АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДУ “ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ”

Жмінько Олеся Петрівна

УДК 615.9+547.823+661.162.6+577.122+576.311.347+593.17

ТОКСИКОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА

РЕГУЛЯТОРІВ РОСТУ РОСЛИН –
ПОХІДНИХ N-ОКСИД ПІРИДИНУ

(експериментальні дослідження)

14.03.06 – токсикологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник

член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Проданчук Микола Георгійович, Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, директор інституту

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Серединська Наталія Миколаївна, ДУ “Інститут фармакології та токсикології” АМН України, головний науковий співробітник відділу фармакології серцево-судинних засобів;

доктор біологічних наук, професор Томашевська Людмила Анатоліївна, ДУ “Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України”, завідувач відділу токсикологічних досліджень

Захист відбудеться “ _20_ ” _лютого_____ 2008 року о 15:00___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при ДУ “Інституті фармакології та токсикології” АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ “Інституту фармакології та токсикології” АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий “ _11_ ” ___січня_____ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У даний час для захисту рослин від бур’янів, шкідників і хвороб перевага віддається хімічним речовинам. Велику групу з них складають синтетичні регулятори росту рослин (РРР) (Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні, 2006). Сфера їх застосування весь час розширюється, оскільки вони виправдали себе в технологіях по виробництву екологічно чистої сільгосппродукції (А.О. Шевченко, В.О. Тарасенко, 1998; С.П. Понома-ренко, 1998; В.О. Зінченко та ін., 2000).

Механізм біологічної дії РРР на рослини полягає в активації багатьох фізіологічних процесів: фотосинтезу, фітогормонів, метаболізму, синтезу білку, модифікації геному, мембран та ін.
(Б.А. Курчий, 1988; В.В. Полевой, 1982; О.Н. Кулаева, В.В. Кузнецов, 2004). Зокрема, похідні N-оксид піридину підвищують проникність мембран, активний і пасивний транспорт речовин, прискорюють процеси транскрипції, інтенсифікують синтез білку в клітині (С.П. Пономаренко, 1999, 2003). Показано, що за дії деяких РРР не спостерігається лінійної залежності “доза-ефект”. Так, у найпростіших, у залежності від діючої концентрації РРР, виявлено як стимуляцію, так і пригнічення їх росту й розвитку (С.Ю. Буслович, А.С. Богдан, 1981). Стимулююча дія на ріст і розвиток рослин має бімодальний характер (С.П. Пономаренко, 2003).

За гострою токсичністю для тварин синтетичні РРР відносяться до помірно- або малотоксичних речовин, слабко кумулятивні, не мають резорбтивно-токсичної й сенсибілізуючої дії. Більшість із них чинять гепатотоксичну дію, пригнічують функції центральної нервової системи (В.С. Шевелуха, 1992; Л.А. Любинская, Л.И. Повякель, 2000). Для деяких РРР установлені неадекватні співвідношення верхніх і нижніх параметрів токсичності, виявлені зміни спрямованості ефекту (пригнічення або стимуляція різних ферментних систем), несприятливий тип накопичення функціональних змін (менша сумарна доза викликає той же ефект, що і велика сумарна доза) тощо (В.Н. Ракитский та ін., 1991; В.С. Богорад, 1991; Л.И. Повякель та ін., 1998).

На основі похідних N-оксид піридину в практику сільського господарства впроваджена значна кількість РРР. Однак, недостатність інформації щодо механізму токсичної дії РРР на тварин ускладнює прогноз їх шкідливих ефектів та оцінку небезпечності для людини. У зв’язку із цим, важливим є вивчення токсичних ефектів РРР на тест-системах різного рівня організації й розвитку, установлення загальних механізмів їх впливу на організм, дослідження залежності “доза-час-ефект”, оцінка потенційної небезпеки виявлених змін для організму на рівні низьких і наднизьких доз, тобто доз, реально існуючих у довкіллі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. У роботі узагальнено результати досліджень (1999-2002 рр.), проведених згідно із планом аспірантури, НДР: “Розробити методологічні основи комплексної медико-екологічної оцінки пестицидів, агрохімікатів, полімерних та синтетичних матеріалів і виробів із них; інформаційного, правового та нормативного забезпечення їх виконання, як модель управління профілактичними заходами в охороні здоров’я”, № держ-реєстрації 0195U008856; “Наукове обґрунтування безпечності для здоров’я людини нових технологій, речовин, матеріалів, виробів, об’єктів довкілля, харчових продуктів та продовольчої сировини; розробка відповідних медичних критеріїв і показників (санітарних та епідеміологічних); санітарно-хімічна, токсиколого-гігієнічна оцінка, регламентування, нормування”, № держреєстрації 0100U000254.

Мета роботи. Визначити характер і особливості токсичної дії регуляторів росту рослин – похідних N-оксид піридину за умов гострих і хронічних інтоксикацій, залежність “доза-час-ефект” та критеріальну значимість установлених ефектів при оцінці їх шкідливої дії.

Задачі роботи: 1. Дослідити гостру та хронічну токсичність регуляторів росту рослин – похідних N-оксид піридину для одно-клітинних тест-систем (інфузорій) у широкому діапазоні концентрацій (1Ч10-2 - 1Ч10-28 М).

2. Визначити параметри гострої токсичності похідних піридину й N-оксид піридину для білих щурів і мишей та залежність “структура-токсичність”.

3. На основі залежності “структура-токсичність” для інфузорій і лабораторних тварин розробити підходи щодо прогнозування гострої токсичності похідних піридину й N-оксид піридину для скринінгу речовин.

4. Дослідити вплив похідних N-оксид піридину (івіну, триману, тетрану) на білок-синтетичні процеси, мітотичну та мембранотропну активність при субхронічному пероральному надходженні в організм щурів.

5. Установити залежність “доза-час-ефект” при тривалій дії івіну, триману, тетрану на організм щурів за лімітуючими показниками й інфузорій Тetrahymena pyriformis W за чисельністю й ростом популяції.

Об’єкт досліджень. “Структура-токсичність”, гострі, підгострі й хронічні інтоксикації, мембранотропна активність, обмін білку, типи залежності “доза-час-ефект” за дії РРР – похідних N-оксид піридину.

Предмет досліджень. Характер впливу похідних N-оксид піридину на функціональний стан мембран мітохондрій і білковий обмін в організмі щурів, на ріст і чисельність популяції інфузорій Tetrahymena pyriformis W. у залежності від дози й часу дії.

Методи досліджень. При виконанні роботи використані токсикологічні, загальноклінічні, біохімічні, біофізичні, цитогенетичні, статистичні методи досліджень. Експериментальні дослідження проводились з використанням тест-систем in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. На різних тест-системах (білі щури й миші, інфузорії) і рівнях організації (організменний, клітинний, субклітинний) отримані нові дані щодо токсичних властивостей РРР – похідних N-оксид піридину. Вивчена залежність “доза-час-ефект”, розкритий характер і загальні закономірності токсичної дії похідних N-оксид піридину, дана оцінка їх шкідливої дії на організм.

Уперше встановлено, що досліджені похідні N-оксид піридину є помірно- або малотоксичними сполуками, не мають вираженої видової чутливості, чинять слабкий кумулятивний ефект на організм білих щурів. N-оксид-2-метилпіридин, N-оксид-2,6-диметилпіридин викли-кають помірний кумулятивний ефект у мишей; Ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II)хлорид (тетран), Ди(N-оксид-2-метилпіридин) цинк(II)йодид чинять виражену кумулятивну дію на організм інфузорій.

Показана залежність токсичності похідних піридину й N-оксид піридину від їх структури. Наявність у молекулі піридину метильного або хлор- радикалу знижує токсичність, нітро- або аміногруп – підвищує токсичність речовин. Введення в молекулу N-оксид піридину метильного радикалу або NO2-групи підвищує токсичність для тварин.

Уперше запропоновано регресійні рівняння для прогнозування гострої токсичності похідних піридину та N-оксид піридину. Виявлена середня кореляція між показниками гострої токсичності похідних
N-оксид піридину для щурів і інфузорій Тetrahymena pyriformis W. Удосконалено метод визначення гострої токсичності ксенобіотиків на інфузоріях і екстраполяції отриманих даних на тварин.

Уперше показано, що при хронічній дії на організм інфузорій Tetrahymena pyriformis W. івін, триман, тетран, ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II)йодид і N-оксид-2-метилпіридин переважно пригнічують ріст популяції інфузорій; ди(N-оксид-2-метилпіридин)бурштинат – стимулює ріст. Чисельність інфузорій не залежала від концентрації, часу дії РРР та фази розвитку інфузорій, криві росту популяції інфузорій мали моно-, бі- або полімодальний характер.

При субхронічному пероральному надходженні РРР в організм білих щурів лінійної залежності “доза-час-ефект” не спостерігалось, виявлено різну спрямованість ефекту. Установлено, що особливістю для РРР (похідних N-оксид піридину) є те, що на відміну від загальнотоксичної дії, специфічні ефекти (мембранотропна активність, зміни синтезу білка, мітотична активність) проявляються на низькому рівні доз. За впливу івіну й триману зміни показників стану мембран та білок-синтетичних процесів, у залежності від дози й часу дії РРР, мають моно- або бімодальний характер і є лімітуючими показниками при оцінці їх шкідливої дії. Модифікація мембран мітохондрій гепатоцитів (зниження вмісту малонового диальдегіду, підвищення або зниження активності сукцинатдегідрогенази та цитохромоксидази, збільшення пасивного набрякання мітохондрій) та інтенсифікація синтезу й розкладу білків пов’язані з адаптивними реакціями організму щурів на дію малих доз досліджених РРР.

Практична значимість одержаних результатів. Удосконалено методичні підходи щодо прогнозування гострої токсичності похідних піридину та N-оксид піридину.

Результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, кафедрі медичної біології Медичного інституту Української асоціації народної медицини, кафедрі гігієни та екології людини Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика.

Матеріали роботи використані при реєстрації в Україні РРР тетра-ну, обґрунтуванні його допустимої добової дози для людини, гігієнічних нормативів у атмосферному повітрі, воді водоймищ (Постанова Голов-ного державного санітарного лікаря України №42 від 19 грудня 2006 р.).

Особистий внесок здобувача. Пошукачем особисто проаналізована вітчизняна й зарубіжна література за проблемою, самостійно сформульована методологія проведення досліджень. У дисертації викладені результати експериментальних (токсикологічних, біохімічних, біофізичних, цитогенетичних) та теоретичних досліджень, отриманих автором особисто.

Самостійно проведена статистична обробка отриманих даних, кореляційний і регресійний аналіз залежності токсичності від фізико-хімічних властивостей речовин. Автором самостійно проаналізовані та узагальнені результати роботи, сформульовані висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднені на науково-практичній конференції “Актуальні проблеми екогігієни і токсикології” (Київ, 1998), 1 з’їзді Токсикологів України (Київ, 2001), VI міжнародному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2002), міжнародному Європейському конгресі токсикологів ЄВРОТОКС’2002 (Будапешт, Угорщина, 2002), міжнародній конференції “Антропогенно-змінене середовище України: ризики для здоров’я населення та екологічних систем” (Київ, 2003), 2 з’їзді Токсикологів України (Київ, 2004), міжнародному Європейському конгресі токсикологів ЄВРОТОКС’2005 (Краків, Польща, 2005), 6 міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини”, присвяченій 100-річчю з дня народження Л.І. Медведя (Київ, 2005), VII міжнародній науковій конференції “Current and Future Challenges in Environmental Health, Toxicology, and Food Safety in Eastern and Central Europe” (Київ, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 3 статті в наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 9 робіт у матеріалах з’їздів, конференцій, 1 нововведення.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 226 сторінках машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, 4 розділи власних досліджень, висновки, практичні рекомендації, список посилань, який містить 247 джерел (116 вітчизняних і 131 зарубіжних). Робота ілюстрована 35 таблицями і 25 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використані метильні похідні N-оксид піридину і їх комплекси з протонодонорами, синтезовані в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Дослідження in vivo проведені на 877 статевозрілих щурах Wistar, 442 білих мишах згідно вимог біоетики. У дослідах in vitro використані інфузорії Tetrahymena pyriformis W. (531 проба).

Гостру пероральну токсичність речовин визначали на мишах і щурах (самцях). Параметри гострої токсичності розраховували методом пробіт-аналізу кривих летальності (В.Б. Прозоровський, 1963). Відмічали клінічні ознаки інтоксикації, розраховували середній час загибелі тварин (ЕТ50) за методом Г.Н. Красовського (1982), коефіцієнт варіабельності видової чутливості (КВЧ) – згідно з Методичними вказівками (1988), індекс кумуляції (Iкум.) – за формулою Б.М. Штабського, Ю.С. Кагана (1974). Гостру токсичність і кумулятивну дію речовин для інфузорій визначали згідно з Методичними рекомендаціями (1996).

Для прогнозування токсичності похідних піридину і N-оксид піридину за фізико-хімічними властивостями використані величини ЛД50 для щурів і мишей, їх фізико-хімічні параметри – Мм, Тпл., Ткип., Ро/в. Коефіцієнти Ро/в розраховували за фрагментарними константами Реккера (А. Альберт, 1989), інші фізико-хімічні властивості речовин наведені за даними Ю.І. Чумакова (1965). У розрахунках використані ЛД50 похідних піридину за даними літератури (Ю.И. Чумаков, 1965;
Н.В. Лазарев, Э.Н. Левина, 1976; А.В. Павлов, 1986). Кореляційний і регресійний аналіз проводили за методами багатомірної статистики з використанням пакета “Statgraphics” версії 3.0.

Досліджена хронічна токсичність для інфузорій 6 похідних N-оксид піридину: івіну (N-оксид-2,6-диметилпіридин), триману (аква-N-оксид-2-метилпіридин-марганець-2-хлорид), Ди(N-оксид-2-метилпиридин) цинк(ІІ) хлориду (тетрану), Ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II)йодиду, Ди(N-оксид-2-метилпіридин) буршти-нату, N-оксид-2-метилпіридину упродовж 96 годин у концентраціях 10-2 М  10-28 М. Визначали чисельність, морфологічні зміни і загибель клітин у лаг-фазі (24 год.), логарифмічній фазі (48 год.), стаціонарній фазі росту (72 і 96 год.).

Токсикодинаміка при субхронічній пероральній дії РРР досліджена на щурах самках Wistar з висхідною масою тіла 120 г упродовж 6 місяців (за впливу івіну і триману) і 3 місяців (за впливу тетрану). Івін вводили у дозах – 13, 1,3, 0,13, 0,013 мг/кг, триман і тетран – 30, 3, 0,3, 0,03 мг/кг маси тіла (відповідно 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000 від ЛД50). Проводили клінічне обстеження, реєстрували масу та приріст маси тіла щурів. Оскільки печінка містить значну кількість нуклеїнових кислот (НК) та є місцем синтезу білків плазми (Дж. Девид-сон, 1976), то в тканинах печінки щурів визначали вміст ДНК і РНК за методом Р.Г. Цанєва і Г.Г. Маркова (Э.Б. Сквирская, О.П. Чепинова, 1964), білку в тканині печінки – за методом О.Н. Lowry et. al. (1951) та плазмі крові – біуретовим методом (Г.А. Кочетов, 1980), фракції білків сироватки крові – за методом електрофорезу на папері (Р.П. Виноградова та ін., 1977). Активність ферментів переамінування амінокислот – аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2.) і аспартатамінотрасферази
(КФ 2.6.1.1.) визначали за методом S. Reitman, S. Frankel (1957). Відомо, що в результаті розпаду білків утворюються кінцеві продукти азотистого обміну. Найбільшу фракцію залишкового азоту становлять сечовина, креатин і креатинін (Д.Л. Фердман, 1966). Вміст сечовини в плазмі крові та сечі визначали за стандартним набором Біотест-Лахема, креатиніну – за методом Поннера, вміст білка в сечі – за пробою з сульфасаліциловою кислотою (В.В. Меньшиков, 1987).

Вплив РРР на мітотичну активність клітин кісткового мозку щурів оцінювали за мітотичним індексом (Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ, 1989). Для диференціації токсичних ефектів досліджували ЕПР-спектри в тканинах печінки щурів за методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) в умовах низькотемпературної стабілізації в рідкому азоті (J. Hashimoto et. al., 1962). Дослідження проводили на ЕПР-спектрометрі фірми “Варіан” Е-109 (США) за консультативною допомогою наукового співробітника С.Г. Шандренко. Кількісна оцінка надана по амплітуді ЕПР-сигнала (g-фактора), що характеризує вміст цитохрому Р-450, вільних радикалів (ВР), залізо-сірчаних білків (ЗСБ) і NO.

Відомо, що внаслідок порушення збалансованого перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), можуть накопичуватися токсичні продукти, змінюватись проникливість мембран і активність мембранозв’язаних ферментів, що і зумовлює порушення їх структури і функції (Б.А. Курчий, 1988; А.А. Болдырев, 1990; Л.Б. Бондаренко, В.М. Коваленко, 2000). Стан мембран мітохондрій гепатоцитів оцінювали за такими показниками: ПОЛ, що визначали за вмістом малонового диальдегіду – МДА (Г.Г. Гацко, Л.М. Мажум, Е.А. Познякова, 1982); пасивне набря-кання мітохондрій – за зміною світлорозсіювання суспензії мітохондрій у 0,25 М і 0,07 М розчинах сахарози при довжині хвилі 520 нм (А.В. Каргаполов, 1979); активність сукцинатдегідрогенази – СДГ (К.Ф. 1.3.99.1) – за реакцією окислення бурштинової кислоти у фумарову, цитохромоксидази – ЦО (К.Ф.1.9.3.1) – за методом Cooperstein S., Losarnov (Р.С. Кривченкова, 1977), вміст білку – за методом О.Н. Lowry et. al. (1951).

Статистичну обробку результатів досліджень проведено на мікро-ЕВМ (А.М. Шевченко та ін., 1987; Лапач С.Н., Губенко А.В., Бабич П.Н., 2002). Визначали середню арифметичну (Х), похибку репрезен-тативності (m), критерій Стьюдента (t), вірогідність даних (Р).

Результати досліджень та їх обговорення. Токсичні властивості похідних N-оксид піридину. Величини токсичності похідних N-оксид піридину для лабораторних тварин наведені в табл. 1. Встановлено, що за параметрами гострої пероральної токсичності для щурів і мишей вивчені похідні N-оксид піридину, їх комплекси з органічними кислотами та солями відносяться до 3 класу небезпечності (ГОСТ 12.1.007-76).

Внутрішньовидова варіабельність гострої токсичності досліджених РРР для щурів – близько 3, мишей – 10. Миші є більш чутливі, ніж щури до N-оксид піридину, комплексів похідних N-оксид піридину з протонодонорами (особливо при наявності в їх складі щавелевої кислоти) та в структурі яких знаходяться метали та галогеноводні. Вираженої видової чутливості не виявлено, за винятком комплексу N-оксид-2-метилпіридину з щавелевою кислотою (КВЧ = 3,59). КВЧ для похідних N-оксид піридину становить 1,09 – 2,05, для їх комплексів з протонодонорами – 1,27 – 3,59.

Кумулятивний ефект у щурів слабко виражений. Найбільший Ікум. виявлений у N-оксид піридину і його комплексу з мурашиною кислотою, комплексів N-оксид-2-метилпіридину і N-оксид-2,6-диметилпіридину з щавелевою кислотою (0,32; 0,31; 0,31; 0,29 відповідно). У порівнянні з N-оксид піридином у його метальних похідних кумулятивний ефект менше виражений (Ікум. 0  ,19). У мишей кумулятивний ефект N-оксид піридину зменшується в 2 рази (Ікум. 0,17), N-оксид-2-метилпіридину, N-оксид-2,6-диметилпіридину – помірно виражений (Ікум. 0,37 і 0,54 відповідно).

Таблиця 1

Хімічна назва, фізико-хімічні властивості і токсичність похідних піридину і

N-оксид піридину

№ | Хімічна назва | Мм |

Ткип / пл | Ро/в | ЛД50, мг/кг,

щури/миші | ЛД50,

мг/кг *

1 | Піридин | 79,1 | 115,3 / -41,6 | 0,75 | 200 / 400 | 733

2 | 2-метилпіридин | 93,1 | 129,4 / -66,5 | 1,27 | 790 / 617 | 946

3 | 2,6-диметилпіридин | 107,2 | 144,1 / -6,1 | 1,79 | 1150 / 1050 | 1296

4 | 2,5-диметилпіридин | 107,2 | 157 / - | 1,79 | 2000 / 1550 | 1630

5 | 2-метил-5-етилпіридин | 121,2 | 176 / - | 2,32 | 1460 / 1680 | 1709

6 | 6-трихлорметил-2-хлорпіридин | 230,9 | - / 62 | 3,43 | 1070 / 700 | 1020

7 | 2-трихлорметил-3,4,5-трихлорпіридин | 299,78 | - / 101 | 5,47 | 1780 / 1600 | 1661

8 | 2-трихлорметил-3,4,5,6-тетрахлорпіридин | 339,22 | - / 60 | 5,8 | 1840 / 1500 | 1599

9 | б-амінопіридин | 94,1 | 204 / 56 | -0,27 | 514 / 214 | 507

10 | 4-амінопіридин | 94,1 | 180 / 159 | -0,27 | - / 20 | 125

11 | 4-аміно-3,5дихлор-2-трихлорметилпіридин | 280,3 | - / 130 | 3,17 | 1180 / 650 | 976

12 | 4-аміно-3,5,6-трихлор-2-трихлорметилпіридин | 314,8 | - / 136 | 4,02 | 1500 / 770 | 1079

13 | Піридон | 178,2 | - / 238 | 1,5 | 1900 / 3100 | 2454

14 | N-оксид піридин | 95 | 70 / 140 | 0,32 | 4075 / 2920 | 3097

15 | N-оксид-2-метилпіридин | 109 | 47 / 123 | 0,84 | 1500 / 1163 | 1178

16 | N-оксид-2,6-диметил піридин | 123 | 219 / 117 | 1,36 | 1300 / 1425 | 1026

17 | 4-нітро-N-оксид піридин | 140,1 | 156 / - | 0,08 | 110 / 310 | 94

18 | N-оксид піридин з мурашиною кислотою | 141 | 20 / - | -0,45 | 2000 / 3150 | 1556

19 | N-оксид-2-метилпіридин з мурашиною кислотою | 155 | 19 / - | 0,07 | 1426 / 925 | 1122

20 | N-оксид-2,6-диметилпіридин з мурашиною кислотою | 169 | 21 / - | 0,59 | 1700 / 2275 | 1330

21 | N-оксид піридин з щавелевою кислотою | 185 | 76 / - | -1,56 | 2000 / 875 | 1556

22 | N-оксид-2-метилпіридин з щавелевою кислотою | 199 | 76 / - | -1,04 | 1725 / 480 | 1349

23 | N-оксид-2,6-диметил-піридин з щавелевою кислотою | 213 | 77/ - | -0,52 | 1350 / 782 | 1064

Примітка. * – Розрахункова ЛД50 для похідних піридину наведена за формулою 3 (для щурів), для похідних N-оксид піридину – за формулою 4 (для мишей)

Інші досліджені сполуки чинять слабко виражений кумулятивний ефект на організм мишей. Незначна розбіжність у токсичній і кумулятивній дії похідних N-оксид піридину може бути пов’язана з особливостями їх біотрансформації в організмі тварин.

Для інфузорій ЛК50 піридину становить 11,84 мг/мл, 2,6-диметилпіридину – 6,72 мг/мл, Ди(N-оксид-2-метилпіридин)бурштинату – 12,08 мг/мл, Ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II) йодиду – 13,25 мг/мл, тетрану – 12,7 мг/мл культури, що дозволяє віднести їх до помірно токсичних сполук (П.Г. Жмінько та ін., 2000). ЛК50 N-оксид піридину – 34,2 мг/мл, N-оксид-2-метилпіридину – 26,1 мг/мл, івіну – 55,98 мг/мл, триману – 43,7 мг/мл культури і відносяться до малотоксичних речовин, що співпадає з даними, отриманими на тваринах. Внутрішньовидова розбіжність у гострій токсичності даних сполук для інфузорій – 4,6, що в 2 рази менше, ніж для тварин.

При субхронічній дії найбільш виражений токсичний ефект на інфузорії чинять 2,6-диметилпіридин (ЛК50 – 5,09 мг/мл), тетран (ЛК50 – 3,69 мг/мл), Ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II)йодид (ЛК50 – 6,96 мг/мл), ніж піридин (ЛК50 - 14,84 мг/мл), Ди(N-оксид-2-метилпіридин) бурштинат (ЛК50 – 16,08 мг/мл). За кумулятивними властивостями піридин, триман, N-оксид-2-метилпіридин, Ди(N-оксид-2-метилпіридин)бурштинат чинять слабку кумулятивну дію на інфузорії (Ккум – 1,33  ,06). 2,6-диметил-піридин, N-оксид піридин, N-оксид-2,6-диметилпіридин – помірну кумулятивну дію (Ккум – 0,98 - 0,9). Тетран і Ди(N-оксид-2-метилпіридин) цинк(II)йодид – виражену кумулятивну дію (Ккум – 0,29 і 0,53 відповідно). Виражена кумулятивна дія для інфузорій двох останніх РРР обумовлена наявністю в їх структурі атому цинку, оскільки вони чутливі до важких металів (В.А. Долгов, 1986; N. Dias, N. Lima, 2002, J.R. Nilson, 2003).

Скринінг і прогнозування гострої токсичності похідних піридину і N-оксид піридину. Встановлено, що зі збільшенням молекулярної маси (табл. 1) речовин (1-5) від піридину до 2-метил-5-етилпіридину збільшується їх Ткип і Ро/в. За токсичністю ці сполуки відносяться до середньо- і малотоксичних речовин. ЛД50 даних сполук для ссавців варіює в межах від 617 до 2000 мг/кг.

Введення в молекулу піридину 1 чи 2-х метильних груп або атомів хлору (незалежно від їх положення в молекулі) підвищує Ро/в і знижує токсичність. Введення в молекулу піридину аміногрупи (9, 10) підвищує токсичність для мишей (214 і 20 мг/кг відповідно). Оскільки швидкість проходження речовин через біосередовища приблизно пропорційна lgРо/в, то закономірним є той факт, що зі збільшенням Ро/в знижується токсичність для ссавців [А. Альберт, 1989]. Для даної групи похідних піридину виявлений високий кореляційний взаємозв’язок між Тпл і Ткип (R = -0,909, р = 0,09), ЛД50 для мишей і щурів (R = 0,927, р = 0,078), середній кореляційний зв’язок між Мм і Ро/в (R = 0,775, р = 0,008), Ро/в і ЛД50 для мишей (R = 0,547, р = 0,26). На основі залежностей між вказаними показниками отримані регресійні рівняння:

lgЛД50 (щури) = 0,0013 lgТпл – 0,032 lgРо/в + 1,07 lgЛД50 (миші) (1)

lgЛД50 (щури) = 0,0016 lgТпл – 0,0006 Мм + 1,082 lgЛД50 (миші) (2)

lgЛД50 (щури) = 1,33 + 0,59 lgЛД50 (миші) (3)

На відміну від похідних піридину, введення в молекулу N-оксид піридину метильної групи (сполуки 15, 16) в положення 2 або 2 і 6 підвищує токсичність речовин приблизно в 2,5 рази для обох видів тварин, NO2-групи (речовина 17) – на порядок. Ро/в значно нижче, ніж у похідних піридину і варіює від -1,56 до 1,36. Це вказує на те, що похідні N-оксид піридину, більш гідрофільні, ніж похідні піридину і їх токсичність мало залежить від Ро/в, про що свідчить слабкий кореляційний взаємозв’язок між ними. Середній кореляційний взаємозв’язок для даної групи речовин виявлений між ЛД50 для щурів і мишей (R = 0,717, р = 0,021), Ткип і Тпл (R= -0,626, р = 0,569).

Для похідних N-оксид піридину отримані наступні регресійні рівняння:

lgЛД50 (миші) = 0,967 lgЛД50 (щури) (4)

lgЛД50 (щури) = 1,025 lgЛД50 (миші) – 0,169 lgРо/в (5)

Надані рівняння можуть бути використані для скринінгу токсичності похідних піридину і N-оксид піридину, оскільки розраховані за ними ЛД50 близькі до експериментальних.

Сучасні етичні й економічні вимоги до токсикологічних досліджень викликають великий інтерес щодо використання альтернативних моделей і методів (Національний конгрес з біоетики, 2001; А.Г. Ципкун, 2002). Одною з таких тест-систем є інфузорії Tetrahymena pyriformis W.

Для прогнозування гострої токсичності речовин спочатку визначають ЛК50 для інфузорій, потім методом однієї точки встановлюють відсоток летальності для тварин і на графіку прямої летальності для інфузорій відкладають відповідний пробіт, місце доз і визначають параметри гострої токсичності для тварин. Встановлена класичним методом ЛД50 івіну для мишей 1360 мг/кг, формаліну 380 мг/кг. ЛД50 івіну, за методом однієї точки з використанням графіка прямої летальності для інфузорій, становить 1280 мг/кг, формаліну – 386 мг/кг, що свідчить про високу ефективність використаного метода. Визначивши методом однієї точки летальність для тварин, хімічну речовину класифікують за ступенем небезпеки за ГОСТ 12.1.007-76 або ДСанПіН 8.8.1.002-98.

Токсикодинаміка похідних N-оксид піридину при тривалій дії в умовах in vitro та in vivo. Встановлено, що за умов хронічної дії на інфузорії Tetrahymena pyriformis W. триман, тетран і ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II)йодид у концентрації 10-2 М викликали 100% летальність. Триман знижував (р<0,05) чисельність інфузорій у логарифмічній фазі росту (10-4 М, на 25%), стаціонарній фазі (10-4, 10-14 – 10-20 М, на 24% - 41%), чинив індукуючий ефект (р<0,05) в концентрації 10-26 М у стаціонарній фазі росту на 32%. Івін чинив інгібуючий ефект (р<0,05) у лаг фазі росту (10-4, 10-14, 10-28 М – на 22%  %), логарифмічній фазі (10-4, 10-6, 10-22 М на 22% - 28%), фазі стаціонарного росту (10-6, 10-10, 10-12, 10-16, 10-20 – 10-24 М на 22% - 53%). Індукуючий ефект (р<0,05) спостерігався в концентраціях 10-10 М у лаг фазі (56%), 10-28 М у логарифмічній (17%) і стаціонарній фазах росту (28%).

Ди(N-оксид-2-метилпіридин)цинк(II)йодид інгібував ріст інфузорій (р<0,05) в логарифмічній фазі росту (10-14 М – на 54%) і стаціонарній фазі (10-16, 10-18, 10-24 - 10-28 М – на 34% - 57%), викликав індукуючий ефект – у лаг фазі (10-12, 10-18, 10-20 М на 35% - 57%, р>0,05). N-оксид-2-метилпіридин в концентраціях 10-6 - 10-14, 10-18, 10-20 - 10-26 М інгібував ріст інфузорій у лаг фазі (на 18% - 46%, р<0,05) і стаціонарній фазі росту (на 26 - 61%, р<0,05), у концентраціях 10-20 і 10-22 М викликав індукуючий ефект (на 22% - 33%, р<0,05).

Найвиразніша зміна направленості ефекту виявлена за дії тетрану (рис. 1). Чисельність інфузорій зростала в лаг фазі (10-4, 10-6, 10-10 - 10-20 М до 140%), стаціонарній фазі росту (10-4, 10-12, 10-14, 10-22, 10-24 М до 29,8%), знижувалась у лаг фазі (10-26 М на 30%), логарифмічній фазі (10-4  -26 М до 56%), стаціонарній фазі (з найбільшим ефектом у концентраціях 10-6, 10-8, 10-16 М).

Рис. 1. Ріст популяції інфузорій при дії тетрану (* р<0,05 у порівнянні з контролем)

Ди(N-оксид-2-метилпіридин)бурштинат у концентрації 10-2 М у всіх фазах росту знижував чисельність інфузорій (27% - 84%, р<0,05). Виражена індукція (р<0,05) росту клітин спостерігалась у лаг фазі (10-24 М на 150%), логарифмічній фазі (10-6, 10-10 -28 М на 47%  %), стаціонарній фазі росту (10-6 - 10-14, 10-18 - 10-28 М на 50% - 167%).

Таким чином, за дії досліджених РРР у залежності від концентрації спостерігається зміна направленості ефекту як у діапазоні високих (10-2 - 10-6 М) і низьких концентрацій (10-7 - 10-12 М), так і надзвичайно низьких концентрацій (10-14 - 10-28 М). Криві чисельності інфузорій мали моно-, бі- й полімодальну залежність, у деяких випадках – вигляд прямої, експоненти, S- або U-подібний характер.

Існує декілька гіпотез механізмів “парадоксальних” нелінійних ефектів на рівні низьких концентрацій. Це гіпотези ліганд-рецепторної взаємодії, зв’язування з білками-переносниками, первинного внутрішньо-клітинного розподілення в клітині, “структурної пам’яті” води
(Е.Б. Бурлакова, 1994; В.П. Ямскова, И.А Ямсков, 1999; В.В. Булатов та ін., 2002; К.Г. Гуревич, 2002; Л.М. Шафран, Д.В. Большой, 2004). Можна також припустити, що на рівні низьких концентрацій важливе значення у формуванні відповіді клітини на ксенобіотик можуть мати особливості взаємодії речовини з мембранними структурами.

Установлено, що при субхронічному надходженні в організм щурів івін знижував вміст МДА в мітохондріях гепатоцитів у низьких дозах (0,13 мг/кг – 22% - 55%; 0,013 мг/кг – 33% - 45%, р<0,05). Триман, в окремі строки досліджень, знижував вміст МДА з найбільш вираженим ефектом у дозах 3 і 0,03 мг/кг (27%  %, р<0,05). За дії тетрану зниження вмісту МДА виявлено тільки в дозах 3 і 30 мг/кг (2 міс, 29,1% і 33,3% відповідно, р<0,05). Зниження ПОЛ може бути пов’язаним зі зміною в’язкості мембран внаслідок модифікації їх ліпідної фази
(А.В. Бичко, 2001, 2002; А.В. Бичко, В.К. Рибальченко, 2002). Рівень МДА в мітохондріях гепатоцитів за дії івіну мав моно- і бімодальну залежність. За дії триману на всіх рівнях доз спостерігалась U-подібна залежність (рис. 2).

Рис. 2. Криві залежностей вмісту МДА від часу дії івіну і триману на організм щурів

Зі зміною стану ліпідного матриксу мембран, може бути пов’язаний і різний характер змін контрактильності мітохондрій і активності мембранозв’язаних ферментів. Так, івін у дозах 13 і
0,013 мг/кг не змінював функціональний стан мембран мітохондрій гепатоцитів. У дозі 1,3 мг/кг підвищував пасивне набрякання мітохондрій у гіпотонічному розчині сахарози (2 міс, 80%) і активність ЦО (3 міс, 118%). У дозі| 0,13 мг/кг, на фоні більш вираженого зниження ПОЛ, збільшував набрякання мітохондрій в ізотонічному розчині сахарози (1 і 3 міс, 62% і 52% відповідно), що може призвести до інтенсифікації окисно-відновних процесів і порушення ауторегуляторних процесів в них.

Триман у дозі 30 мг/кг (1 міс) викликав достовірне збільшення пасивного набрякання мітохондрій гепатоцитів в ізотонічному (на 43%) і гіпотонічному розчинах сахарози (на 15%), у дозі 3 мг/кг – в ізотонічному (1 і 3 міс на 31% і 45% відповідно) і гіпотонічному розчинах сахарози (2 міс, 77%), активності СДГ (на 43,5%). У дозах 0,3 мг/кг і 0,03 мг/кг збільшення пасивного набрякання мітохондрій спостерігалось тільки в ізотонічному розчині сахарози через 2 міс
на 45% і 65% та зниження активності СДГ через 3 міс на 50% і 58% відповідно. Зміна активності вказаних ферментів може призвести до дестабілізації мембран і порушення функції мітохондрій гепатоцитів.

Тетран не змінював контрактильності мітохондрій. Тільки в дозі 0,3 мг/кг спостерігалось вірогідне зниження активності ЦО (1 міс, 57,3%).

Таким чином, досліджені РРР у різному ступені проявляють мембранотропну активність, яка не залежить від дози і часу дії. Характер кривих залежності вмісту МДА від дози мав моно-, бімодальний, або U-подібний вигляд. Виявлені ефекти були транзиторними. Оскільки за дії досліджених РРР біологічно значимих змін ЕПР-спектрів печінки (вмісту цитохрому Р-450, ЗСБ, ВР і NO) не спостерігалось, то виявлені зміни стану мембран мітохондрій є компенсаторними і пов’язані з адаптивними процесами в організмі.

Відомо, що модифікація структури біомембран і мембранозв’язаних рецепторних і ферментативних систем може призвести до порушення узгодження останніх та змінити клітинні системи сигнальної трансдукції, наслідком чого може бути порушення поділу клітин, білок-синтетичних процесів у клітині (Б. Альбертс, 1994; Н.В. Проказова, 1998).

Встановлено, що івін і тетран не змінювали мітотичний індекс клітин кісткового мозку щурів. Триман викликав вірогідні зміни мітотичного індексу тільки в дозі 30 мг/кг – зменшення через 1 міс (20,8%), збільшення через 3 міс (30,5%) та в дозі 0,03 мг/кг – зниження через 2 міс (20,1%). Оскільки триман не володіє мутагенною активністю, то зниження мітотичного індексу може бути пов’язане з пригніченням білок-синтетичних процесів в організмі. Так, за дії триману в максимальній дозі приріст маси тіла тварин вірогідно зменшувався на 55,6% (3 міс), 3 мг/кг – 50,2% (2 міс), 0,3 мг/кг – 39,3% (2 міс), у мінімальній дозі – 63,6% (2 міс). У дозах 30, 3 і 0,3 мг/кг змін вмісту РНК, ДНК не виявлено. Вміст білку в печінці збільшувався тільки в дозі 3 мг/кг через 1 і 6 місяців досліджень на 59,2% і 18,3% відповідно. У максимальній дозі через 3 міс досліджень спостерігалось збільшення вмісту б2- і зменшення вмісту в-глобулінів сироватки крові відповідно на 38,5% і 37%. У дозі 3 мг/кг через 1 міс виявлено вірогідне збільшення вмісту в-глобулінів (23,6%). В окремі строки досліджень (дози 3 і 0,3 мг/кг) спостерігалась тенденція до підвищення вмісту сечовини і креатиніну в сечі, що, ймовірно, може бути пов’язано з незначною інтенсифікацією розкладу білку. У дозі 0,03 мг/кг триман викликав вірогідне підвищення вмісту РНК (на 24,2% - 31,3%) упродовж 3 міс досліджень. Змін вмісту білку в печінці і сироватці крові не виявлено. Спостерігалось вірогідне збільшення вмісту білку в сечі (3 міс, 33%), що може бути пов’язаним з порушенням фільтраційної функції нирок. У кінці досліджень виявлено збільшення вмісту креатиніну (27%, р<0,05) та сечовини в сечі (28,6%, р>0,05).

Отже, підвищення вмісту НК не відбивається на білок-синтетичній функції печінки. Оскільки змін вмісту альбумінів сироватки крові не виявлено, то перерозподілення б- і в-глобулінів сироватки крові у високих дозах може бути пов’язано з слабким подразненням ретикуло-ендотеліальної системи (И.И. Иванов, 1969). Незначне накопичення продуктів розкладу білків може свідчити про те, що процеси розкладу білку превалюють над процесами синтезу.

За умов субхронічної дії івіну в дозі 13 мг/кг (2 міс) спостерігались незначна інтенсифікація білок-синтетичних процесів і розкладу білку, про що свідчить вірогідне збільшення приросту маси тіла (48,8%), тенденція до збільшення співвідношення РНК/ДНК, вмісту білку в печінці, концентрації сечовини в крові та сечі, креатиніну в сечі (на 15,5 - 23,9%). У дозі 1,3 мг/кг через 2 міс спостерігалось вірогідне підвищення вмісту РНК (35%), величини співвідношення РНК/ДНК (47,4%) та вмісту білку в печінці (46%). Через 6 міс виявлено вірогідне зменшення вмісту білку в печінці (45%), збільшення вмісту б1-глобулінів (34%) і зниження вмісту в-глобулінів сироватки крові (23,7%), активності АЛТ (22%), тенденцію до зниження вмісту сечовини у сироватці крові (21,7%) та сечі (20%). Отримані дані свідчать про те, що івін через 2 міс збільшує інтенсивність синтезу білку, 6 міс – гальмує, що можливо пов’язано з порушенням переамінування амінокислот. У дозі 0,13 мг/кг через 2 міс спостерігалось вірогідне збільшення білку в сечі (36%) та тенденція до збільшення вмісту креатиніну в сечі (27,5%). Через 3 міс виявлено вірогідне зниження вмісту білку в сироватці крові (9,4%), збільшення білку (29,2%) та сечовини (37%) у сечі, що може бути наслідком збільшення розкладу білку і підвищення елімінації продуктів розкладу білку з організму. У дозі 0,013 мг/кг тільки через 1 міс спостерігалось вірогідне збільшення вмісту білку в печінці на 85,3%, б1- та б2-глобулінів – 37,6% і 65,9% відповідно, зменшення вмісту г-глобулінів у сироватці крові на 49,4%. Виявлені зміни вказаних показників, можуть бути пов’язані з незначною дестабілізацію білок-синтетичних процесів в організмі, що носять транзиторний характер.

За умов субхронічної дії тетрану тільки в дозі 3 мг/кг відмічалось підвищення вмісту білку в печінці (1 міс, 26,9%, р<0,05). Вірогідних змін інших досліджених показників не виявлено.

Таким чином, триман і івін при субхронічній дії на організм щурів в окремі строки досліджень інтенсифікують як білок-синтетичні процеси, так і їх розклад. Незначна дестабілізація синтетичних процесів в організмі щурів носить транзиторний характер. Вплив івіну і триману на білок-синтетичні процеси не залежав від дози і часу дії, і був найбільш виразнішим при дії в найменших дозах. Тетран не впливав на білок-синтетичні процеси в організмі щурів.

За дії івіну і триману спостерігались моно- і бімодальна залежність змін показників, що характеризують білок-синтетичні процеси в організмі щурів. Більшість кривих наближались до кривих, характерних для гормезису і, у залежності від дози, їх максимуми лежали в різних площинах, що свідчить про зміну направленості виявлених ефектів.

Відомо, що ксенобіотики, в тому числі і РРР, на відміну від специфічних біорегуляторів, не мають чітко визначених специфічних рецепторів в мембрані, а біологічна інформація передається через ліпідний матрикс мембран (В.К. Рыбальченко, Б.Р. Могилевич, 1990;