Міністерство охорони здоров’я України

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

АНТОНЮК ВОЛОДИМИР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК: 615.32 : 547.96 /.011.012 : 578.08/.088

ЛЕКТИНИ У МЕДИКО-БІОЛОГІЧНИХ ТА ФІТОХІМІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ: СИРОВИННА БАЗА, ОТРИМАННЯ, ВЛАСТИВОСТІ ТА АСПЕКТИ ПРАКТИЧНОГО ВИКОРИСТАННЯ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології клітини НАН України та Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров’я України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

ЛУЦИК Максим Дмитрович,

провідний науковий співробітник інституту біології клітини НАН України

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

ГРИЦЕНКО Олена Миколаївна

Національна медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика,

професор кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор

КИСЛИЧЕНКО Вікторія Сергіївна

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри хімії природних сполук

доктор медичних наук, професор

ЛОГІНСЬКИЙ Володимир Євстаxович

Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України,

завідувач лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові

Провідна установа: Державний науковий центр лікарських засобів (м. Харків).

Захист дисертації відбудеться “25” травня 2007 р.

О 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.600.02 при Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 69

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (79000 м. Львів, вул. Січових стрільців, 17)

Автореферет розісланий 24.04.2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 35.600.02 Гасюк Г.Д.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з найважливіших завдань фармацевтичної науки і практики є пошук та створення засобів для діагностики і лікування різнома-нітних захворювань людини. Сьогодні особливо актуальною є діагностика та лікування онкологічних, імунних та аутоімунних захворювань, пошук методів, які можуть дозволити здійснення приживлення пересаджених органів та тканин.

Наукові відкриття останніх десятиріч засвідчили, що вирішення цих завдань неможливе без глибокого вивчення механізмів міжклітинного та внутрішньо-клітинного розпізнавання “свого” і “чужого” та свідомого і цілеспрямованого впливу на ці процеси. Отримані експериментальні дані все більше переконують в тому, що вуглеводні ланцюги зберігають і передають інформацію, подібно до нуклеїнових кислот та пептидних послідовностей. Потенціал вуглеводного коду набагато переважає за своїми можливостями інші біохімічні кодові системи, в тому числі і генетичний код. Зважаючи на те, що модифікації вуглеводів (вве-дення сульфо-, фосфо- та ацетильних груп) значно збільшують множину можли-вих олігомерів, які беруть участь в процесах розпізнавання, стає зрозумілою ви-рішальна роль вуглеводної частини глікокон’югатів у функціональній організації тканин і систем організму. Глікокод клітин живих організмів, навіть в межах одного виду, є індивідуальним і неповторним і дуже точно розпізнається специ-фічними рецепторними молекулами, які трансформують інформацію, записану на вуглеводах, в біологічні ефекти. Вуглеводозв’язуючі білки, що не є фермен-тами або імуноглобулінами, названі “лектинами” є основними розпізнавальними молекулами в цих процесах і відіграють дуже важливу роль в імунологічних реакціях [Gabius, 1997]. Тому розуміння молекулярних механізмів функціону-вання імунної системи організму, а також патологічних змін при її порушеннях, неможливе без глибокого вивчення ендогенних лектинів.

В той же час ендогенні лектини людини і ссавців є важкодоступними для досліджень. Незважаючи на їх бурхливе дослідження в останнє десятиріччя, лек-тини рослин і грибів залишаються, і ще довго будуть основними інструментами медико-біологічних досліджень, тим більше, що не виявлено суттєвих відмін-ностей у їхній структурі. Лектини рослин у багатьох відношеннях можуть моде-лювати функцію ендогенних лектинів ссавців, але є значно дешевшими і доступ-нішими. Крім того, значну кількість лектинів використовує гісто- і цито-хімія, медична мікробіологія, аналітична біохімія та лабораторна клінічна діаг-ностика. Для організації і проведення досліджень у вказаних галузях необхідні лектини з різноманітними властивостями, перш за все з добре дослідженою тонкою вугле-водною специфічністю. Тому пошук нових лектинів, отримання та вивчення їх властивостей досі залишається актуальним завданням.

Дослідження та застосування лектинів в Україні, започатковане в середині 70-х років, сьогодні продовжується в цілому ряді науково-дослідних та учбових закладів медичного і біологічного профілю. Сильна біологічна активність ряду лектинів, зокрема селективна токсичність, протипухлинна, антивірусна та імуно-стимулююча дія, а також можливість використання лектинів для цілеспрямова-ної доставки лікарських засобів до тканин і клітин організму або для вилучення патологічно змінених глікопротеїнів з кровообігу є експериментальним підгрунтям у створенні лікарських засобів нового покоління. У зв’язку з цим лек-тинами все більше цікавляться науковці фармацевтичного профілю та фармацев-тичні фірми розвинутих країн світу.

Тому дослідження сировинної бази лектинів, методи одержання чистих препа-ратів та дослідження різноманітних аспектів їх біологічної дії та застосування є сьогодні актуальною проблемою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота вико-нана у рамках планових наукових тем Інституту біології клітини НАН України:

“Дослідження впливу цитотоксичних білків і лектинів на пухлинні та імунокомпетентні клітини”, № держреєстрації 01.00U000080; “Дослідження впливу цитотоксичних білків і лектинів на пухлинні та імунокомпетентні клітини”, № держреєстрації 01.03U001404; “Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії” № держреєстрації 01.06U002599, та кафедри гістології, цитології, ембріології Львівського національного ме-дичного університету ім. Данила Галицького “Лектинові маркери та цитоплазматичні сигнальні молекули у процесі клітинної диференціації”, № держреєстрації 0102U007224, шифр теми ІН 07.00.0001.02.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є аналіз вітчизняної сировинної бази для одержання лектинів, виявлення перспективних напрямків у пошуку но-вих лектинів різної вуглеводної специфічності, очищення нових лектинів, вив-ення їх фізико-хімічних властивостей, вуглеводної специфічності та аспектів їх використання у фітохімічних і медико-біологічних дослідженнях.

Для реалізації поставленої мети визначено такі завдання:

- Виявити перспективні сировинні джерела для одержання нових лектинів різної вуглеводної специфічності, перш за все, рідкісної, зокрема L-фукозоспе-цифічних лектинів та сіалоспецифічних, а також D-манозоспецифічних, D-га-лактозоспецифічних, N-ацетил-D-глюкозамін- та N-ацетил-D-галактозамінспе-цифічних лектинів.

- Розробити методики і технологію очищення нових лектинів та інших цін-них речовин в одному технологічному циклі та одержати лектини в препаратив-них кількостях.

- Охарактеризувати основні фізико-хімічні та деякі імунохімічні властивості одержаних лектинів.

- Отримати похідні лектинів для гісто- і цитохімічних досліджень, а саме: кон’югати лектинів з пероксидазою, флюорохромом (ФІТЦ), колоїдним золотом.

- Розробити методи синтезу біоспецифічних сорбентів шляхом іммобілізації лектинів на нерозчинних носіях.

- Вивчити токсичність лектинів на пухлинних клітинах різних ліній та нижчих тваринах (жуках і нематодах).

- Застосувати лектини при дослідженні апоптозу, вивченні резистентності пухлинних клітин до протипухлинних препаратів та в гістохімічних досліджен-нях.

- Використати одержані нативні, кон’юговані та іммобілізовані лектини у дослідженні глікопротеїнів, полісахаридів та глікозидів.

Об’єкти дослідження - рослинні джерела лектинів: кореневище купини Polygonatum multiflorum (L.) All. та P. verticillatum (L.) All. , Paris quadrifolia L., кора та насіння Laburnum anagyroides Medik., кори Caragana arborescens Lam., Sarothamnus scoparius (L.) Koch., Robinia pseudoacacia L., насіння Amaranthus caudatus L., A. retroflexus L., Aesculus hippocastanum L., надземна частина Galanthus nivalis L., Leucoum vernum L., Hieracium aurantiacum L., H. pilosella L., H sylvularum Jord ex Boreau, Equisetum arvense L., Echinacea purpurea (L.) Moench.) та Rudbeckia laciniata L.;

- грибні джерела лектинів: плодові тіла Aleuria aurantia (Fr.) Tekl, Peziza badia Merat, P. verticulosa St. Am., Boletus luridus Fr., Amanita phalloides (Vaill. Fr.) Secr., Sarcoscypha coccinea (Fr.) Lambette, Clitocybe nebularis (Fr.) Kumm.;

- джерела лектинів з ікри риб: Perсa fluviatilis L. та Lucioperca lucioperca /L./;

- лектини, одержані з вказаних вище джерел;

- гісто- та цитологічні препарати нормальних та трансформованих тканин і клітин, клітини лейкемії миші ліній L929, L1210, MCF-7 (wt), MCF-7 (OOX/R).

Предмет дослідження - виявлення перспективних сировинних джерел для одержання лектинів та розробка методик їх очищення та комплексного вико-ристання; дослідження основних фізико-хімічних характеристик одержаних лектинів, їх вуглеводної специфічності та токсичності; застосування одержаних лектинів у фітохімічних, гістохімічних та фізіологічних дослідженнях.

Методи досліджень. Імунохімічні методи (реакція гемаглютинації і преци-пітації та реакції їх пригнічення за допомогою специфічних антигенів або гап-тенів) використовувалися для виявлення лектинів та дослідження їх вуглеводної специфічності; методи препаративної хімії білків (екстракція, осадження, діаліз, центрифугування, афінна, іонообмінна та гель-хроматографія, ліофільне висушу-вання) – для очистки лектинів з сировини; аналітичні (виявлення та кількісне визначення білків і вуглеводів, електрофорез та диск-електрофорез в ПААГ, УФ-спектроскопія, хроматографія на папері – для аналізу чистоти та дослідження фізико-хімічних властивостей одержаних лектинів та глікозидів; синтетичні - для одержання афінних сорбентів, іммобілізованих лек-тинів та кон’югатів лектинів з пероксидазою; гісто- та цитохімічні (виготовлення та фарбування препаратів клітин і тканин міченими лектинами) - для виявлення локалізації лектинових рецепторів на поверхні клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні та у світовій практиці систематизовано з фармакогностичної точки зору відомості про сиро-винні джерела для одержання лектинів, їх вуглеводну специфічність і біологічні властивості, що викладено в монографії “Лектини та їх сировинні джерела”. Аналіз даних літератури та власних одержаних результатів дозволив зробити прогнози щодо подальшого пошуку нових сировинних джерел лектинів, важли-вої в практичному плані вуглеводної специфічності. Зокрема, зроблені припу-щення щодо наявності L-фукозоспецифічних лектинів у грибів порядку пециціє-вих підтвердились наступним знаходженням такого типу лектинів у плодових тілах пецици каштанової, пецици пухирчастої та пецици фіолетової, а припущен-ня щодо наявності подібних лектинів у ікрі риб родини окуневих підтвердились знаходженням такого лектину у ікрі судака звичайного. Нами вперше одержані лектини з цих сировинних джерел, а також з кореневищ купини багатоквіткової та кільчастої, воронячого ока звичайного, кори карагани деревоподібної, насіння кінського каштану, насіння щириці хвостатої, трьох видів нечуй-вітрів, гриба - дубовика оливково-бурого, саркосцифи яскраво-червоної, а також вивчені їх фізико-хімічні та імунобіологічні властивості. Спосіб одержання манозоспеци-фічних лектинів, захищений деклараційним патентом України, дозволяє одержати лектини рослин амарилісових та лілійних із вищою чистотою та функціональною активністю. Вперше розроблено і застосовано ряд біоспеци-фічних сорбентів для очищення лектинів із рослинної, грибної та тваринної си-ровини. Вдосконалено або запропоновано нові оригінальні методи очистки лектинів з кори робінії несправжньої, із зародків пшениці, плодових тіл алеврії оранжевої, блідої поганки, насіння гороху, вики, сочевиці, кінських бобів, насін-ня золотого дощу звичайного тощо. Вдосконалено метод кон’югації лектинів із пероксидазою хрону та іммобілізації лектинів на агарозі. Запропоновано метод ідентифікації антибіотика-глікозиду ристоміцину сульфату за допомогою лек-тинів мишиного горошку, досліджено взаємодію ристоміцину сульфату з лек-тинами та очищено лектин із насіння гледичії колючої, який може бути родо-начальником нової підгрупи глюкозоспецифічних лектинів.

Вперше показана можливість використання лектинів в аналізі диглікозидів, що може знайти застосування у фітохімічному аналізі.

Також вперше досліджено сезонні зміни активності лектинів у дерев’янистих та трав’янистих рослин і розроблено рекомендації зі збору та заготівлі лектино-вмісної рослинної сировини.

Спільно з співробітниками кафедри гістології ЛНМУ імені Данила Галиць-кого досліджено гістохімічну специфічність ряду нових, вперше одержаних нами лектинів, та запропоновано деякі з них у якості гістохімічних маркерів ряду клітин і тканин.

Разом з співробітниками Інституту біології клітини НАН України досліджена токсичність деяких лектинів на клітини низки пухлинних ліній у культурі клітин та можливість використання лектинів як маркерів ранніх стадій апоптозу.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дозво-лили організувати виготовлення лектинів та їх похідних (мічених пероксидазою, ФІТЦом, колоїдним золотом, іммобілізованих на агарозі) протягом 1990 – 2007 років у НВК “Лектинотест” і надати можливість їхнього використання в багатьох лабораторіях України та за її межами. Розроблені нами афінні сорбенти для очистки лектинів дають можливість здійснювати очистку нових лектинів різно-манітної вуглеводної специфічності. Виявлені нами сезонні зміни активності лектинів в дерев’янистих та трав’янистих рослинах мають загальний характер і дозволяють пропонувати ряд практичних рекомендацій зі збору й пошуку рос-линної сировини, яка містить лектини. Нові лектини, вперше одержані нами, знайшли застосування в дослідженні кристаллінів кришталиків експерименталь-них тварин у НДІ фізико-хімічної медицини МОЗ РСФСР, м. Москва (акт про впровадження від 16.02.1987 р.), при виконанні планової наукової тематики відділу генетики людини Інституту біології та генетики НАН України (м. Київ) (акт про впроваження від 2.02. 2007 р.), гістохімічних та цитохімічних дослід-женнях в багатьох наукових, а також клініко-діагностичних лабораторіях Укра-їни. Зокрема, в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН Укра-їни мічені пероксидазою лектини знайшли застосування у диференційній діагностиці різний варіантів гострих лейкемій та лімфоїдних неоплазій (акт про впровадження від 22.01.2007 р.). У лабораторії нейроімунології Інституту нейро-хірургії ім. акад. А.П. Ромоданова (м. Київ) L-фукозоспецифічні та мічені перок-сидазою лектини знайшли застосування для діагностики ряду нервових захво-рювань(акти про впровадження від 20.12.2006 р.). На кафедрі нормальної ана-томії Запорізького медичного університету їх застосовують для виявлення іму-нологічно незрілих лімфоцитів та дендритних клітин (акт про впровадження від 30.01.2007 р.). Для потреб судово-медичної експертизи розроблений реагент на основі лектину горошку волохатого, придатний для ідентифікації антигену А як у нативних еритроцитах (визначення групи крові), так і в слідах секреторних виділень людини та в біологічному матеріалі. Афінні сорбенти з іммобілізо-ваними лектинами були використані для сорбції глікопротеїдів з сироватки та плазми крові у НДІ гематології і переливання крові (акти про впровадження від 27.01. 1987 р.).

Лектини, мічені пероксидазою були основним інструментом досліджень при виконанні докторських дисертацій А.М. Ященко (м. Львів), О.Ю. Шаповалової (м. Сімферополь) та цілої низки кандидатських дисертацій.

При фарбуванні гістологічних препаратів, фотографії яких наведені в підруч-нику Луцик О. Д. і співавт. “Гістологія людини”.- Київ : Книга плюс, 2003, який рекомендований Міністерством охорони здоров’я для студентів вищих медичних навчальних закладів ІІІ – ІV рівнів акредитації, було використано лектини, мічені пероксидазою, виготовлені здобувачем.

Наукова розробка з використанням ряду лектинів використовується з 1998 року при виконанні курсових і дипломних робіт на кафедрі біофізики Білорусь-кого університету (м. Мінськ) (акт про впровадження від 22.02.2007 р.).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійно виконаною роботою автора, у якій дисертант зібрав та проаналізував наукову літературу і патентну інформацію, сформулював мету й задачі дослідження. Здобувач здійснював збір рослинної та тваринної сировини для одержання лектинів, розробив методики одержання афінних сорбентів для їх очищення, застосував їх для одержання лек-тинів та здійснив аналіз одержаних препаратів лектинів, а також здійснив їх мі-чення пероксидазою хрону, колоїдним золотом, ФІТЦом та іммобілізацію на нерозчинних носіях. Здобувач самостійно застосовував також деякі цитохімічні методи при дослідженні клітин, робив аналіз та узагальнення результатів досліджень.

З наукових праць, опублікованих у співавторстві, в роботі наведені лише ті ідеї та положення, які є результатом особистих досліджень здобувача.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень, включені у ди-сертацію, були повідомлені на IV з’їзді фармацевтів УРСР (Запоріжжя, 1984); Першій республіканській конференції по медичній ботаніці (Київ, 1984), Всесо-юзном совещании по сорбентам для хроматографии (Москва, 1986), VIII Всесо-юзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1987 г); 10th Inter-national Lectin Conference (Charles University, Praque, 1988), 11th International LecConference (Tartu University, Tartu, 1989), 12th International Lectin Conference (Univ. of Calif. Davis and Fallen Leaf Like, Davis, 1990); 13th International Lectin Meeting (Berlin, 1991), VI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992); Третій українській конференції з медичної ботаніки (Київ, 1992); 15th International Lectin Meeting (Hungary, Szeged, 1993); 17th International Lectin Meeting (Germany, Wur1997); 18th International Lectin Meeting (Portsmouth, 1999); 20th International Lectin Meeting (Denmark, Copenhagen, 2002); на Установчому з’їзді Українського Товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, 2004); Спільному засіданні кафедр фармацевтичної, органічної, біоорганічної хімії, гіс-тології і ембріології ЛНМУ імені Данила Галицького та Інституту біології кліти-ни НАН України (Львів, 2007); засіданні кафедри хімії природних речовин На-ціонального фармацевтичного університету (Харків, 2007); Науково-практичній конф/ з міжнародною участю “Лекарства – человеку. Современные проблемы соз-дания, исследования и апробации лекарственных средств” (НФаУ, Харків, 2007).

Публікації. Основні матеріали дисертації викладені у монографії та 71 науко-вих публікаціях, в тому числі в 38 наукових статтях, опублікованих у фахових та академічних виданнях рекомендованих ВАК України (19 – одноосібних), та 7 авторських свідоцтв СРСР і 1 деклараційному патенті України, 25 – у матеріалах наукових конференцій і з’їздів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 354 сторінках, скла-дається з переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури (розділ 1) та експериментальної частини, що містить шість розділів, кожен з яких закінчуєть-ся висновками за результатами досліджень, загальних висновків, списку вико-ристаних джерел літератури. Обсяг основного тексту дисертації становить 309 сторінок. Додатки до дисертації оформлені у вигляді окремого тому. Список літератури включає 431 джерело. Робота ілюстрована 62 таблицями та 52 рисун-ками (45 сторінок тексту).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, сформульовані мета і завдання дослідження, визначені об’єкти, предмет і методи дослідження, наведені науко-ва новизна результатів дисертаційного дослідження, їх теоретичне та практичне значення, відомості щодо їх апробації.

Матеріали і методи дослідження

З метою одержання лектинів досліджено та використано рослини переважно Прикарпатського регіону та Карпат, а також вищі гриби Карпат та ікра риб. При цьому використано різні органи рослин – насіння, кору, надземну частину (траву або листя), підземні органи (цибулини, бульби, корені, кореневища). У вищих грибів предметом досліджень були плодові тіла. Частини рослин та плодові тіла грибів використовували свіжими або висушували при температурі до +60оС.

Виявлення лектинів здійснювали за допомогою реакції гемаглютинації або, рідше, преципітації. Реакцію пригнічення гемаглютинації і преципітації вугле-водами та глікокон’югатами використовували для визначення вуглеводної специ-фічності лектинів. Методика постановки цих реакцій описана нами раніше у ме-тодичних рекомендаціях.

Очищення лектинів з сировини виконували методами препаративної хімії біл-ків (екстракція, осадження, діаліз, центрифугування, афінна, іонообмінна та гель-хро-матографія, ліофільне висушування) .

Аналіз чистоти одержаних лектинових препаратів здійснювали методом диск-електрофорезу в ПААГ в кислій (рН 4,3) та лужній (рН 8,6) буферних системах. Молекулярну масу визначали гель-хроматографією на сефадексах G-75 – G-200 та тойоперлі HW-55. Молекулярну масу поліпептидних ланцюгів визначали методом електрофорезу в ПААГ з 0,1 % Ds-Na в присутності або у відсутності ?-меркаптоетанолу. Визначення вмісту вуглеводів у лектинах глікопротеїнової природи у більшості випадків проводили за методом Dubois et.al. (1956).

Вимірювання концентрації білка на стадіях очищення лектину проводили спектрофотометрично, за поглинанням розчину білка при 280 нм, методом Lowry et.al. (1951) та біуретовою реакцією. Для багатьох лектинів визначались межі їх стійкості у розчинах до змін рН та температури, а також необхідність іонів мета-лів для прояву активності.

Мічення лектинів для застосування їх в гістохімічних та цитохімічних дослід-женнях здійснювали шляхом приєднання пероксидази кореня хрону, ФІТЦу, ко-лоїдного золота. Мічення лектинів пероксидазою здійснювали за методикою Nakane і Kawaoi (1974), у яку нами були внесені вдосконалення, які полягали у розподілі лектинів на окремі підгрупи, що відрізнялися умовами проведення кон’югації.

Дослідження лектинових рецепторів на препаратах, виготовлених з ізольова-них клітин, зокрема у клітинах мишачої лейкемії L-1210 проводились за допо-могою фарбування лектинами, міченими пероксидазою за методикою, описаною в літературі (Цегельский и др., 1989). Нами апробована методика кріоконсерву-вання еритроцитів різних видів тварин, яка була адаптована до умов лабораторії і використана для пошуку та дослідження нових лектинів. Вона дозволяє створи-ти колекцію еритроцитів тварин різних, у тому числі рідкісних, видів і викорис-товувати їх в міру потреби, що розширює можливості пошуку нових лектинів, зокрема для потреб ізосерології та судової медицини.

Аналіз сировинної бази для одержання лектинів різної вуглеводної специфічності та біологічної активності

Найважливішою функціональною характеристикою лектинів є їх вуглеводна специфічність, яка визначає подальші перспективи практичного застосування лектинів. Тому в основі аналізу сировинної бази нами покладена вуглеводна специфічність лектинів. Як показали наші дослідження та дослідження інших авторів, у флорі України “класичні” манозо-специфічні лектини бобових містять-ся в родах Pisum L., Lens Mill., Vicia L., Lathyrus L., Galega L., Medicago L., Ono-brychis Mill., Faba Mill. В той же час в родах Phaseolus L., Genista L., Sarothamnus Wimm., Glycine Willd, Tetragonolobus Scop містяться лектини іншої вуглеводної специфічності. У родах Astragalus L., Amorpha L., Lotus L., Trigonella L., Gly-cyrriza L. лектини до цих пір не знайдені.

На початку 90-их років ХХ сторіччя було виявлено ще одну підгрупу мано-зоспецифічних лектинів, що зосереджені в амарилісових та лілійних, які відріз-нялись від лектинів бобових відсутністю взаємодії з D-глюкозою та її олігоса-харидами. Серед лектинів цієї підгрупи нами вперше було виявлено, очищено та досліджено лектини з кореневища купини багатоквіткової та кільчастої, а також лектин білоцвіту весняного. За допомогою преципітації ристоміцину сульфату було очищено лектин з насіння гледичії колючої, який взаємодіяв з 4-нітрофеніл-?—D-глюкопіранозидом та 4-нітрофеніл-?—D-глюкозамінопіранозидом, але не з широким набором інших моно- і дисахаридів, в тому числі з D-глюкозою та D-манозою. Цей лектин, разом з лектинами чотирьох видів хвощів (Equisetum ar-vense L., E. sylvaticum L., E. hyemale L., E. tempatelia Ehrh.) які, як показали наші дослідження, є специфічні до 4-нітро-фенільних та фенільних похідних D-глю-копіранози, можуть репрезентувати нову підгрупу манозоспецифічних лектинів.

При пошуку сіалоспецифічних лектинів серед рослин нами було виявлено та-кий лектин у кореневищі купини багатоквіткової (лілійні) та в інших рослинах цієї родини. Однак, подальші дослідження цих лектинів показали, що значно кра-щим інгібітором їх активності є хітинові олігосахариди і вони близькі за власти-востями до лектину зародків пшениці. Лектини подібної специфічності були на-ми очищені з плодових тіл гриба дубовика оливково-бурого та з трави трьох видів нечуй-вітрів (айстрові). Це дозволило віднести їх до хітинозв’язуючих лектинів, які, як виявилось, значно ширше зустрічаються в природі і не належать лише до декількох родин вищих рослин.

Особливу увагу в роботі приділено пошуку нових L-фукозоспецифічних лек-тинів. Це порівняно нечисленна група серед інших вуглеводозв'язуючих білків. Для прикладу, раніше нами було обстежено 401 орган, що належить 282 видам вищих рослин. Лектини були виявлені у 150 органах (37,4 %) 111 видів рослин. Серед них фукозоспецифічні лектини були знайдені у 6 органах 5 видів (4 %). Найчисленнішими були D-галактозоспецифічні лектини (37 %) і лектини, що не мали специфічності до моносахаридів (34 %). Аналіз існуючих даних літератури та власні дослідження засвідчили, що є окремі родини рослин, грибів і тваринних організмів, де L-фукозоспецифічні лектини зустрічаються частіше. Серед вищих рослин їх можна шукати в родині бобових в родах Laburnum, Sarothamnus, Tetra-gonolobus, Ulex. У грибів фукозоспецифічні лектини знайдені серед представни-ків класу сумчастих (аскоміцетів) – Ascomycetes, зокрема, у представників по-рядку пецицієвих (Pezizales). Поряд з раніше очищеними лектинами з плодових тіл алеврії оранжевої (Aleuria aurantia), та Melastiza chateri, нами вперше вияв-лені та очищені лектини з пецици коричнево-каштанової (Peziza badia), пецици пухирчастої (Peziza verticillata) та пецици фіолетової (P. violacea Fr.) L-фукозо-специфічні лектини знайдені у представників родини окуневих (Percidae), зокре-ма, в ікрі окуня та судака. З ікри окуня нами вперше крім L-фукозоспецифічно-го, очищено ізолектин, який є високоспецифічним до целобіози.

Зважаючи на широке розповсюдження в природі і велику кількість лектинів з різними біологічними властивостями, група D-галактозоспецифічних лектинів вимагала детальнішої класифікації. Проф. Альбертом Ву (1991, 2003) була запро-понована класифікація цих лектинів на основі взаємодії їх з дисахаридами. Вона була застосована нами при характеристиці сировинних джерел лектинів у моно-графії “Лектини та їх сировинні джерела”. Нами вперше було очищено та досліджено ряд лектинів цієї групи, зокрема, з кори саротамнуса віникового та карагани деревоподібної, робінії несправжньої, насіння амаранта хвостатого, з плодових тіл гриба саркосцифи яскраво-червоної.

Нами запропоновано новий метод очистки гемолітичного лектину (фалолізи-ну) з плодових тіл блідої поганки, який можна віднести до поки нечисленної гру-пи цитолітичних біфункціональних лектинів. Показано, що фалолізин-індукова-ний гемоліз повністю пригнічується поліетиленгліколем-1350 і не пригнічується в присутності ПЕГ-400 і ПЕГ-600. Це дало можливість обчислити діаметр “ді-рок”, які робить фалолізин у мембранах еритроцитів (1,6 – 2,3 нм) та визначити його вуглеводну специфічність, так як присутність ПЕГ-1350 не впливала на титр гемаглютинації і на взаємодію з вуглеводами.

Зміни активності лектинів у рослин. Досліджено якісні та кількісні зміни у активності лектинів протягом річного життєвого циклу рослин. Було виявлено такі загальні закономірності у змінах активності лектинів у річному циклі роз-витку рослин:

- в насінні активність лектинів зростає в міру їх дозрівання;

- у корі деревних і кущових видів рослин активність лектинів непостійна і зростає під час весняного сокоруху, досягаючи максимуму в момент розпус-кання бруньок листків, або в деяких рослин в моменти максимального росту суцвіть. У літній період активність лектинів в корі є найнижчою, а далі зростає до моменту дозрівання насіння, залишаючись на високому, відносно постійному рівні в зимовий період;

- з ростом листків активність лектинів у них знижується, а з початком їх повноцінного функціонування вона зростає, залишаючись на відносно постій-ному рівні протягом літа і знижується восени;

- різні вегетативні органи рослин можуть містити лектини неоднакової вуг-леводної специфічності. Окрім того, один і той же орган рослини може містити декілька лектинів;

- у деяких рослин у різні періоди вегетації екстракти одного і того ж органу мо-жуть проявляти різну вуглеводну специфічність.

Різниця у титрах гемаглютинації екстрактів органів рослин, зібраних в різні фази вегетації дуже значна і часом сягає трьох порядків. Наприклад, для екст-ракту кори Robinia pseudoacacia в момент розкриття бруньок сягає 1:2048, а в фазі повного цвітіння - 1:2. Очевидно тому в рослинах з незначною активністю лектинів їх можна виявити лише в період їх максимальної активності. Що це дійсно так, ми переконались на прикладі низки трав’янистих рослин. Зокрема, у видів нечуй-вітру, полину гіркого і звичайного, ромашки без’язичкової та деяких інших рослин родини складноцвітих (айстрових) лектини виявляються лише весною під час їх інтенсивного росту.

Очищення лектинів та їх характеристика

Для очищення лектинів різної вуглеводної специфічності нами було одержано ряд афінних сорбентів на основі природних полісахаридів та глікопротеїнів. Для очищення глюкозоспецифічних лектинів з насіння гороху, сочевиці, вики посів-ної, кінських бобів, видів чини нами одержано сорбент на основі поперечно-зшитого крохмалю, який за гідродинамічними та сорбційними властивостями може бути замінником імпортних сефадексів G-100 – G-200. Гель можна вико-ристовувати багаторазово, він добре зберігається у присутності 10 % дiоксану або консервантів — азиду натрію чи мертіолату. Для очищення манозо-специфічних лектинів амарилісових та деяких лілійних нами було одержано та випробувано декілька різних сорбентів, зокрема “овогель”, тиреоглобулін, іммо-білізований на агарозі, дріжджовий манан, іммобілізований на агарозі або співполімер крохмального гелю та дріжджового манану. Найкращим з випро-буваних сорбентів виявився останній. Цей сорбент може бути використаний для очищення манозоспецифічних лектинів з цибулин або надземної частини амарилісових та лілійних, зокрема підсніжника (Galanthus nivalis L.), білоцвіту весняного (Leucojum vernum L), видів нарцису (Narcissus sp.), крокуса весняного (Crocus vernus ), кореневища купини багатоквіткової (Polygonatum multiflorum /L./All.) тощо.

Для очищення N-ацетил-D-глюкозамінспецифічних, D-галактозоспецифічних та ряду N-ацетил-D-галактозамінспецифічних лектинів нами використовувались одержаний М.Д. Луциком (1984), та нами гелі на основі глікопротеїнів курячого яйця, які взаємодоповнювали один одного. Зокрема, останній сорбент було використано для очищення лектину з насіння Amaranthus caudatus, A. retroflexus, A. albus, кори робінії звичайної, карагани деревовидної, бульб картоплі.

Фукогалактоманан трутовика Phellinus igniarius (Fr.) Quell., іммобілізований на агарозі, використано для очищення фукозоспецифічного лектину з гриба алев-рії оранжевої. Для очищення лектинів з ікри окуня та судака ми застосовували сорбент, виготовлений шляхом співполімеризації групоспецифічної речовини Н (О) крові людини з 6 %-ною агарозою.

У деяких живих організмів нами було виявлено декілька різних лектинів, які відрізняються вуглеводною специфічністю і представляють практичний інтерес. Так, у кореневищі купини багатоквіткової містяться манозо- та хітобіозоспеци-фічні лектини, які було очищено з використанням послідовно афінної хрома-тографії на двох різних сорбентах. З ікри окуня два ізолектини було одержано за допомогою афінної елюції спочатку целобіозою, а потім L-фукозою. З кори карагани деревоподібної два ізолектини одержано іонообмінною хроматогра-фією на ДЕАЕ-целюлозі.

Застосування афінної хроматографії відкриває можливості до комплексного і більш раціонального використання сировини, що часто було неможливим при застосуванні інших методів очистки. Нами була розроблена схема одержання фітину і аглютиніну зародків пшениці в одному технологічному циклі.

Фізико-хімічні властивості очищених лектинів. Нами вперше виявлено, очищено та досліджено основні фізико-хімічні властивості та вуглеводну специ-фічність 17 лектинів, ряд характеристик яких представлені в табл. 1. Ще 10 лек-тинів були очищені афінною хроматографією і досліджена їх вуглеводна специфічність, але молекулярна маса і структура молекули не досліджувалась.

Серед лектинів, наведених в табл. 1 найбільше специфічних до L-фукози та до олігомерів N-ацетил-D-глюкозаміну. Це пояснюється спрямованістю пошуку: шукали і досліджували насамперед лектини рідкісної вуглеводної специфічності, до яких належать L-фукозоспецифічні та сіалоспецифічні. Однак, знайдені нами рослинні лектини, що взаємодіяли з сіаловою кислотою, ще краще взаємодіяли з олігомерами N-ацетил-D-глюкозаміну (рис.1), нагадуючи тим самим аглютинін зародків пшениці. Такі лектини були знайдені в пло-дових тілах гриба-дубовика, у низці рослин родини лілійних та айстрових. Незалежно від знаходження, такі лектини мали подібну будову молекули, молекулярну масу і характеризувались підвищеною стійкістю до кис-лого середовища. Широка розповсюдженість лектинів подібного типу може свідчити про їх важливу фізіо-логічну роль у життєдіяльності рослин і грибів.

Рис. 1. Відносна інгібіторна сила взаємодії лектину купини багатоквіткової (PMRL-) з вуглеводами. За одини-цю прийнята сила взає-модії NAcDGlc (1); 2 –NANA (1,3); 3 - ?-phe-NАcDGlc (6,6); 4 –N,N'-диацетилхітобіоза (20); 5 --нітрофеніл-NАcDGlc (47); 6 -N,N'-диацетилхітобіозил-Asp (47,6); 7 -N,N',N",N"'-тетрааце-тилхітотетраоза (200).

Таблиця 1

Молекулярна маса, структура молекули та найсильніший інгібітор активності вперше очищених лектинів

Джерело одержання лектину | Мол. маса

(в кДа) | Структура молекули | Найсильніший інгібітор активності

Кореневище купини багато-квіткової (Polygonatum multiflorum) | 56 | ?= 14, ?4 | Дріжджовий манан

56 | ?= 14, ?4 | N,N',N",N"'-тетрааце-тилхітотетраоза

Кореневище купини кільчас-тої (Polygonatum verticillatum) | 56 | ?= 14, ?4 | Дріжджовий манан

Кореневище воронячого ока звичайного (Paris quadrifolia) | 50

102 | ?= 12,8 ?=11,5

?2?2 | NANA

Трава нечуй-вітру оранже-вого (Hieracium aurantiacum) | 36 | ?= 18; ?2 | N,N',N",N"'-тетра-ацетилхітотетраоза

Трава нечуй-вітру волосис-того (Hieracium pilosella) | 36 | (?= 18; ?2 | N,N',N",N"'-тетра-аце-тилхітотетраоза

Трава нечуй-вітру лісового (Hieracium sylvularum) | 36 | ?= 18; ?2 | N,N',N",N"'-тетра-ацетилхітотетраоза

Плодові тіла дубовика олив-ково-бурого (Boletus luridus) | 38 | ?= 19; ?2 | N,N',N",N"'-тетра-ацетилхітотетраоза

Плодові тіла пецици коричне-во-каштанової (Рeziza badia) | 50 | ?= 25; ?2 | L-фукоза

Ікра окуня (Perca fluviatilis) |

50 | ?= 12,5 ?=13

?2?2 | L-фукоза

50

100 | ?= 12,5 ?=13

?2?2, (?2?2)2 | Целобіоза | Ікра судака (Lucioperca lucioperca) | 50 | (?= 12,5 ?=13

?2?2 | L-фукоза

Насіння щириці хвос-татої (Amaranthus caudatus) | 68 | (?= 24 ?=10

?2?2 | N-ацетил-D-галак-тозамін

Плодові тіла саркосцифи (Sarcoscypha coccinea) | 128 | (32+33)2 | 4-нітрофеніл-?-D-галактопіранозид

Насіння каштану кінського (Aesculus hippocastanum ) | 132 | ?= 33; ?4 | Фетуїн теляти

Насіння гледичії колючої (Gleditsia triacanthos) | 32 | ?= 16; ?2 | 4-нітрофеніл-?-D-глюкопіранозид

Так само, порівнюючи L-фукозоспецифічні лектини ікри окуня, судака, плодо-вих тіл грибів порядку пецицієвих та кори золотого дощу звичайного, які відно-сяться до віддалених у еволюційному плані організмів, можна зробити заклю-чення про близькість значень їх молекулярної маси та молекулярної структури. Звертає на себе увагу наявність в ікрі окуня а також у насінні та корі золотого дощу звичайного двох пар аналогічних за імунохімічними властивостями ізоформ лектинів, що мають ідентичну молекулярну масу та подібну структуру молекули.

Дослідження біологічної активності лектинів

Токсичність лектинів для нормальних і пухлинних клітин. Дослідження проведені разом з співробітниками Інституту біології клітини НАН України на культурі пухлинних клітин з використанням одержаних нами лектинів показали їх неоднакову токсичність до клітин різних ліній. Наприклад, цитоморфологіч-ними методами досліджено механізм загибелі культур пухлинних клітин при дії лектинів купини багатоквіткової і RCA-120 (аглютинін насіння рицини). Було виявлено, що клітинам А-549 аденокарциноми легень людини властива підвище-на чутливість до цитотоксичного впливу лектину купини PMRL+, що характери-зується зростанням кількості апоптотичних та загиблих клітин. В той же час, цей лектин практично не діє на клітини ліній НЕр-2 та НЕр-2Е7. Клітини ліній НЕр-2 та НЕр-2Е7 були більше чутливі до впливу RCA-120, ніж до дії лектинів купини PMRL+та PMRL-.Водночас, лінія НЕр-2 чутливіша від НЕр-2Е7 до цитотоксично-го впливу лектину купини PMRL-.

Вивчено також токсичну дію ряду лектинів на клітини лейкемії миші лінії L 1210 з нормальною чутливістю, та клітини сублінії L1210/R., які характеризу-ються підвищеною резистентністю до дії протипухлинного препарату циспла-тини. Результати цих досліджень представлені в табл. 2.

Таблиця 2

Концентрація лектинів, що викликає загибель 50% клітин (IC50)

через 48 годин культивування на поживному середовищі

№ п/п | Лектин, доданий до середовища | Значення IC50 для клітин

(в мкг/мл)

L 1210 | L1210/R

1 | PQRL | 50 | 90

2 | WGA | 2 | 10

3 | PMRL- | 1,5 | 9

4 | VAA-1 | 0,005 | 0,5

5 | RCA-120 | 0,002 | 0,1

6 | RPBA | >100 | 10

7 | Con A | 10 | 95

8 | SNA | >100 | >100

9 | LVA | >100 | >100

Цікавим є те, що на відміну від більшості лектинів, лектин з кори Rоbіпіа рsеиоасасіа володіє вищою токсичністю до клітин сублінії L1210/R (резистентних), ніж до клітин L 1210 (чутливих). Останнє спостереження може бути експеримен-тальним підґрунтям при розробці нових підходів у подоланні набутої резистент-ності злоякісних клітин до протипухлинного препaрату цисплатину.

Дія лектинів на жуків та нематод. На початок 90-х років ХХ сторіччя стало зрозумілим, що лектини відіграють важливу роль у процесах розпізнавання у різноманітних біологічних системах. У рослинах результатом такого розпізна-вання може бути захист від шкідливих бактерій, комах і хижих тварин або сим-біоз між азот-фіксуючими бактеріями і кореневими волосками бобових рослин. Дійсно, виконано ряд робіт, в яких описано інсектицидну дію WGA, лектину кропиви, підсніжника, Griffonia simplicifolia-лектину-ІІ тощо [Huesing e. a., 1991; Setamou e. a., 2003; Zhu e. a. 1996].

Нами досліджено дію ряду токсичних і нетоксичних лектинів на ріст і розви-ток деяких нижчих тваринних організмів, зокрема, колорадських жуків Leptino-tarsa decemlineata та нематод Саепоrhabditis е1еgапs. Одержані результати свід-чать про можливу захисну функцію лектинів в рослинних організмах та ікрі риб.

Зокрема, в результаті проведених експериментів було встановлено, що одно-кратне згодовування рицином є достатнє для повної загибелі личинок колорадсь-ких жуків. Лектин омели є менш токсичним і при однократному годуванні личин-ки гинули на 1-2 доби пізніше, ніж при годуванні рицином, а повна загибель ли-чинок спостерігалась лише тоді, коли вони споживали лектин кожен день. Інші випробувані лектини (гороху, ФГА-Е, підсніжника і білоцвіту) також негативно впливали на розвиток жуків, однак їх токсичний вплив був дещо меншим.

Усі випробувані лектини (еритроаглютинін квасолі звичайної, ФГА-Е), лектин насіння гороху (РSL), фукозоспецифічний лектин ікри окуня (РFА-L), аглютинін зародків пшениці (WGА), токсин насіння рицини (рицин, RС-60) виявились ток-сичними для нематод Caenorhabditis elegans. Серед них рицин, PSL та PFA-L в дозі 200 мкл 1 % -ного лектину на чашку Петрі приводили до повної загибелі не-матод. ФГА-Е та WGA володіли дещо меншою токсичністю. Однак, найцікавішим результатом цих досліджень є те, що відносно нетоксичні лектини для ссавців виявились високотоксичними для жуків і нематод.

Переважна асоціація лектинів з тими частинами рослин, які є найбільш чутли-вими до нападу чужорідних організмів, є аргументом на користь захисної ролі лектинів. Органи, що накопичують запасні речовини, перш за все насіння, особ-ливо уразливі, тому що вони найбільш привабливі для потенційних паразитів і хижаків. Приймаючи до уваги еволюційну адаптацію рослин, можна припустити, що вони розвинули пасивні системи захисту запасних органів і насіння. З цього погляду переважне нагромадження лектинів у типових запасаючих органах є показовим.

Нематоди, які відносяться до первиннопорожнинних червів, часто є паразита-ми рослин і тварин. Тому очевидно, деякі з рослин, а також можливо, ікра риб, у процесі еволюції розвинули захисні механізми проти них. Проведені експери-менти свідчать, що лектини можуть претендувати на роль молекул, які обумов-люють захист рослин, а також ікри риб від паразитарних червів.

Дослідження можливостей практичного застосування лектинів у фармації, медицині та біології

Лектини в дослідженні глікокон’югатів. За допомогою лектинів можна вивчати глікокон’югати як на поверхні клітин, так і використовуючи їх в чисто-му вигляді. Інформацію про наявність тих чи інших вуглеводів на клітинній по-верхні дає селективна аглютинація та цито- та гістохімічні методи візуалізації лектинових