/г. Зниження рО2 від 20 до 8% викликає суттєве зменшення економічного коефіцієнта, яке супроводжується появою в куль-ту-раль-ній рідині етилового спирту.

Здійснені дослідження дозволили визначити оптимальні значення парціального тиску розчиненого в середовищі кисню (20-50%), що забез-пе-чують досягнення найбільших значень питомої швидкості росту і еко-но-мічного коефіцієнта за джерелом вуглеводного живлення. Це, зрештою, визначає ефективність використання сировини та продуктивність процесу культивування дріжджів.

Вивчення впливу вмісту лактози на ефективність її засвоєння дос-лід-жу-ваним штамом провадилося в умовах періодичного культивування при оптимальних значеннях температури (28-30 0С), активної кислотності сере-до-ви-ща (рН 5,5) та парціального тиску розчиненого в середовищі кисню (рО2 20-50%). Встановлено, що при вмісті лактози в середовищі до 1,5% економічний коефіцієнт сягав найбільших значень, що складали 0,27-0,28 г АСД/г. Із збільшенням концентрації вуглецю від 1,5 до 6,0% ефективність вико-ристання лактози поступово знижувалася до 0,11 г АСД/г. Одночасно в куль-туральній рідині виявлено накопичення етанолу.

4.2. Ріст дріжджів Kl. lactis 42K на молочній сироватці. Вивчення особливостей росту досліджуваного штаму на молочній сироватці здійс-ню-ва-ли при оптимальних значеннях температури, рН середовища, рО2. Для забезпечення дріжджів джерелом азотного та фосфорного живлення до молочної сироватки додавали 6 г/л карбаміду і 2 г/л ортофосфорної кис-ло-ти. В умовах періодичного культивування встановлено, що на початку про-цесу вирощування питома швидкість росту дріжджів не перевищує 0,12 год-1 (рис. 4). Тоді ж спостерігається накопичення етанолу до 1,5-1,6 об.%. Це свідчить про зброджування лактози навіть в аеробних умовах, що є проявом ефекту Кребтрі. Економічний коефіцієнт по лактозі складає 0,07-0,08 г АСД/г лактози. Зі зниженням концентрації лактози з 4,5 до 1,5% характер рос-ту культури різко змінюється. Питома швидкість росту штаму зростає до 0,3 год-1, а ефективність використання лактози до 0,27 г АСД/г. Нако-пи-чен-ня етанолу в культуральній рідині припиняється. Аналіз отриманих даних показує, що процес культивування дріжджів, що здійснюється на молочній сироватці, характеризується невисокими середніми значеннями економічного коефіцієнта і валової швидкісті росту, які складають 0,14 г АСД/г і 0,36 г АСД/лЧгод відповідно. Це обумовлено низькою ефективністю використання лактози і швидкістю росту досліджуваного штаму у початковому періоді куль-тивування.

Для підвищення ефективності процесу вирощування дріжджів нами рекомендовано використання від’ємно-доливного способу культивування із заміною до 1/3 об’єму культуральної рідини за годину молочною сиро-ват-кою. Концентрація лактози в культуральній рідині при цьому не пере-ви-щуватиме 1,5%, що забезпечить високе значення економічного коефіцієнта.

Вивчено ріст дріжджів Kl. lactis 42K на молочній сироватці в умовах безперервного культивування при зміні швидкості розбавлення середовища від 0,1 до 0,35 год-1. Встановлено, що при лімітуванні росту дріжджів джере-лом вуглеводного живлення і зміни Д від 0,1 до 0,3 год-1 концентрація біомаси в культуральній рідині практично не змінюється і становить 12,4-12,6 г АСД/л (рис. 5). При цьому ефективність використання лактози сягає 0,27-0,28 г АСД/г лактози. Подальше підвищення швидкості розведення до 0,35 год-1 призводить до вимивання культури з ферментера. Найбільшу про-дук-тивність процесу відмічено при Д=0,3 год-1. Отримані дані свідчать про можливість використання напів- та безперервного процесу культивування з метою отримання дріжджів для подальшого зброджування суміші молочної сироватки і меляси.

Висновки

1. Вивчено здатність зброджувати лактозу серед 74 штамів дріжджів, що належать до родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Cryptococcus. Встанов-ле-но, що найефективніше зброджували лактозу дріжджі роду Kluyveromyces. Ефективність зброджування лактози у деяких штамів сягала 80-85% від теоретичного виходу етанолу. Представники родів Debaryomyces та Cryptoco мали низьку бродильну активність.

2. Оптимізовано умови зброджування молочної сироватки селекціо-но-ва-ним штамом Kluyveromyces lactis 42К. Найбільший вміст спирту в бражці виявлено при температурі 30-32 0С, рН середовища 4,5-5,0, концентрації се-чо-вини, що додають до сироватки, — 0,5%, і ортофосфорної кислоти — 0,2%.

3. Вивчено здатність Kl. lactis 42К зброджувати вуглеводи. Встанов-ле-но, що досліджуваний штам здатний утворювати спирт із сахарози, лактози, глю-кози, галактози, фруктози, але не з мальтози. За ступенем зброджування вуглеводи можна розмістити в наступній послідовності, що спадає: глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, галактоза.

4. З метою інтенсифікації процесу зброджування поживного сере-до-ви-ща, що містить лактозу з сахарозою чи мальтозою, показано доцільність ви-ко-ристання змішаних культур, що складаються із Kl. lactis 42К та про-мис-лових штамів Saccharomyces cerevisiae V-30 чи K-81. Це дозволяє збільшити вміст спирту в бражці і знизити концентрацію залишкових вуглеводів.

5. Вивчено послідовність ферментативного гідролізу і зброджування лактози з сахарозою чи мальтозою змішаними культурами, що складаються із Kl. lactis 42К та Sacch. cerevisiae V-30 чи K-81. Показано, що спочатку гід-ро-лізується сахароза чи мальтоза, а потім лактоза. Найінтенсивніше зброд-жується глюкоза, потім галактоза і фруктоза.

6. Досліджено процес зброджування поживного середовища, що скла-да-ється з молочної сироватки і меляси, змішаною культурою дріжджів. Встановлено, що протягом 64-66 годин вміст вуглеводів знижується із 12,0 до 0,2%. Концентрація спирту у зрілій бражці сягає 7,1 об.%, а ефективність зброд-жування вуглеводів — 0,6 мл спирту/г.

7. Вивчено особливості росту дріжджів Kl. lactis 42К в умовах ае-роб-но-го культивування в середовищі, що містить лактозу. Встановлено, що в умо-вах періодичного вирощування найбільші значення питомої швидкості росту і економічного коефіцієнта, які становлять 0,34-0,36 год-1 і 0,27-0,28 г АСД/г лак-този відповідно, досягаються при температурі 28-30 0С; рН середовища 5,0-5,5; рО2 — 20-50% і концентрації лактози не більше 1,5%.

8. З метою досягнення високих концентрацій біомаси вирощування дріжджів в аеробних умовах на молочній сироватці доцільно викорис-то-ву-ва-ти від’ємно-доливний спосіб із заміною 0,25-0,30 об’єму культуральної ріди-ни за годину або ж безперервний спосіб, лімітуючи ріст штаму джерелом вуг-леводного живлення.

Список публікацій за темою дисертації:

1. Подгорский В.С., Швец В.Н., Гавриленко М.Н., Нагорная С.С., Иванова Л.А., Королюк Т.А., Киштаари М. Исследование процесса сбражи-ва-ния углеводов дрожжевыми культурами // Микробиол. журн. - 1995. - № 6, т. 57. - С. 29-33.

2. Подгорский В.С., Швец В.Н., Гавриленко М.Н., Нагорная С.С., Ко-ро-люк Т.А., Киштаари М. Селекция дрожжей-продуцентов этанола на мо-лоч-ной сыворотке // Микробиол. журн. - 1997. - № 6, т. 59. - С. 3-7.

3. Подгорский В.С., Гавриленко М.Н., Нагорная С.С., Сумневич В.Г., Швец В.Н., Тодосийчук С.Р., Киштаари М. Особенности роста лактозоусва-ива-ющих дрожжей в аэробных условиях // Микробиол. журн. - 1998. - № 1, т. 60. - С. 11-16.

4. Патент України на винаходи. № 21298 А від 04.11.97 р. Спосіб виробництва етилового спирту із меляси / Швець В.М., Іванова Л.О., Мис-лінська С.А., Королюк Т.А., Тодойсійчук С.Р., Підгорський В.С., Гавриленко М.М., Нагорна С.С., Кіштаарі М.; Заявка № 94076017 від 1.07.94 р.

5. Патент України на винаходи. № 22494 А від 03.03.98 р. Спосіб ви-роб-ництва етилового спирту з крохмалевмісної сировини. / Швець В.М., Іванова Л.О., Мислінська С.А., Королюк Т.А., Кіштаарі М.; Заявка № 95031201 від 16.03.95 р.

Кіштаарі М. Вивчення фізіолого-біохімічних особливостей дріжджів, що утилізують лактозу, для отримання етилового спирту. — Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 1999 р.

Дисертація присвячена вивченню результатів селекції дріжджів, здат-них зброджувати лактозу з утворенням етилового спирту. Вивчено здат-ність селекціонованого штаму дріжджів зброджувати різні вугле-води та їхні суміші. Показано доцільність використання змішаних дріжджових культур для зброджування середовища, що містить лактозу та сахарозу чи мальтозу. Це дозволяє значно інтенсифікувати процес накопичення спирту. Вивчена послідовність ферментативного гідролізу і зброджування дисахаридів змішаними культурами. Запро-по-но-вано спосіб отримання середовища, що містить молочну сироват-ку і мелясу. Вивчено особливості фізіології штаму дріжджів, що засво-ює лактозу, в умовах аеробного культивування а також опти-маль-ні умови його вирощування. Культивування дріжджів на молоч-ній сироватці рекомендовано проводити від’ємно-доливним чи безпе-рерв-ним способом.

Ключові слова: молочна сироватка, дріжджі, зброджування, етиловий спирт, культивування.

Киштаари М. Изучение физиолого-биохимических особенностей дрожжей, утилизирующих лактозу, с целью получения этилового спирта. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кан-ди-да-та биологических наук по специальности 03.00.07 — микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена изучению результатов селекции дрожжей, сбра-живающих лактозу с образованием этилового спирта. Изучена спо--собность сбраживать лактозу молочной сыворотки у 15 штаммов дрожжей Kluyveromyces lactis. Показано, что исследуемые культуры су-щест-венно отличаются по способности накапливать этиловый спирт. На сыворотке с 3,8% лактозы активные штаммы продуцировали от 1,93 до 2,12 об.% этанола, при этом выход его по отношению к тео-ре-ти-ческому составлял 80-85%. Наибольшие скорость и эфектив-ность сбраживания нативной молочной сыворотки отмечены у селек-ци-онированного штамма Kl. lactis 42К. Исследована возможность изу-че-ного штамма сбраживать различные углеводы и их смеси.

Показана целесообразность применения смешанных дрожжевых культур при сбраживании сред, содержащих лактозу с сахарозой или мальтозой, что позволяет существенно интенсифицировать процесс накопления спирта. Установлена эффективность использования ассоциаций, состоящих из штамов Kl. lactis 42К и Sacch. cerevisiae V-30. При содержании углеводов в питательной среде 12% остаточные концентрации сахаров в бражке составляют 0,4-0,9%, а содержание этанола достигает 6,9-7,5 об.%.

Изучена последовательность ферментативного гидролиза и сбражи-ва-ния дисахаров смешанными культурами. Предложен способ получе-ния среды, содержащей молочную сыворотку и мелассу.

Изучены особенности физиологии лактозоусваивающего штамма дрож-жей в условиях аэробного культивирования. С этой целью было иссле-довано влияние ряда факторов на рост селекционированного штамма лактозоусваивающих дрожжей Kl. lactis 42К. Найдены опти-маль-ные значения температуры культивирования, рН среды, пар-ци-аль-ного давления растворенного в среде кислорода и концентрации лактозы, при которых максимальная удельная скорость роста дости-гает 0,36 ч-1, а эффективность использования источника углеродного питания – 0,28 АСД/г лактозы.

В условиях периодического культивирования исследован рост штам-ма на среде с сахарозой и лактозой. Показано, что вначале дрожжи асси-милируют сахарозу, а затем – лактозу. Установлены особенности роста штамма на молочной сыворотке. Так, в начале культивирования низкие значения удельной скорости роста и экономического коэф-фи-ци-ента штамма обусловлены эффектом Кребтри. После снижения концентрации лактозы в среде до 1,5%, скорость роста штамма и эффективность использования углевода значительно возрастают.

Для достижения высоких концентраций биомассы и наибольшей про-дуктивности процесса культивирования штамма на молочной сыворотке предложены хемостатный способ выращивания дрожжей при лимитировании роста источником углеродного питания или отъем-но-доливной способ.

Ключевые слова: молочная сыворотка, дрожжи, сбраживание, этиловый спирт, культивирование.

M. Kishtaari. Study of physiological and biochemical peculiarities of yeast fermenting lactose to obtain ethyl spirit. – Manuscript.

Ph.D. thesis pursuing a scientific degree of Doctor of Biological Sciences in speciality 03.00.07 – Microbiology. – Institute of Microand Virology named after D.K. Zabolotnyi, Ukrainian National Academy of Sciences, Kiev, 1999.

5 scientific works are defended on results of selective breeding of yeast fermenlactose with ethyl spirit formation. It has been studied the ability of selected strain (culture) to ferment different carbohydrates and their mixtures. Expediency of mixed yeast cultures usage while fermenmediums containing lactose, sucrose or maltose, which allows to intensify process of spirit accumulation substantially, was demon-ted. Sequence of ferment hydrolisis and fermentation of disaccharide by mixed cultures was studied. The way of obtaining mediums containing whey and molasses was offered. Peculiarities of physiology of yeast culture assimilating lactose under conditions of aerobic cultivation were studied. The optimal conditions of its cultivation are determined. It is recommento cultivate yeast in whey by removal-top-up method or continuous operation.

Key words: whey, yeast, fermentation, ethyl spirit, cultivation.