МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ

ОСВІТИ імені П.Л. ШУПИКА

ДУБІНІНА ВЛАДЛЕНА ГЕННАДІЇВНА

УДК 618.145-006-07

ПРОГНОЗУВАННЯ ТА РАННЯ ДІАГНОСТИКА ПУХЛИННИХ ЗАХВОРЮВАНЬ ЕНДОМЕТРІЯ

14.01.01 – акушерство та гінекологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ– 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий консультант доктор медичних наук, академік АМН України, професор Запорожан Валерій Миколайович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри акушерства та гінекології № 

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, чл.-кор. АМН України, професор Маркін Леонід Борисович, Львівський державний медичний університет
імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри акушерства та гінекології № 

доктор медичних наук, професор Вовк Іраїда Борисівна, Державна установа „Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України”, керівник відділення планування сімґї та статевого розвитку дітей та підлітків

доктор медичних наук, професор Камінський В'ячеслав Володимирович, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика
МОЗ України, завідувач кафедри акушерства, гінекології та репродуктології

Захист відбудеться “07” грудня 2007 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.02 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (04112, м. Київ,
вул. Дорогожицька, 9)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (04112,
м. Київ, вул. Дорогожицька, 9)

Автореферат дисертації розіслано “06 ” листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д.мед.н., професор Т.Г.Романенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день рак тіла матки (РТМ) є найбільш частою інвазійною злоякісною пухлиною жіночого генітального тракту в розвинутих країнах (Бохман Я.В., 1992; Коханевич Є.В. 1998; Воробйова Л.І., 2005; Запорожан В.М., 2005; Козаченко В.П., 2005; Щепотін І.Б., 2006; Moore M.M., 1998). Найбільш високі показники захворюваності на РТМ на 100 тис. населення зареєстровані в Італії (16,5), США (15,5), Швеції (15,2), Фінляндії (14,2) (Ferley G., 2001). Стандартизований показник захворюваності на РТМ у Великій Британії виріс з 14,3 до 15,3 з 1999 р. по 2002 р. (George L., 2002). З 1998 р. по 2004 р. в Україні спостерігається ріст показника захворюваності РТМ з 14,9 до 25,7 на
100 тис. населення, в Одеській області має місце аналогічна тенденція (з 23,2 до 29,9 на 100 тис. населення) (Воробйова Л.І., 2005; Запорожан В.М., 2005; Щепотін І.Б., 2006). Незважаючи на численні дослідження, спрямовані на вивчення етіології і патогенезу передракової патології та РТМ у більшості країн світу, число хворих на рак даної локалізації продовжує неухильно зростати (Коханевич Є.В., 1999; Запорожан В.М., 2005; Classbum J.R., 1995; Emons G., 2000). Протягом останніх 10 років значно знизився середній вік пацієнток з уперше виявленим РТМ, дозволивши ряду авторів говорити про феномен “омолодження” цієї патології (Неспрядько С.В., 2000; Венцківський Б.М., 2002; Чайка В.К., 2003; Dahlgren E. et al., 1996). У Росії за 10-річний період (1989-1998) захворюваність у віковій групі до 29 років зросла на 47, причому 10 від загальної кількості захворілих на РТМ становлять пацієнтки віком до 40 років. Значні темпи приросту захворюваності на РТМ спостерігаються у вікових групах 40-49 років (на 12,3) і 50-56 років (на 15,6) (Чіссов В.І.,2000; Козаченко В.П., 2005). Обтяжливим є факт відсутності достовірного неінвазійного скринінгового методу діагностики пухлинної патології ендометрія, що був би простим у виконанні і рівноцінним за точністю, наприклад, цитологічному дослідженню раку шийки матки (Берштейн Л.М., 2005; Махсон А.Н. и соавт., 2005). Незважаючи на існуючий комплекс заходів з вторинної профілактики раку, дотепер все ще не створена навіть теоретична модель загальної системи ранньої діагностики і профілактики РТМ по причині полігенної природи пухлин ендометрія, що унеможливлює індивідуальне прогнозування виникнення і перебігу захворювання (Адамян Л.В., 1998; Антипова С.В., 2001; Сметник В.П., 2001; Чернуха Г.Е., 2003). Задачі, пов’язані з розробкою нових технологій ранньої діагностики і профілактики раку органів жіночої репродуктивної системи, набувають першорядного значення в усьому світі (Акуленко Л.В., 2005). Подолати дану проблему дозволяє генотипування пухлин шляхом застосування високопродуктивних скринінгових тестів, що здатні одночасно виміряти картину експресії і присутність специфічних мутацій у тисячах індивідуальних генів з урахуванням популяційних особливостей (Баришніков А.Ю., 2005; Берштейн Л.М., 2005; Козаченко В.П., 2005; Хансон К.П., 2005). Зменшити індивідуальний ризик розвитку злоякісної патології можна шляхом виявлення індивідуумів з підвищеним генетичним ризиком розвитку раку, аналізу генів метаболізму канцерогенних речовин і генів репарації ДНК, а також уроджених мутацій у генах-супресорах, онкогенах (Запорожан В.М., 2003; Хансон К.П., 2005). Незважаючи на часткову реалізацію заходів державної програми “Онкологія 2002-2006 рр.”, затверджену Кабінетом Міністрів 29 березня 2002 р. (№ ), а також формування Концепції загальнодержавної програми боротьби з онкологічними захворюваннями на 2007-2016 рр. (розпорядження Кабінету Міністрів України від 10 липня 2006 р. № р), у доступній літературі дані щодо проведення подібних досліджень у нашій країні відсутні. Отже, дослідження генетичного профілю пацієнток з пухлинною патологією ендометрія на різних етапах її формування з урахуванням стану основних регуляторних систем організму, факту сімейної онкообтяженості і популяційних особливостей генома є актуальним у світлі пошуку індивідуальних критеріїв прогнозування виникнення пухлинного процесу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконане дослідження є фрагментом науково-дослідної роботи Одеського державного медичного університету МОЗ України “Молекулярно-генетичні та екологозалежні механізми розвитку пухлин репродуктивної системи: шляхи удосконалення діагностики, лікування і профілактики” (№ держреєстрації 0102U006588). Дисертант є співвиконавцем цієї роботи.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є підвищення ефективності індивідуальної профілактики і прогнозування виникнення пухлинних захворювань ендометрія у жінок зі спадковою детермінацією та хворих з верифікованою патологією ендометрія, а також формування теоретичної бази впровадження молекулярно-генетичних методів як фундаменту моделі загальної системи ранньої діагностики і профілактики онкозахворювань.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Об’єкт дослідження: пухлинні захворювання ендометрія.

Предмет дослідження: стан тканинних регуляторів та рецепторного апарату ендометрія, показники клітинного імунітету, гормональний профіль, стан хромосомного апарату, зміни в основних групах генів та саногенетичний профіль у хворих з різними видами пухлинної трансформації ендометрія.

Методи дослідження: загальноклінічні, функціональні, лабораторні, генеалогічні, інструментальні, морфологічні, імуногістохімічні, цитогенетичні, імунологічні, імуноферментні, молекулярно-біологічні, статистичні, біофізичні.

Наукова новизна отриманих результатів. На підставі проведених комплексних досліджень вперше запропоновані тканинні маркери для прогнозу ймовірності малігнізації пухлинної патології ендометрія.

Вперше на основі порівняльного аналіза показників клітинного імунітету у групах хворих із різними видами пухлинної трансформації ендометрія запропоновано індекс пухлиноспецифічної реактивності (ІПР), як критерій прогнозу розвитку злоякісної трансформації слизової оболонки матки.

Вперше проведено порівняльний аналіз гормонального статусу пацієнток з різними гістологічними формами трансформації ендометрія і корелятивний аналіз їх гормонального та імунного статусу.

Вперше проведено порівняльний аналіз родоводів пацієнток з різними формами трансформації ендометрія і результатів цитогенетичного дослідження лімфоцитів периферичної крові з урахуванням наявності чи відсутності онкообтяженості.

Вперше у хворих з обтяженим онкоанамнезом виявлено 4 нових фрагільних (ламких) сайти (раніше не описаних в літературі), що є відображенням процесу дестабілізації генома.

Вперше проведено секвенування поліморфних внутрішніх простих повторюваних послідовностей ДНК (ISSR) з метою визначення порушень їх повторів як найбільш ефективного маркера ранньої діагностики пухлин.

Вперше на підставі аналізу генів детоксикації, генів стероїдогенезу, генів репарації, онкогенів, генів – супресорів пухлинного росту, генів стероїдних рецепторів, гену інтерлейкіну-6 у хворих на РТМ встановлено їх популяційний поліморфізм і різноманітність структурних та функціональних порушень.

Вперше запропоновано концепцію патогенетичного підходу до лікування пацієнток з різними видами пухлинної трансформації ендометрія на підставі оцінки їх індивідуальних санотипів.

Вперше обґрунтовано необхідність розробки та впровадження в Україні повногеномної ДНК-чипової діагностики пухлин з урахуванням популяційного поліморфізму з метою предиктивного тестування для поліпшення результатів профілактики і ранньої діагностики пухлинної патології ендометрія.

Науковий пріоритет за визначеними напрямками закріплено у 6 патентах на винахід.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонована і впроваджена у практику індивідуальна, ефективна у прогностичному плані методика оцінки імунного статусу пацієнтки шляхом обчислення індексу пухлиноспецифічної реактивності. Розроблені і впроваджені у практику методи прогнозування виникнення пухлинної патології ендометрія і результатів її лікування на підставі аналізу імуногістохімічних характеристик тканини. Запропоновано і впроваджено у практику методику виявлення груп високого ризику розвитку спадкового і спорадичного раку ендометрія на підставі проведеного цитогенетичного аналізу фрагільних сайтів хромосом лімфоцитів периферичної крові хворих на пухлинні захворювання ендометрія з урахуванням наявності або відсутності онкологічної обтяженості. Вперше запропоновано методику визначення нестабільності мікросателітних повторів у геномі в ролі маркерів канцерогенезу. Вперше запропоновано методику пошуку нових ділянок ДНК, відповідальних за розвиток пухлинної патології ендометрія, за допомогою секвенування поліморфних внутрішніх простих повторюваних послідовностей (ISSR), порушення повторів яких є найбільш ефективним маркером ранньої діагностики пухлин. Вперше у практиці клінічної діагностики в Україні створено параметри повногеномного ДНК-мікрочипа, який може використовуватися для предиктивного моніторингу пухлинних захворювань ендометрія, що у подальшому повинно враховуватися при удосконаленні загальноприйнятих скринінгових заходів.

Теоретичні положення і практичні рекомендації дисертаційної роботи використовуються на лекціях для студентів, лікарів-інтернів, лікарів акушерів-гінекологів, курсантів. Результати досліджень впроваджені в роботу гінекологічних та ендохірургічних відділень лікарень м. Одеси: МКЛ № , Університетської клініки ОДМУ, Одеського обласного онкологічного диспансеру, Одеської обласної клінічної лікарні, Військового медичного клінічного центру Південного регіону, НДІ молекулярно-генетичної та клітинної медицини МОЗ України, пологових будинків № та № м. Одеси.

Особистий внесок здобувача. Здійснено патентно-інформаційний пошук, визначено мету і завдання дослідження, відпрацьовано профіль досліджень, зібрана основна частина клінічного матеріалу, виконана переважна частина діагностичних та лікувальних заходів. Відпрацьовано методики забору матеріалу і методики досліджень, які в Україні проводилися вперше. Виконано статистичну обробку результатів дослідження, оформлено таблиці та графіки, сформульовано висновки, опубліковано основні положення роботи, сформульовані та підготовлені матеріали для отримання патентів. Автор висловлює подяку за співробітництво колективу НДІ молекулярно-генетичної та клітинної медицини МОЗ України (керівник – провідний науковий співробітник, к.мед.н. Бубнов В.В.).

Апробація результатів дослідження. Матеріали дослідження доповідалися на III науково-практичній конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2002); 1st World congress of World Association of Reproductive Medicine “New advances in reproductive technologies and genetics” (Italy, Sabaudia, 2002); науково-практичній конференції “Актуальні питання сучасного акушерства” (Тернопіль, 2003); IV Всеукраїнській конференції з гінекологічної ендоскопії (Одеса, 2003); III з’їзді онкологів та радіологів країн СНД (Білорусь, Мінськ, 2004); науково-практичній конференції “Вагінальна хірургія – сьогодні і завтра” (Вінниця, 2005); на засіданнях та днях спеціаліста Одеського та Львівського обласних товариств акушерів-гінекологів.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 44 наукових роботи, в тому числі статей у профільних виданнях, ліцензованих ВАК України – 29, тез – 8; отримано 6 патентів України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 380 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 49 таблицями та 53 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, п’яти розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій і списку використаної літератури, що нараховує 582 джерела, з яких 269 вітчизняних і російськомовних та 313 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. За період з 2001 по 2006 р. у гінекологічному відділенні Одеського обласного онкологічного диспансеру, а також у відділенні інвазивних методів діагностики і лікування Університетської клініки Одеського державного медичного університету під наглядом перебували 260 пацієнток репродуктивного віку з гістологічно верифікованою пухлинною патологією слизової оболонки матки, що проходили обстеження і лікування на зазначених клінічних базах. Мінімальний вік відповідав 18 рокам, максимальний – 44. Середній вік хворих склав 35,7±3,2 роки. Дослідження виконані у відповідності до сучасних біоетичних вимог щодо поінформованої згоди да конфіденційності особистих медичних даних (протокол засідання Комісії з питань біоетики Одеського державного медичного університету № В від 23.02.2007 р.).

У відповідності з наведеними класифікаціями усі пацієнтки з гістологічно верифікованою пухлинною патологією ендометрія були поділені на чотири групи.
У першу групу дослідження ввійшли 80 пацієнток із залозистою гіперплазією ендометрія (проста гіперплазія), другу групу склали 70 жінок із залозисто-кістозною гіперплазією ендометрія (складна гіперплазія), 50 хворих з атиповою гіперплазією ендометрія (як простою, так і складною) були віднесені до третьої групи. Четверту групу склали 60 пацієнток з морфологічно верифікованим раком тіла матки. У п’яту групу (контролю) увійшли 100 практично здорових жінок, що проходили обстеження за програмою “Безплідність” для підготовки до екстракорпорального запліднення.

Оцінка клініко-анамнестичних характеристик у досліджуваних групах здійснювалася згідно зі шкалою факторів ризику розвитку патології ендометрія (шкала Кульбака).

Обстеження та лікування хворих здійснювалося згідно наказу № МОЗ України від 29.12.2003 р. та наказу № від 31.12.2004 р. “Про затвердження клінічних протоколів з акушерської та гінекологічної допомоги” (частина 2,
пункт 13). Ендоскопічні втручання проводили за типовою методикою (J. Phillips, 1991) на обладнанні виробництва Karl Storz (Німеччина).

Клініко-генеалогічний метод. На кожну хвору заповнювалася клініко-генеалогічна карта згідно з методикою, запропонованою Бажорою Ю.І. і співавт. (2001). Агрегацію пухлинної патології в родинах пробандів оцінювали за методикою Акуленко Л.В. і співавт. (2000).

Морфологічний метод. Дослідження видалених зразків проводили за стандартною методикою Ліллі Р.Д. (1969).

Імуногістохімічний аналіз зразків ендометрія проводили за допомогою наборів антитіл фірми DAKO Cytomation (Данія) згідно протоколу, запропонованого фірмою-виробником.

Цитогенетичний метод. Для культивування лімфоцитів периферичної крові використовували напівмікрометод, запропонований Захаровим А.В. і співавт. (1982). Хромосомний аналіз проводили на системі каріотипування MetaSystems (Німеччина) з використанням програми “Ikaros”.

Імунологічний метод. Імунофенотипування лімфоцитів периферичної крові проводилося відповідно до інструкцій фірм-виробників моноклональних антитіл Caltag Laboratories Inc. (США) та проточного цитометра GALAXY фірми DAKO (Данія).

Методики оцінки стану генетичного апарату пацієнток:

Виділення ДНК здійснювали зі зразків венозної крові, нормальної та патологічно зміненої тканини ендометрія за допомогою протеїнази К, згідно рекомендаціям Maніатіс Т. (1984). Кількість і якість виділених препаратів ДНК оцінювали електрофорезом в агарозному гелі за допомогою системи відеодокументації Imago та спектрофотометрично за допомогою спектрофотометра MicroWave –X, Biotech (Німеччина).

Ампліфікацію ДНК проводили з SSR та ISSR праймерами. Для ампліфікації використовували прилад Primus (MWG, Німеччина) та iCycler (Bio-Rad, Німеччина). За допомогою градієнтного блоку для ПЛР (іСycler, Bio-Rad, Німеччина) були відпрацьовані умови гібридизації праймерів з матрицею ДНК та концентрація іонів Мg2+ для досліджуваних праймерів. Продукти ампліфікації фракціонували електрофорезом в агарозних та поліакриламідних гелях. Фрагменти ДНК в гелі забарвлювали бромистим етидієм, або AgNO3 за Maniatis Т. (1984).

Фрагментний аналіз проводили на секвенаторі MWG Biotech (Німеччина) згідно інструкції до прибору.

Секвенування ДНК проводили за допомогою реактивів Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit Amersham Pharmacia Biotech Inc. (Німеччина) на секвенаторі MWG Biotech (Німеччина). Документування та аналіз результатів здійснювалися за допомогою комп’ютерної програми MWG “Sequence Analysis”.

Аналіз промоторного регіону гена IL-6 здійснювали піросеквенуванням на піросеквенаторі PSQ 96MA (Pyrosequencing AB) згідно з інструкцією виробника.

Оцінку саногенетичного стану організму на основі аналізу регуляторних процесів провідних саногенетичних систем (Комаров Г.Д. і співавт., 2001, Носкін Л.А. і співавт., 2005) проводили за допомогою спіроартеріокардіоритмографа (САКР) та комп’ютеризованого вимірювача рухів (КВР-3), рекомендованих до застосування в медичній практиці згідно з протоколами № 2 від 9.07.03 та № від 11.09.02 відповідно. Виробник пристроїв – ООО “Интокс”, Росія.

Статистична обробка проводилася методами дисперсійного та кореляційного аналізу. На всіх етапах проведення статистичного аналізу для підготовки первинних таблиць спряженості та групування ознак використовувалися стандартні функції пакету Excell 7.0. Визначення критеріальних значень та основні обчислення проводилися за допомогою статистичних пакетів програми Statistica 6.0.

Результати досліджень та їх обговорення. Порівняльний аналіз основних клініко-анамнестичних характеристик, а також факторів ризику розвитку патології ендометрія серед досліджуваних жінок показав наявність достовірних відмінностей між групами пацієнток з різними варіантами пухлинної патології ендометрія і практично здоровими пацієнтками за критерієм екологічно несприятливих умов виробничого середовища. На факт роботи з хімічно шкідливими виробничими речовинами вказували 8 (10,0) і 6 (8,7) жінок I і II груп відповідно, при цьому в III і IV групах даний показник був достовірно вищим (16,0 і 15,0 відповідно), а в контрольній групі достовірно нижчим – 1 жінка (1,0). Несприятливі умови праці з перевтомою відзначали 43 (53,8), 32 (45,7), 28 (56,0), 25 (41,7) і
46 (46,0) пацієнток першої, другої, третьої, четвертої та п’ятої груп відповідно. Отримані нами результати узгоджуються із даними ряду вітчизняних і зарубіжних авторів про те, що професійні шкідливості є одним із найбільш значущих факторів ризику виникнення і розвитку усякої дизрегуляційної патології, у тому числі і пухлинних захворювань ендометрія. Аналіз анамнестичних характеристик пацієнток досліджуваних груп достовірно показав, що факт травматизації слизової оболонки матки підвищує у майбутньому ймовірність розвитку пухлинної патології останньої. Аналогічні результати були отримані С.В. Антиповою (2001), І.І. Зибенко (2004), Silverberg S. (1986), Sironi S. (1992) і свідчать про те, що травматизація слизової оболонки матки в анамнезі є одним із основних факторів ризику виникнення і розвитку пухлинної патології ендометрія надалі, викликаючи дисбаланс місцевих систем регуляції процесів росту й апоптозу. В ході оцінки результатів проведеного генеалогічного анамнезу виявлені достовірні розбіжності між досліджуваними групами. Так, наявність онкологічних захворювань у родичів відзначали 37 (46,3) хворих на просту гіперплазію ендометрія без атипії, 40 (57,1) жінок зі складною гіперплазією ендометрія без атипії, 23 (46,0) пацієнтки з атиповою гіперплазією ендометрія та 38 (63,3) осіб з РТМ. Усі показники достовірно перевищили аналогічний у групі контролю, де на факт наявності онкологічних захворювань у родичів вказували тільки 9 (9,0) пацієнток. Разом з тим, доброякісні пухлинні процеси органів репродуктивної системи по жіночій лінії були виявлені у
43 (53,8), 39 (54,3), 37 (74,0) і 44 (73,3) пацієнток першої другої, третьої і четвертої груп відповідно, достовірно перевищивши аналогічний показник у групі контролю – 15,0 (15 жінок). Отримані нами результати узгоджуються із даними Л.В. Адамян і співавт. (1998), І.Б. Манухіна та співавт. (2001), В.П. Козаченко та співавт. (2004) щодо генетичного фактора як провідного у виникненні і розвитку пухлинних процесів ендометрія.

Результати проведених імуногістохімічних досліджень показали, що в ендометрії практично здорових жінок присутня висока або помірна активність
NO-синтази, тоді як при гіперпластичних процесах ендометрія активність даного ферменту у більшості випадків слабка і слідова, а при атиповій гіперплазії ендометрія та РТМ – слідова або практично відсутня. Розглядаючи нормальний ендометрій, просту і комплексну гіперплазію ендометрія без атипії та просту і комплексну гіперплазію ендометрія з атипією, а також РТМ як послідовні етапи формування патологічного процесу у тканині у світлі теорії дизрегуляційної патології, слід вказати на зниження активності NO-синтазної системи у слизовій оболонці тіла матки по мірі прогресування ступеня прояву атипових змін тканини. Участь NO у зазначених процесах розвитку пухлинної патології ендометрія є безсумнівною. При цьому активність оксиду азоту у слизовій оболонці матки пацієнток з пухлинними захворюваннями ендометрія ми розглядаємо тільки як показник стану саногенетичних процесів у тканині.

Враховуючи одержані нами дані про достовірні розходження в активності оксиду азоту у слизовій оболонці матки при різних варіантах пухлинної патології ендометрія, а також дані літератури про важливу роль стану рецепторного апарату ендометрія у виникненні і розвитку пухлинної патології в ньому, був проведений порівняльний аналіз стану рецепторів стероїдних гормонів у слизовій оболонці матки у сформованих групах дослідження. Порівняльний аналіз стану рецепторів естрадіолу у досліджуваних групах показав, що експресія рецепторів естрадіолу у слизовій оболонці тіла матки у пацієнток репродуктивного віку достовірно знижується по мірі прогресування пухлинного процесу від норми до атипової гіперплазії ендометрія. Порівняльний аналіз стану рецепторів прогестерону у досліджуваних групах показав, що експресія прогестеронових рецепторів в ендометріальній тканині пацієнток репродуктивного віку також достовірно знижується по мірі прогресування пухлинного процесу від норми до атипової гіперплазії ендометрія. При цьому необхідно підкреслити, що експресія рецепторів естрадіолу і прогестерону в епітеліальних клітинах корелює з такою у стромі.
З огляду на отримані нами дані, показники тканинної активності оксиду азоту,
а також стану рецепторної системи у слизовій оболонці матки, особливо досліджувані в динаміці, можуть бути критеріями прогнозу подальшого перебігу захворювання як убік його агресії, так і вбік регресії.

Відомо, що патологічні процеси в органах і тканинах можуть викликати значні зсуви в клітинному складі периферичної крові. Отже, вивчаючи особливості субпопуляційного складу лімфоцитів крові за умов наявності патології, можна спробувати зафіксувати зміни, характерні для того чи іншого захворювання, що мало б важливе діагностичне значення. Проведені дослідження з імунофенотипування лімфоцитів периферичної крові пацієнток з різними видами пухлинної патології ендометрія показали, що у 74 обстежених виявляються різноманітні порушення імунограми, тоді як у контрольній групі відхилення від нормальних показників імунограми виявлені лише у 11 жінок. Серед основних порушень відзначалися такі, як: збільшення відносного вмісту природних кілерів (ЕК); збільшення відносної кількості активованих Т-клітин; збільшення вмісту Т-супресорів / цитотоксичних клітин (Тс); зниження відносного вмісту Т-хелперів (Тх), що супроводжується зниженням регуляторного індексу Тх/Тс; зміна відносного вмісту В-клітин. Найчастішим відхиленням показників імунограми від норми в обстежених групах пацієнток виявилося підвищення відносного вмісту в крові природних кілерів і активованих Т-клітин, що несуть рецептор до інтерлейкіну 2: IL-2Rб. Сумарні відхилення від норми за процентним вмістом Т і В-клітин у крові обстежених пацієнток зустрічалися дуже рідко. При цьому найбільший відсоток порушень імунограми відзначали у групах хворих на аденокарциному ендометрія і комбіновані гіперпластичні процеси ендо- та міометрія.

Порівняльний міжгруповий аналіз отриманих результатів виявив певну кореляцію між характером змін середніх показників клітинного імунітету та типом патології. Так, наприклад, у групі пацієнток з верифікованою аденокарциномою ендометрія середній відносний вміст клітин з фенотипом CD3+CD8+ (Т-супресорицитотоксичні клітини) і загальний відсоток лімфоцитів перевищують аналогічні показники в інших, включаючи контрольну, групах. У групах хворих на злоякісні пухлини ендометрія та у вибірці пацієнток, що страждають на комбіновані доброякісні пухлини ендо- і міометрія, середні цифри відносного вмісту ЕК-клітин у крові підвищено, а середній відносний вміст Т-хелперів знижено порівняно з контролем.

Виявлені зміни могли б розглядатися як критерії ризику пухлинного росту при діагностичних обстеженнях, але проблема полягає в тому, що зазначені зрушення чітко простежуються лише при розгляді середніх показників імунограми в досліджуваних групах пацієнтів. При аналізі ж індивідуальних показників, зробити коректні діагностичні і прогностичні висновки досить проблематично, оскільки відхилення зазначених показників у конкретних хворих, як правило, не виходять за межі загальноприйнятих нормальних значень (фізіологічних коливань). Цей висновок узгоджується з думкою Л. Йегера і співавт. (1990), Є.І. Соколова і співавт. (1998), В.А. Прокопчука (2000), Schondorf T.H. et al. (1995), Chang W.C. et al. (2005) про те, що імунологічні параметри у пацієнтів доцільно оцінювати індивідуально, на етапі діагностики і наступного спостереження, оскільки порівнювання із середньостатистичними показниками не передає реальний стан імунологічної реактивності внаслідок широкого діапазону показників у нормі. Таким чином, результати проведеного імунологічного дослідження свідчать про недостатню інформативність даних одноразового імунофенотипування лімфоцитів крові у пацієнток гінекологічної клініки при використанні стандартних підходів до їх трактування. Розроблений спосіб оцінки результатів імунофенотипування шляхом обчислення “індексу пухлиноспецифічної реактивності” ІПР дозволив виявити групу пацієнтів з підвищеним ризиком наявності пухлинного росту серед осіб з нормальною імунограмою або з діагностично малоінформативними змінами імунограми. Запропонований індекс являє собою частку від поділу добутку процентного вмісту ЕК і Тс-клітин (у чисельнику) і процентного вмісту Тх
(у знаменнику):

При аналізі результатів виявилося, що розподіл онкологічних хворих залежно від величини показника ІПР відрізняється від нормального і має 2 виражених максимуми: в районі 3 і 12 одиниць ІПР. Тому було вирішено поділити пацієнтів, що мають злоякісні пухлини матки (IV група), на 2 підгрупи: зі значеннями ІПР до

7 і більше 7 відповідно. Першій підгрупі (IV А) була привласнена умовна назва “підгрупа імунореактивності типу А” (значення ІПР нижче 7), а підгрупу IV В умовно назвали “підгрупа імунореактивності типу В” (значення ІПР вище 7).

Імунограми пацієнтів з підгрупи імунореактивності типу А характеризувалися високим вмістом Т-хелперів, низьким вмістом Тс і природних кілерів (рис. 1). Імунограми пацієнтів з підгрупи імунореактивности типу В, навпаки, відрізнялися відносно низьким вмістом Т-хелперів, високим відсотком Т-цитотоксичних/ супресорів і природних кілерів у периферичному кровотоці і заниженим імунорегуляторним індексом.

Рис. 1. Гістограми, що відображують вміст різних субпопуляцій лімфоцитів у крові пацієнтки М., яка страждає на аденокарциному ендометрія

Різниця за величиною критерію ІПР між підгрупами онкологічних пацієнтів (IVA і ІVВ) та іншими групами, за винятком пари “Рак, імунореактивність типу А – Атипова гіперплазія”, виявилася статистично достовірною (р<0,05). Відсутність достовірної різниці у показниках клітинного імунітету в єдиній парі “Рак, імунореактивність типу А – Атипова гіперплазія” є найбільш значимим фактом (рис. 2). З одного боку, це демонструє подібну загальноорганізмену відповідь на вже сформовану онкопатологію і на передпухлинний стан, яким є атипова гіперплазія ендометрія, що свідчить про спільність їх патогенетичних механізмів і дозволяє розцінювати атипову гіперплазію, як етап канцерогенезу.

Рис. 2. Співставлення середніх значень ІПР у групах обстежених пацієнток. Позначення “Рак, тип А” та “Рак, тип В” означають підгрупи онкологічних пацієнтів IVA та ІVВ відповідно

З іншого боку, нормалізація значень ІПР при динамічному визначенні показників клітинного імунітету у онкохворих, чи навпаки “стрибок” ІПР за межі “нормальних” значень 4<норма<9 у випадку консервативного лікування хворих на атипову гіперплазію ендометрія може бути сигналом до своєчасного використання хірургічних, але ще органозбережувальних методик, наприклад аблації або резекції ендометрія. “Аномальні” значення ІПР не виявлені у жодної з практично здорових жінок контрольної групи, тоді як відсоток “аномальних” ІПР у групах пацієнтів від гіперплазії до аденокарциноми зростає. Перевагою пропонованого нами підходу (визначення показника ІПР) є те, що даний показник дозволяє оцінювати функціональне взаємовідношення клітинних популяцій крові, що підвищує інформативну цінність навіть одноразового імунофенотипування.

Оцінка стану ендокринної системи здійснювалася шляхом визначення та співставлення концентрацій гормонів у сироватці крові пацієнток досліджуваних груп. Порівняльний аналіз рівнів стероїдних і гіпофізарних гормонів у першу фазу менструального циклу, так само як і у другу, у жінок з різними видами пухлинної трансформації ендометрія достовірної різниці не показав (p>0,05). Разом з тим у обстежених жінок була виявлена пряма кореляція між концентрацією ТТГ, Т3 і відносним вмістом певних субпопуляцій імунних клітин у периферичному кровотоці, що узгоджується із даними Горіна В.С. та співавт. (2000). Так, рівень трийодтироніну корелював з відносним вмістом природних кілерів (r=0,36, p<0,05), а концентрація тиреотропного гормону корелювала із вмістом Т-клітин (r=0,31, p<0,05).

Оскільки ЕК і Т-клітини є основними учасниками клітинного (у тому числі і протипухлинного) імунітету, отримані результати можна розглядати як додаткове свідчення ролі ендокринної системи як одного із чинників, що впливають на резистентність організму до пухлинного росту. Зокрема, наведені дані обґрунтовують доцільність додаткового вивчення ролі гормонів щитовидної залози у протипухлинній опірності організму. Даний аспект може мати як теоретичне, так і важливе практичне застосування в плані розробки методів і препаратів для спрямованої корекції гормонального фону з метою підвищення протипухлинної резистентності організму. З огляду на відсутність достовірних змін у функціональній активності інших залоз внутрішньої секреції, зміни у функціонуванні щитовидної залози слід трактувати як сигнальні і розцінювати стан щитовидної залози як маркер саногенезу.

Проведений аналіз родоводів пацієнток досліджуваних груп і цитогенетичного дослідження лімфоцитів їх периферичної крові продемонстрував наступне. У групі пацієнток з обтяженим сімейним онкоанамнезом частота зустріваності раку шлунка (19,3), раку матки (15,8) і раку молочної залози (15,6) вища, ніж частота зустріваності пухлинної патології іншої локалізації. Слід зазначити, що пацієнтки з пухлинною патологією ендометрія з групи з обтяженим сімейним онкоанамнезом більше контактували з мутагенами (45,5 %), ніж пацієнтки з пухлинною патологією без обтяженого сімейного онкоанамнезу (29,6 %). При цьому у пацієнток з обтяженим сімейним онкоанамнезом частіше спостерігалися порушення репродуктивної функції (спонтанні викидні і безплідність) (13,6 і 9,0), ніж у пацієнток без обтяженого сімейного анамнезу по онкопатології (3,7 і 3,2). Виявлено, що рівень спонтанних хромосомних аберацій у онкологічно обтяжених та необтяжених пацієнток із залозистою гіперплазією ендометрія (19,5±2,0 і 7,1±2,5відповідно) достовірно нижчий, ніж у пацієнток з атиповою гіперплазією (29,1±6,5 і 29,9±4,1) і аденокарциномою ендометрія (36,4±6,1 і 36,4±6,1). Разом з тим, у хворих на пухлинну патологію ендометрія сумарно виявлено 31 сайт фрагільності хромосом (рис. 3); 4 сайти фрагільності (1q2.5-4.1; 2q2.4-31; 4q1.5; 5q1.4) виявлено у пацієнток з атиповою гіперплазією ендометрія й аденокарциномою ендометрія як з обтяженим сімейним онкоанамнезом, так і без нього. Слід зазначити, що у хворих з обтяженим сімейним анамнезом по онкопатології виявлено 4 фрагільних сайти (17q2.2; 1q2.2; 1q1.4; 2p1.5-2.2), які не зустрічаються у хворих без обтяженого сімейного онкоанамнезу.

Рис. 3. Каріотип лімфоцитів периферичної крові хворої на рак ендометрія
47,ХХ, +mar; 11p-; FRA1q3.2; ламка ділянка хромосоми показана стрілкою

Отже, цитогенетичний метод обліку фрагільних сайтів хромосом лімфоцитів периферичної крові з використанням фолатдефіцитного середовища є додатковим методом виявлення груп високого ризику розвитку як спадкового, так і спорадичного раку; у динаміці відбиває процес стабілізації геному, тобто процес саногенезу; звужує поле пошуку мутантних генів, що призводять до формування ламких сайтів; полегшує вибір схем лікування, з можливим залученням препаратів, що стабілізують геном.

З метою пошуку молекулярно-генетичних маркерів виникнення пухлинної патології ендометрія були проаналізовані мутації і поліморфізм у генах, що обумовлюють процес канцерогенезу у тканині ендометрія, а також було здійснено пошук нових генів і молекулярно-генетичних маркерів патології.

Завдяки роботі ферментів детоксикації відбувається перетворення токсичних для клітини продуктів на водорозчинні нетоксичні похідні. Процес детоксикації включає дві послідовні фази. Ферменти першої фази пов’язують ксенобіотики з утворенням мутагенних проміжних метаболітів, таких як супероксид-аніон-радикал і ароматичні вуглеводні, які під дією ферментів другої фази перетворюються на нетоксичні продукти і виводяться з організму. В даний час встановлено, що ключову роль у другій фазі детоксикації ксенобіотиків виконують глутатіон-8-трансферази (GSTM), N-ацетилтрансферази (NAT). При вивченні поліморфізму гена детоксикації ксенобіотиків глутатіон-8-трансферази (GSTMI) достовірних відмінностей не виявлено у гомозигот по нульовому алелю. Аналіз співвідношення генотипів гена NAT2 зі швидким і повільним ацетилюванням у хворих на рак ендометрія виявив, що повільно ацетилюючий алель S2 (мутація 590 G-A) гена ариламін N-ацетил- трансферази 2 з високим ступенем достовірності (Р<0,001) присутній у хворих на рак ендометрія. У вивченій літературі ми не зустріли праці про зв’язок окремих алелей ариламін N-ацетилтрансферази 2 з ризиком виникнення раку ендометрія. Отримані результати вперше доводять участь гена NAT2 у патогенезі раку ендометрія і дозволяють розглядати молекулярний скринінг алелів NAT2 у якості важливого прогностичного тесту. З практичної точки зору це означає, що робота з будь-якими мутагенами для жінок з такою молекулярною патологією небажана, що підтверджується даними, отриманими нами при аналізі факторів ризику у хворих на рак ендометрія. Клінічно здоровим жінкам, які мають онкологічну обтяженість, доцільно при проведенні індивідуального генотипування звертати увагу на мутації в генах детоксикації з метою формулювання рекомендацій відносно стилю життя та контактів з мутагенами. Крім того, розбалансованість ферментів першої та другої фаз детоксикації може пояснювати відсутність очікуваних результатів в разі проведення гормонотерапії пухлинних станів ендометрія.

Дані про взаємозв’язок між особливостями метаболізму естрогенів, андрогенів і прогестерону та ризиком виникнення гормонозалежних пухлин, зокрема раку молочної залози, яєчників та ендометрія, не викликають жодних сумнівів. Естрогени, наприклад, утворюються шляхом конверсії андрогенів, в результаті складного ланцюга біохімічних перетворень. Саме тому деякі поліморфні варіанти генів, продукти яких беруть участь в синтезі андрогенів і естрогенів, можуть дещо збільшувати ризик новоутворень репродуктивної сфери. Зокрема, до кандидатів відносять гени групи цитохрому р450 (CYP1A1, CYP17, CYP1B1, Esr1 (ген рецепторів естрадіолу) і CYP19). Наприклад, ген CYP19 кодує фермент ароматазу, що займає ключову позицію на шляху перетворення андрогенів у естрогени, тобто каталізує реакцію, яка лімітує швидкість процесу в цілому. Реакція пухлини на гормони, як відомо, визначається наявністю відповідних рецепторів, з яких найбільш важливими є естрогенові (Esr) та прогестеронові (Pgr). Рецептори (цитоплазматичні протеїни) концентрують лише специфічні по відношенню до них стероїдні гормони з тих, що вільно проходять через клітинні мембрани. Комплекс, що утворився, переноситься в ядро клітини, де відбувається його взаємодія з ДНК, в результаті відбуваються зміни у функції гена клітини і, відповідно, у контролюванні її росту. У популяційних дослідженнях встановлено, що поліморфізм CYP19 може бути асоційований із підвищенним ризиком раку молочної залози, але його роль, так само як і роль решти кандидатних генів, у патогенезі раку ендометрія поки не вивчалась. Наведені дані свідчать про вирішальну роль молекулярно-генетичних чинників у виникненні гормонально-метаболічних порушень як основи для формування різноманітних патогенетичних варіантів захворювання і про необхідність ретельного дослідження подібних механізмів. Відповідний фрагмент роботи спрямований на пошук можливих асоціацій поліморфізму генів стероїдогенезу CYP17, CYP19, Esrб та Pgr з раком ендометрія. Проведено ампліфікацію ДНК за допомогою праймерів Cyp19, Cyp17, Pgr, Er2, Esrб на зразках раку ендометрія та здорової тканини. Детектований поліморфізм між зразками ДНК різних хворих на рак ендометрія відбивав природній поліморфізм у популяції. У гені естрогенового рецептора, досліженого за трьома екзонами (2, 7, 8), поліморфізму взагалі не виявлено. Дослідження екзона1 гена Cyp19, гена Cyp17, а також гена прогестеронового рецептора показало відсутність поліморфізму між контролями та тканинами раку ендометрія. Додатково проведено пошук нових мутацій, що можуть міститися у вказаних локусах, за допомогою температурного градієнтного гель-електрофорезу (TGGE). Отримані дані додатково підтвердили попередні дані щодо відсутності мінливості у досліджених регіонах геному. В результаті проведеного дослідження показано, що гени стероїдогенезу CYP19, Cyp17, Esrб, Pgr, патологічні зміни в яких за даними літератури обумовлюють виникнення пухлин в гормонозалежних тканинах жіночої репродуктивної системи, у межах досліджених локусів не містять очікуваних молекулярно-генетичних змін, які можна було б використати як прогностичні маркери виникнення пухлин ендометрія. Подібні дослідження є перспективними і повинні продовжуватися у напрямку вивчення решти ділянок гена і оточуючих повторюваних послідовностей, а також пошуку нових мутацій і детекції поодиноких нуклеотидних поліморфізмів.

Відомо, що людина має два види естрогенових рецепторів: ER-альфа та
ER-бета. Вони зв’язують естрогени і мають різну локалізацію та концентрацію. Для ER-альфа гена ідентифіковано 10 промоторних зон, три промоторні зони – A,B і C – найбільш вивчені. Дані промотори регулюють синтез специфічних транскриптів, відповідаючих ER-альфа А, ER-альфа B, ER-альфа С ізоформам. Ступінь експресії у різних ізоформ неоднаковий. Специфічні шляхи ER-експресії припускають диференційовану дію естрогенів на тканину-мішень. Крім епігенетичних змін у рівні експресії, зміни в експресії генів можуть мати місце і при генетичних порушеннях. Однонуклеотидний поліморфізм (SNP) є найбільш загальним типом варіацій у геномі людини. Так, у роботі продемонстровано генотипні розбіжності при аденокарциномі і нормі в кодоні 10 екзону 1 естрогенового рецептора альфа. Оскільки підтипи естрогенових рецепторів альфа і бета різні за функцією й експресією, то величина їх співвідношення характеризує як певну тканину, так і її стан. При аденокарциномі ендометрія співвідношення