НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Кушкіна Алла Іванівна

УДК 578.26:579.842.1/.2

ЛІЗОГЕННИЙ ШЛЯХ РОЗВИТКУ ПОМІРНОГО БАКТЕРІОФАГА ZF40 ERWINIA CAROTOVORA

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім Д.К. Заболотного Національної академії наук України

Науковий керівник– доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Товкач Федір Іванович,

Інститут мікробіології і вірусології ім Д.К. Заболотного

НАН України, завідувач відділу молекулярної

біології вірусів

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Бойко Анатолій Леонідович,

Київський національний університет імені Тараса

Шевченка, професор кафедри вірусології

кандидат біологічних наук, старший науковий

співробітник Нестерова Надія Віталіївна,

Інститут мікробіології і вірусології ім Д.К. Заболотного

НАН України, завідуюча лабораторії репродукції

вірусів

Провідна організація – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 21 березня 2007 року о 12 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Д03680, м. Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий “ 17 ” лютого 2007 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лізогенія є спадковою ознакою бактеріальної клітини, яка визначається здатністю утворювати помірні бактеріофаги в процесі свого розвитку (Lwoff, 1953). Помірні фаги відносяться до автономних генетичних елементів, за допомогою яких відбувається горизонтальне перенесення генів між спорідненими бактеріями (Жакоб, Вольман, 1962). Внаслідок цього, а також за рахунок власних генів, лізогенізація клітин часто супроводжується зміною фенотипу і адаптаційних можливостей бактерій (Canchaya et al., 2003). Одним із важливих аспектів цього процесу є лізогенна конверсія патогенності, яка визначається фаговими генетичними детермінантами.

Фітопатогенні бактерії роду Erwinia є широко розповсюдженими збудниками різноманітних захворювань агрокультур. Незважаючи на масштабні дослідження факторів патогенності цих бактерій (Kotoujansky, 1987), до цього часу їх зв'язок з епісомами, зокрема у E. carotovora subsp. carotovora (Есс), не встановлено. Крім того, що деякі види ервіній, є продуцентами ряду біологічно активних сполук (Озолинь и др., 1975; Фомичев, 1985), Есс розглядається як потенційна генно–інженерна система для клонування та експресії генів (Товкач и др, 2006). Всі вищезазначені обставини вимагають детального дослідження власних автономних генетичних елементів E. carotovora.

Отже, вивчення особливостей лізогенного шляху розвитку помірного бактеріофага ZF40 та його впливу на патогенні властивості пектолітичної бактерії E. carotovora subsp. сarotovora є актуальними і важливими як в науковому, так і в практичному плані.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках наступних науково-дослідних тем відділу молекулярної біології вірусів ІМВ НАНУ: “Молекулярно–генетична організація та біотехнологічне застосування лізогенних систем Erwinia carotovora” (державний реєстраційний номер теми 0105U000788), “Одержання антилейкемічної L–аспарагінази з Erwinia carotovora” (державний реєстраційний номер теми 0102V003706) і “Отримання і використання макромолекулярних бактеріоцинів (каротоворіцинів) Erwinia carotovora для біоконтролю в оточуючому середовищі” (державний реєстраційний номер теми 0104V003200).

Мета і завдання дослідження. Робота виконувалась в рамках теоретичної концепції стосовно видоспецифічності лізогенних систем у бактерій (Товкач, 2003) та лізогенії – як невід'ємної ознаки бактеріальних популяцій (Кишко, 1982).

Основною метою роботи було встановлення особливостей лізогенного шляху розвитку помірного бактеріофага ZF40 фітопатогенної бактерії E. carotovora subsp. carotovora.

Відповідно до мети необхідно було вирішити наступні завдання:

? Створити адекватну індикаторну систему для дослідження лізогенії у Есс

за участю помірного бактеріофага ZF40.

? Одержати і охарактеризувати мутанти clear–типу бактеріофага ZF40.

? Провести комплементаційний аналіз clear –мутантів фага ZF40.

? Дослідити функціональну організацію профага ZF40.

? Виявити зміну фенотипу лізогенних штамів E. carotovora subsp.

carotovora, які несуть профаг ZF40.

? Розробити систему для одержання вірулентних мутантів фага ZF40.

Об'єкт дослідження – лізогенна система фітопатогенної бактерії E. carotovora subsp. carotovora з участю помірного фага ZF40.

Предмет дослідження – генетична та функціональна організація с–області геному фага ZF40.

Методи дослідження – вірусологічні, мікробіологічні, генетичні, молекулярно–біологічні, біохімічні, комп'ютерна обробка даних.

Наукова новизна роботи. Вперше означено генетичну структуру с-області помірного бактеріофага ZF40 фітопатогенної бактерії E. carotovora subsp. carotovora (Есс). Одержано серію фагових мутантів clear-типу і проведено їх комплементаційний аналіз, для проведення якого запропоновано оригінальний метод “дотику зон лізису”. Показано, що с–область фага ZF40 складається з 4 цистронів. Для дослідження лізогенного розвитку фага ZF40 розроблено систему індикаторних штамів Есс.

Вперше описано функціональний стан профага ZF40 в клітинах Есс та його вплив на резидентні дефектні профаги. Досліджено індукцію профага та залежність цього процесу від фізіологічного стану лізогенних клітин цей параметр. Встановлено, що помірний бактеріофаг ZF40 може утворювати лізогени двох типів, які розрізняються за рівнем спонтанної та лізогенної індукції. Показано, що наявність профага ZF40 призводить до дестабілізації дефектної лізогенії в клітинах Есс та збільшує чутливість останніх до кілерної дії коліцинподібних каротоворіцинів. Встановлено, що профаг ZF40 не існує у вигляді кільцевої плазміди.

В роботі вперше описано лізогенну конверсію патогенності E. carotovora. Показано, що лізогенізація фагом ZF40 клітин Есс призводить до відновлення патогенних властивостей слабовірулентного штама-дисоціанта.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень лізогенії за участю фага ZF40 створюють передумови для вивчення патогенності Есс на рівні генетичних детермінант, пов'язаних з помірними бактеріофагами. Представлена робота є підґрунтям для створення оригінальної біотехнологічної системи на основі фагових і плазмідних векторів E. carotovora subsp. carotovora.

Одержані результати можуть бути використані для розробки систем біоконтролю фітопатогенних ервіній в оточуючому середовищі з використанням авірулентних штамів Есс.

Розроблені методики є корисними при вивченні лізогенії і бактеріофагії інших мікроорганізмів.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи, обробку і аналіз результатів досліджень здійснено безпосередньо здобувачем. Автором проведено мутагенез фагових часток ZF40, відібрано та проаналізовано фагові clear –мутанти, здійснено їх комплементаційний аналіз, вивчено адсорбцію фагових часток на чутливих та лізогенних культурах ервіній, спонтанну та лізогенну індукцію профага ZF40, досліджено зміни в структурі клітинної оболонки лізогенів на рівні чутливості до різних кілерних факторів. Виділено нові фагові варіанти ZF40/421 і ZF40spb і одержано та проаналізовано clear –мутанти останнього. Встановлено наявність лізогенної конверсії клітин Есс, лізогенізованих фагом ZF40, запропоновано гіпотезу стосовно фізичної структури профага ZF40.

Визначення ферментативної активності пектатліази і L–аспарагінази і оптимізацію умов зберігання фаголізатів проведено в співробітництві з к.б.н Т.Ю. Горб, к.б.н. Л.В. Романюк і Г.І Панщиною (Одеський національний університет), які є співавторами відповідних публікацій.

Планування напрямку роботи, формулювання основних положень і висновків дисертації проведено під керівництвом наукового керівника, д.б.н. Ф.І. Товкача.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи широко доповідались на міжнародних конференціях: “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск, Белорусь, 2004), “Биоресурсы и вирусы” (Київ, Україна, 2004), 9–й Международной Пущинской школе–конференции молодих ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, Россия, 2005), “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Аллелопатія” (Київ, Україна, 2005), “Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006) і “Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва – Пущино-на-Оке, 2007)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, з них 3 статті в фахових виданнях, 2 статті в збірниках і 7 тез доповідей на наукових конференціях

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка має 4 розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень і списку використаних літературних джерел, що охоплює 180 найменувань. Дисертацію викладено на 143 сторінках машинописного тексту. Ілюстративний матеріал дисертації подано у вигляді 20 рисунків і 16 таблиць.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури, який складається з трьох підрозділів, узагальнено та проаналізовано сучасні дані щодо структури області імунітету найбільш досліджених помірних фагів бактерій родини Enterobacteriaceae, розглянуто організацію та стратегії функціонування відомих профагів. Приділено значну увагу розповсюдженню фагів, лізогенній конверсії та впливу профагової складової на патогенність бактеріальної клітини. Наведено найбільш відомі теорії щодо еволюції бактеріофагів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

В роботі використано 25 штамів E. carotovora subsp. carotovora (Есс), 15 з яких отримані в ході досліджень, 4 штами Escherichia coli, фаги ZF40 Есс, T4, P1 і л E. coli та каротоворіцини MCTV36, CCTV36, CCTV40.

Бактерії вирощували на рідких та агаризованих поживних середовищах наступного складу: повноцінні – LB та NBY, і мінімальні. До останніх як джерело вуглецю додавали глюкозу або лактозу (М9; 0,2 – 0,8%), пектин (РМ; 0,5 – 1%), поліпектат натрію (РРМ; 0,5 – 1%) і протопектин (STM; шматочки картоплі) (Кушкина, Товкач, 2006).

Фаголізати одержували методом зливного лізису. Очистку фаголізатів здійснювали центрифугуванням і фільтруванням. Концентрування фагових часток проводили шляхом освітлення лізатів (Дэвис и др., 1984) та за (Yamamoto et al., 1970). Висококонцентровані лізати стерилізували ультрафільтрацією, а мініпрепарати – додаванням хлороформу без фільтрування. Фагові суспензії зберігали при 4 С в аліквотах по 2-4 мл в буфері STMG, або його модифікованому варіанті STMF (Кушкіна и др., 2004), де замість желатини додавали фікол (3%).

Макромолекулярні і коліцинподібні каротоворіцини отримували за (Товкач, 1998).

Визначення частоти лізогенізації чутливих штамів Есс проводили в рідкому і твердому поживних середовищах (Кушкина, Товкач, 2005). В останньому випадку, із центра негативних плям лізису, утворених фагами на газоні чутливої культури, вирізали невеликі агарові блоки розміром 3х3х3 мм. Після 5-ти годинного інкубування цих блоків в сольовому розчині для середовища М9 при кімнатній температурі визначали титри бактерій і долю лізогенів серед клітин, що вижили. Як контрольні використовували аналогічні неінфіковані зразки з того ж газону. Ступінь лізогенізації індикатора визначали за співвідношенням кількості лізогенів, які утворював фаг ZF40wt і його clear-мутанти в одних і тих самих експериментальних умовах.

Спонтанну індукцію лізогенів Есс 62А-d1(ZF40)19 (далі lys19) і 62А-d1(ZF40)19 (далі lys23), досліджували в поживних середовищах різного складу - NBY, РМ, РРМ, STM, та М9 з глюкозою. Частоту спонтанної індукції (f) визначали за співвідношенням: f=P/BG (Garro, 1973), де Р – титр фагових часток, В – титр культури, G – кількість клітинних генерацій.

Для дослідження лізогенної індукції профага ZF40 використовували мітоміцин С (МС) і налідиксову кислоту (НК). Індукуючий агент додавали на стадії експоненційного росту клітин в середовищі М9 з глюкозою в концентрації 1 і 20 мкг/мл МС і НК відповідно. Частоту лізогенної індукції визначали за співвідношенням Рі/В0, де Рі – титр фага після індукції, В0 – титр клітин перед обробкою індуктором (Garro, 1973). Частоту індукції каротоворіцинів (CTV) визначали аналогічно, як Сі/В0, де Сі – вихід CTV після завершення індукції. Додатково використовували такі параметри як збільшення виходу Рі/Р0 і Сі/С0, а також виживання Ві/В0, де нижніми індексами “0” та “і” позначені величини титрів фага (Р), CTV (В) і бактерій (В) перед та після обробки клітин індуктором відповідно. Для визначення виходу CTV використовували індикаторні штами Есс 66А і E. coli C600.

Патогенність штамів ервіній оцінювали за ступенем мацерації бульб Solanum tuberosum (Zink, 1985) та при вирощуванні їх в середовищі STM (Кушкіна, Товкач, 2006).

Мутагенез фагових часток in vitro проводили з використанням 1М гідроксиламіну (Дэвис и др., 1984) при виживанні фага 0,069 %. Ефективность мутагенезу становила 3 %. Селекцію мутантних фагів clear-типу проводили на газоні штаму Есс RC5297.

Комплементаційний аналіз мутантних фагів здійснювали на газоні штаму Есс 62A-d1 як класичним (Levine, 1957), так і оригінальним методом “дотику зон лізису” (Кушкина, Товкач, 2005). В останньому випадку позитивний результат оцінювали за наявністю помітного росту лізогенних бактерій між зонами, які утворили мутанти різних груп комплементації. При сумісному інфікуванні чутливих бактерій представниками однієї і тієї ж групи даний ефект не спостерігався.

Фагову ДНК виділяли детергент-фенольним методом (Товкач и др., 1988). Плазмідну ДНК одержували за (Kado, Liu, 1981) та (Birnboim, Doly, 1979). В останньому випадку здійснювали 4-6-разове концентрування та додаткову фенольну очистку отриманих зразків. Для аналізу отриманих препаратів використовували рестрикцію ендонуклеазами ClaI, BamHI, HpaI і HindIII з наступним розділенням фрагментів електрофорезом в агарозному гелі.

Для виявлення ферментативної активності штамів Ecc отримували екстрацелюлярну та периплазматичні клітинні фракції (Hu et al, 1992).

Транселіміназну пектолітичну активність визначали за утворенням ненасиченої дігалактуронової кислоти спектрофотометрією при УФ-абсорбції реакційної суміші (л=235 нм) в кварцових кюветах з довжиною шляху 1 см (Zink et al., 1985). Для розрахунку питомої активності пектатліази користувались коефіцієнтом молярної екстинкції 4,800 М-1см-1 (Шевчик и др., 1988), враховуючи концентрацію білка в препараті.

Активність L-аспарагінази визначали згідно (Wrіston, 1970). За одиницю ферментативної активності L-аспарагінази приймали кількість ферменту, яка призводила до вивільнення 1,0 мМ амонію за 1 хв при 37 С. Питому аспарагіназну активність визначали з урахуванням кількості білка.

РОЗДІЛ 3. ХАРАКТЕРИСТИКА С-ОБЛАСТІ ПОМІРНОГО БАКТЕРІОФАГА ZF40 E. CAROTOVORA SUBSP. CAROTOVORA

Для вивчення області геному помірних фагів, яка відповідає за встановлення і підтримання лізогенного стану (с-області), використовують фагові мутанти clear-типу, дефектні по лізогенізації (с-мутанти). Так як спонтанні с-мутанти фага ZF40 виявляються з частотою меншою, ніж 10-4, для одержання серії мутантів цього типу проводили мутагенез гідроксиламіном in vitro (Дэвис и др., 1984). В результаті було відібрано 14 індивідуальних с-мутантів фага ZF40. За ступенем прозорості негативних колоній і зон лізису одержана група мутантів була розділена на два морфологічних типи – І-й та ІІ-типи фагів з повністю прозорими або частково мутними зонами лізису відповідно (рис. 1).

Рис. 1 Морфотипи с–мутантів фага ZF40. 1, 2 – зони лізису с–мутантів I-го морфотипу, 3 – зона лізису с–мутанта II-го морфотипу (ZF40c10), 4 – зона лізису фага ZF40wt.

Відомо, що бактерії роду Erwinia є природними полілізогенами (Perombelon, 1992), тому не виключається можливість індукції інших життєздатних ервініофагів. В зв'язку з цим одержані мутанти ідентифікувализа допомогою рестрикційного аналізу фагових ДНК. Профілі ДНК-рестриктів свідчать про відсутність серед даної серії с-мутантів гетерологічного бактеріофага (рис. 2).

Рис. 2. Електрофореграма ClaI–рестрикційних фрагментів ДНК фага ZF40wt і його с–мутантів в 1% агарозному гелі: 1, 2 – ZF40c6, 3 – HindIIIл, 4 – ZF40wt, 5 – ZF40c3, 6 – ZF40c10, 7 – ZF40c14.

Відомо, що взаємодія між двома фагами с–типу з мутаціями в різних генетичних локусах призводить до відновлення вихідного фенотипу (Levine, 1957; Kaiser, 1957). Для оцінки взаємодії між с-мутантами фага ZF40 здійснювали комплементаційний аналіз як класичним (Levine, 1957), так і оригінальним методом “дотику зон лізису” (рис. 3; Кушкина, Товкач, 2005).

В такий спосіб отримані мутанти було розділено на 4 групи. Мутант с1 залишився некласифікованим, так як доповнював перші дві групи і не взаємодіяв з представниками інших двох груп комплементації. Для подальших досліджень використовували по одному представнику з кожної групи комплементації: мутанти с3, с6, с9 і с10.

Clear-мутанти фага ZF40 були розділені на групи за кількістю бактерій, які вижили після інфікування чутливого штаму (табл. 1).

Таблиця 1

Ефективність лізогенізації штаму Е. сarotovora subsp. сarotovora 62А–d1 фагом ZF40wt і його c–мутантами

Показник | wt ZF40 | Морфологічний тип і номер с–мутанта

I, с6 | I, с3 | II, с9 | II, с10

Кількість часток на зону лізису1 | 1,5·107 | 1,5·107 | 3,7·107 | 2,4·107 | 2,0·107

Кількість бактерій після інфекції | 2,8·107 | 2,6·105 | 4,2·105 | 5,0·105 | 8,0·106

Виживання, % | 2,9 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0,8

Доля лізогенів | 0,22 | <0,05 | 0,075 | 0,36 | 0,46

Кількість лізогенів | 6,2·106 | <104 | 3,2·104 | 1,5·105 | 3,7·106

Відносний рівень лізогенізації, % | 100 | <0,05 | 0,52 | 2,4 | 60

Примітки: 1 – на газон наносили 5 мкл фаголізату.

Найбільше бактерій, що вижили, виявляється в зонах лізису, утворених фагом ZF40wt і його с-мутантами ІІ морфотипу (представники комплементаційних груп – мутанти с9 і с10), ніж в тих, що утворюють мутанти І типу (представники с6 і с3). Для встановлення природи і визначення кількості цих бактерій застосовували оригінальний метод лізогенізації на твердому середовищі (Кушкина, Товкач, 2005).

Виживання клітин в зонах, утворених різними фагами, на газоні штаму Есс 62A-d1, знижувалась до 3,0 – 0,003 % порівняно з неінфікованими бактеріями. Кількість клітин, які пережили фагову інфекцію, добре співвідносилась з морфотипом відповідного с-мутанта. Різний рівень лізогенізації у мутантів окремих груп комплементації свідчить про те, що гени с-області фага ZF40, які відповідають цим групам, забезпечують різні етапи лізогенного розвитку фага ZF40, і, можливо, контролюють встановлення лізогенії.

На основі даних про морфологію негативних колоній і результатів комплементаційного тесту дану серію с-мутантів фага ZF40 було розподілено на 4 групи, які, очевидно, відповідають окремим цистронам в с-області. Вони позначені символами k, l, m та n, і розташовані за порядком зростання ступеню лізогенізації (табл. 2).

Таблиця 2

Загальна класифікація і розподіл clear–мутантів фага ZF40

Тип

мутантів | Група мутантів | Кількість мутантів | Комплементація

k | l | m | n

I | k | 4 | 0 | + | + | +

l | 5 | + | 0 | + | +

II | m | 2 | + | + | 0 | +

n | 2 | + | + | + | 0

Примітки: тут і в табл. 3 “+” - комплементація позитивна; “

0” - мутанти не взаємодіють при сумісному інфікуванні клітин.

Індикаторна система для вивчення лізогенного розвитку помірного бактеріофага ZF40. Для успішного дослідження лізогенії, крім отримання відповідних фагових мутантів, необхідні адекватні індикаторні культури, які були ізогенними дослідним лізогенам. В ідеалі такий фагочутливий індикатор повинен бути спорідненим штамом, позбавленим профага, проте практичне їх отримання є надзвичайно складним, а інколи, практично неможливим (Davidson et al. 1990).

Використання штаму Есс 62А (Товкач, 2002) як індикаторного для фага ZF40, не завжди дозволяло ідентифікувати його як помірний (рис. 4). Однак застосування штамів Есс 62А-d1, RC5297 і RC5297y, які є похідними від штаму Есс 62А, дозволило впевнено розрізняти не тільки вихідний, але й мутантний фагові фенотипи.

При дослідженні ефективності лізогенізації 4-х індикаторних штамів

Рис. 4. Морфологія зон лізису фага ZF40wt і його clear–мутантів на різних штамах Е. сarotovora subsp. сarotovora: а – 62А; б – 62А-d1; в – RC5297; г – RC5297y. Зони лізису фагів: 1 – ZF40wt, 2 – ZF40c6, 3 – ZF40c9, 4 – ZF40c10.

встановлено, що фаг ZF40wt і його мутант с6 репродукуються в їх клітинах з однаковою ефективністю. Фаг дикого типу найбільш ефективно лізогенізував штами RC5297 і RC5297y (лізогенізація складала 9,6 і 7,85% відповідно). Частота лізогенізації фагом ZF40wt штаму Есс 62А-d була нижчою і складала 2,5 %, але ці лізогени мали більшу ефективність росту.

Нездатність фага ZF40 лізогенізувати штам Есс 62А може бути пов'язана з ускладненою адсорбцією фагових часток на поверхні клітин. З'ясувалось, що адсорбція фага на клітинах штамів Есс 62А-d1 і RC5297 має виражений двостадійний характер (рис. 5).

Рис. 5. Адсорбція фага ZF40wt на клітинах різних штамів Е. сarotovora subsp. сarotovora: Р0 – вихідна концентрація фага; Р – концентрація фага в надосаді в певний момент часу.

Як видно з кривих, для цих двох штамів перша стадія прикріплення фагових часток до клітин закінчувалась через 10 – 20 хв після початку процесу. При цьому з поверхневими клітинними рецепторами штамів Есс 62А–d1 і RC5297 зв'язувалось 60 – 80% фага. Подальша взаємодія фага ZF40 з клітинами цих двох культур кардинально відрізнялась. У випадку штама Есс RC5297 повільне насичення адсорбції відбувалось впродовж 40 хв після початку інфекції. В цей же час в системі Есс 62А–d1–фаг ZF40 спостерігалась повільна реадсорбція часток. Етап зворотної адсорбції починався, як правило, після етапу швидкої адсорбції (20 хв) і продовжувався наступні 20 хв. За цей час більш ніж 50% фага виявлялось у вигляді вільних неадсорбованих часток. В цих випадках штамів 62А та RC5297y загальна динаміка прикріплення була дуже повільна, а повний розвиток процесу відбувався в межах 50% неадсорбованих часток. Константи адсорбції (табл. 3) свідчать, що найбільш ефективно прикріплення фагових часток відбувалось на клітинах штама Есс RC5297.

Таблиця 3

Константи адсорбції для фага ZF40wt на клітинах штамів Е. сarotovora subsp. сarotovora

Штам Есc | Множинність зараження, част/кл | Константа адсорбції для 10 хв,

см –3хв –1

62А | 2,0 – 2,4 | 9х10 –9

RC 5297 | 1,0 – 1,35 | 2,2х10 –8

62А–d1 | 1,0 | 3,7х10 –9

RC 5297y | 2,5 | 6х10 –9

Таким чином, для вивчення лізогенного розвитку фага ZF40 доцільним є використання штамів Есс 62А-d1 і RC5297, похідних від Есс 62А.

РОЗДІЛ 4. ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ ПРОФАГА ZF40 В ЛІЗОГЕННИХ КЛІТИНАХ E. CAROTOVORA SUBSP. CAROTOVORA

Головними характеристиками функціонального стану будь–якого профага є його здатність до індукції та імунність (Weisberg et al., 1977), тобто імунітет до зараження гомологічним бактеріофагом, якого набуває клітина після лізогенізації.

Після інфікування клітин штаму Есс 62А-d1 фагом ZF40wt і його с-мутантами були одержані стабільні лізогенні варіанти. Однак вони розрізнялись за здатністю до індукції профага. Лізогени по с-мутантах груп k і l не продукували фаг спонтанно і не реагували на обробку індукторами, лізогени ж по мутантам групи m також не реагували на дію індуктора, але вивільняли фаг спонтанно. Лізогени по мутантам групи n нагадували лізогенів по фагу ZF40wt – були здатні до спонтанної і лізогенної індукції. Всі лізогенні бактерії були стійкі до зараження гомологічним фагом. Серед отриманої серії с-мутантів вірулентних фагових мутантів виявлено не було.

Відомо, що помірні фаги можуть створювати в клітині–хазяїні імунітет до повторного зараження лізогенів за рахунок модифікації власних адсорбційних рецепторів на поверхні клітини–хазяїна (Kanegasaki et al, 1973, Товкач и др., 2002). Встановлення імунітету фагом ZF40 на рівні адсорбції перевіряли в наступних дослідах. Як описувалось раніше, взаємодія фага ZF40 з індикатором Есс 62А–d1 характеризується не тільки адсорбцією часток, але й їх реадсорбцією з поверхні клітини, яка починається через 10–20 хв, в залежності від множинності інфікування. Впродовж перших 10 хв крива б (рис. 6) повністю повторює криву а, що говорить про однакову ефективність адсорбції часток фага на поверхні лізогенних і нелізогенних клітин. При множинності інфікування 15 фагових часток на клітину, після 10 хв від початку інфекції константи швидкості адсорбції часток фага ZF40wt на клітинах безвірусного штаму Есс 62А-d1 і його лізогенізованого варіанта Есс lys23 мають близькі значення – 9,3·10–9 і 5,7·10–9 см –3 хв –1 відповідно. Це свідчить про відсутність адсорбційного бар'єру у ZF40wt-лізогенів.

Рис. 6. Криві адсорбції часток фага ZF40 на клітинах індикаторного штаму Е. сarotovora subsp. сarotovora 62A–d1 (a) і його лізогенного варіанту lys23 (б). Множинність інфекції – 15 часток на клітину. Ро – вихідна концентрація фага; Рх – концентрація фага в надосаді в певний момент часу

Очевидно, що фаг ZF40wt формує внутрішньоклітинний імунітет по відношенню до суперінфікуючої ДНК гомоімунного бактеріофага. Тому, не можна виключати і можливість існування й інших захисних механізмів, зумовлених лізогенною конверсією.

Невдалі спроби виділити вірулентні фагові мутанти, виникнення кількох типів лізогенів і дані незалежних досліджень (Панщина, Товкач, 2006), стали приводом для створення робочої гіпотези, суть якої полягає у внутрішньопопуляційній гетерогенності фага ZF40wt.

Для дослідження функціонального аспекту даної гіпотези із лізогена Есс 62А-d1(ZF40c10)21, який містив мутантний профаг с10, був ізольований фаг і названий ZF40spb. По морфології зон лізису він відносився до ІІ морфотипу, не титрувався на батьківському лізогені, а також на лізогенах по гомологічних фагах. Його мутагенез гідроксиламіном дозволив відібрати серію із 26 с-мутантів, які утворювали абсолютно прозорі негативні колонії, тобто відносились до І морфотипу. Їх комплементаційний аналіз виявив присутність двох основних і однієї додаткової груп (табл. 4), на відміну від фага ZF40wt, у якого було виявлено 4 групи комплементації (див. табл. 2). Група комплементації А містила 5 мутантів, які доповнювали лише половину представників групи С і повністю не комплементували групу В. Виявилось, що група С відповідає групі l (с3), а група В – групі k (с6) с-мутантів фага ZF40wt. Проте, і серед даної серії виявити типовий вірулентний варіант не вдалось.

Виділеня фагового варіанту ZF40/421, здатного до розмноження тільки на лізогені Есс 62А-d1(ZF40c10)21, показало принципову можливість отримання вірулентних мутантів помірного фага ZF40. Аналіз ДНК фага ZF40/421 ендонуклеазою BamHI показав, що він являє собою варіант фага ZF40wt, але має 6 додаткових субмолярних фрагментів.

Таблиця 4

Комплементаційний аналіз clear-мутантів фага ZF40spb

Група комплементації | Кількість мутантів | А | В | С

А | 5 | 0 | 0 | +/0

В | 10 | 0 | 0 | +

С | 10 | +/0 | + | 0

Таким чином, враховуючи можливість одержання вірулентних мутантів, не виключено, що за допомогою лізогенізації нам вдалось розділити популяцію фага ZF40wt, однією з функціональних одиниць якої є фаг ZF40spb. Вирішення проблеми отримання вірулентних мутантів, очевидно, полягає у використанні спеціальних лізогенів, наприклад по фаговим с–мутантам.

Індукція профага. Здатність до індукції є важливою характеристикою профага. Так як Е. carotovora в природних умовах може переходити на альтернативне живлення, засвоюючи речовини пектикової природи, доцільним було встановити вплив складу поживного середовища на спонтанну індукцію профага. Одним з головних живильних компонентів для клітини є джерело вуглецю, тому рівень даної індукції на повноцінному середовищі NBY був найнижчим (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив складу поживного середовища на частоту спонтанної індукції 1

фага ZF40 з лізогенів штаму Е. сarotovora subsp. сarotovora 62A–d1

Поживне середовище | Лізоген Есс

Назва1 | Тип | lys19 | lys23

NBY | І | 5,0 х 10-6 | 1,0 х 10-6

PPM | 0,8 х 10-6 | 7,0 х 10-6

ST1M | ІІ | 1,6 х 10-4 | 2,5 х 10-4

ST2M | 1,4 х 10-4 | 0,5 х 10-4

ST3M | 10 х 10-4 | 3,3 х 10-4

PM | 0,8 х 10-4 | 2,6 х 10-4

M9 | ІІІ | 0,2 х 10-4 | 33 х 10-4

Примітки: 1 – див. Матеріали і методи

Подібною була частота індукції на середовищі РРМ з пектином – природнім джерелом вуглецю для ервіній. Високий ступінь індукції фага на середовищі STM, яке було використане як протопектин, можна пояснити утворенням окислених фенольних сполук рослинного походження (Zink, 1985). Подібні результати були отримані на середовищі РМ з чистим пектином. Частота індукції на середовищі М9 з глюкозою для лізогена lys19 була в 165 разів нижчою, ніж для lys23, що пояснюється дестабілізацією лізогенії в умовах голодування клітини. Чітко виражена різниця в величинах частоти індукції між двома дослідними лізогенами спостерігалась на всіх середовищах.

Ці результати свідчать про те, що у фага ZF40 існують гени, подібні до генів сІІ і сІІІ фага лямбда, які реагують на фізіологічний стан клітини-хазяїна і сприяють встановленню істинної лізогенії (Пташне, 1989).

Обробка лізогенів МС підвищувала частоту індукції фага ZF40 (Рі/В0) на 3-4 порядки. Як і в випадку спонтанного виходу, при лізогенній індукції виявлялась достовірна різниця в її показниках між обома лізогенами (табл. 6). Однак, в обох випадках цей показник був набагато менший, ніж для лізогена E. coli K12(л), що свідчить про більшу ефективність лізогенної індукції профага л, порівняно з профагом ZF40wt.

Можливо, що вказані особливості є наслідком реалізації в клітині двоспрямованого синтезу, який з одного боку веде до утворення життєздатних фагових часток, а з іншого – до утворення каротоворіцинів.

Слід відмітити підсилення індукції каротоворіцинів (Сі/В0) в присутності профага ZF40 під впливом обох індукторів (табл. 6). Обробка лізогенів НК викликала лише збільшення виходу каротоворіцинів, на фоні якого рівень індукції фага не змінювався (табл. 6). Можна стверджувати, що присутність профага ZF40 викликає дестабілізацію дефектної лізогенії Есс.

Таблиця 6

Показники індукції мітоміцином С і налідиксовою кислотою для помірного бактеріофага ZF40 і каротоворіцинів (CTV)

Штам/лізоген | Мітоміцин С | Налідіксова кислота

Рі/В0 | Сі/В0 | Ві/В0 | Рі/В0 | Сі/В0 | Ві/В0

Есс 62A-d1— | 7,2х10–4 | 0,68— | 1,0х10–4 | 24

Ecc 62A-d1(ZF40)19 | 3,13 | 3,1х10–2 | 0,03 | 1,25х10-3 | 4,2х10–2 | 0,17

Ecc 62A-d1(ZF40)23 | 0,18 | 5,0х10–3 | 0,02 | 7,70х10-4 | 1,2х10–4 | 0,04

E. coli K12(л) | 10,75— | 7,0———

Примітки: *– нижніми індексами “0” і “і” позначені показники титрів бактерій (В), фагів (Р) і каротоворіцинів (С) до і після обробки клітин відповідним індуктором; “—” – означає відсутність виходу фага чи бактеріоцина.

Структурна організація профага (гіпотеза). В ході досліджень показано, що профаг помірного бактеріофага ZF40 не виділяється як кільцева плазміда по типу профага Р1. Рестрикційний аналіз плазмідного зразка, виділеного з лізогена lys23, показав наявність в ньому фрагмента ДНК з молекулярною масою 9,3 т.п.н, аналогічного С фрагменту ДНК фага ZF40 (Панщина, Товкач, 2006). В зразку із безвірусного штаму жодних фрагментів, подібних до фагових, знайдено не було. Це дає підстави зробити припущення, що ZF40-профаг може бути лінійним позахромосомним елементом (Casjens et al, 2004; Hertwig et al, 2003; Малинин и др., 1992), однак не можна виключати і можливість його існування у вигляді інтегрованої ДНК.

РОЗДІЛ 5. ЛІЗОГЕННА КОНВЕРСІЯ E. CAROTOVORA SUBSP. CAROTOVORA, ЗУМОВЛЕНА ПРОФАГОМ ZF40

Встановлено, що надбання клітинами Есс профага ZF40 змінює їх чутливість до дії різних каротоворіцинів і неспоріднених фагів, що, скоріш за все, пов'язано з модифікацією поверхневих клітинних структур, які можуть бути фаговими рецепторами.

Відомо, що компоненти зовнішньої клітинної оболонки приймають безпосередню участь в розвитку ефективного патогенного процесу (Милько, Егоров, 1991). В тесті на патогенність виявилось, що природний штам Есс 62А викликав появу так званої “чорної гнилі”, а його дисоціант Есс 62А-d1 призводив до ураження іншого типу, названого нами “білою мокрою гниллю” (рис. 7). Здатність дисоціанта до мацерації відновлювалась після його лізогенізації фагом ZF40.

При вирощуванні дослідних штамів в умовах гетерофази в середовищі STM (Кушкина, Товкач, 2006) характерним було забарвлення культуральної рідини, вигляд і інтенсивність якого корелювали з ураженнями, що спостерігались в тесті на патогенність.

Рис. 7. Ураження, викликані штамом Е. сarotovora subsp. сarotovora 62А (1), його дисоціантом 62A-d1 (2) та лізогенними варіантами останнього – lys19 (3) та lys23 (4) на бульбах картоплі (Solanum tuberosum).

При мікроскопічному аналізі культуральних осадів було виявлено руйнування рослинної тканини до окремих клітин всіма дослідними штамами Есс в середовищі STM. Штами Ecс 62А, lys19 і lys23 не тільки руйнували тканину до окремих клітин, але й викликали деструкцію клітинних оболонок. На відміну від цього, штам–дисоціант Ecс 62А–d1 призводив до утворення, головним чином, клітинних конгломератів.

Ключовим фактором патогенності пектолітичних ервіній є позаклітинна пектатліаза, Pel (Kotoujansky, 1987). З'ясувалось, що максимальна питома активність Pel (ППА) в культуральному середовищі виявляється після 24 год вирощування (табл. 7).

Таблиця 7

Питома пектолітична активність позаклітинної (ЕХ) та периплазматичної (РР) клітинних фракцій штамів E. carotovora subsp. сarotovota (од/мг білка)

Штам/лізоген Есс | 12 год | 24 год | 48 год

EX | PP | EX | PP | EX | PP

62А | 4 | 0,4 | 9 | 14,4 | 2,2 | 8,7

62А-d1 | 1 | 1,7 | 2,3 | 6,8 | 0,8 | 13,6

lys19 | 1,4 | 0,9 | 6 | 12,6 | 0,9 | 22,8

lys23 | 2 | 0,9 | 3,2 | 11 | 0,9 | 18,5

Величина ППА у лізогена Есс lys19 була подібною до рівня вихідного штаму Есс 62А. У лізогена Есс lys23 показник ППА перевищував відповідне значення дисоціанта Есс 62А-d1 тільки в 1,4 рази. Згідно тесту на патогенність, такої позаклітинної активності Pel було достатньо для утворення лізогеном Есс lys23 уражень типу “чорної гнилі”.

Якщо вважати, що зміна питомої активності відбулась за рахунок відновлення транспорту пектатліази з цитоплазми назовні клітини, то при незмінній структурі зовнішньої мембрани показники позаклітинної і периплазматичної ППА, повинні корелювати між собою. Максимальна ППА в периплазмі виявлялась після 48 годин росту культури (табл. 7). Порівняння показників ППА, визначеної після 24 годин росту в обох клітинних фракціях, показало, що як в периплазмі, так і поза клітиною зберігається залежність у величинах ППА між дослідними штамами (рис. 8).

Для підтвердження припущення про специфічність змін в лізогенних клітинах ми визначили питому активність L-аспарагінази (ПАА), яка накопичується в периплазмі. Як видно з табл. 8, ПАА на 12 і 24 год росту у всіх штамів знаходилась практично на одному рівні, і дещо збільшувалась на 48 год культивування. Збільшення периплазматичних показників питомої активності пектатліази і L-аспарагінази (табл. 7 і 8, останні колонки) на 48 год вирощування можна пояснити накопиченням білків при переході клітин до стаціонарної фази росту.

Таблиця 7

Питома аспарагіназна активність (ПАА) периплазматичної фракції штамів E. carotovora subsp. сarotovota (од/мг білка)

Штам/лізоген Есс | 12 год. | 24 год. | 48 год.

62А | 0,3 | 0,2 | 0,35

62А-d1 | 0,3 | 0,3 | 1,02

lys19 | 0,1 | 0,3 | 0,5

lys23 | 0,3 | 0,3 | 2,5

Таким чином, лізогенізація фагом ZF40 призводить до відновлення патогенних властивостей слабовірулентного штама-дисоціанта Есс 62A-d1. Підвищення рівня питомої пектолітичної активності може відбуватись за рахунок відновлення транспорту пектатліази у дисоціанта з цитоплазми назовні клітини.

ВИСНОВКИ

1. Лізогенія E. carotovora subsp. сarotovora за участю помірного бактеріофага ZF40 є унікальною: вона не має аналогів серед загально відомих лізогенних систем.

2. На основі показників ефективності висіву, адсорбції і морфології негативних фагових колоній створено індикаторну систему для вивчення лізогенного шляху розвитку помірного бактеріофага ZF40 Erwinia carotovora subsp. carotovora. Вона включає фагочутливі штами RC5297 і 62A-d1, похідні від E. carotovora subsp. сarotovora 62А.

3. За допомогою мутагенезу гідроксиламіном in vitro одержано 40 мутантів clear-типу фагів ZF40wt і ZF40spb. Застосування запропонованої індикаторної системи дозволило їх віднести до 2 морфологічних типів (І та ІІ), які, в свою чергу, були розподілені на 4 групи комплементації – k, l, m i n. Кожна з цих груп відповідає окремому цистрону с-області.

4. Лізогени, які несуть профаг ZF40, і лізогени по його clear-мутантам, характеризуються суперімунітетом. Останній проявляється набуттям стійкості не тільки до гомоімунних фагів, але й до інфікування вірулентними мутантами. Встановлено що, для виявлення вірулентних мутантів помірного фага ZF40wt необхідне використання спеціальних лізогенів, які несуть профаги clear-мутантів ІІ морфотипу, групи комплементації m.

5. Фаг ZF40 здатний утворювати лізогени двох типів, які розрізняються за рівнем спонтанної та лізогенної індукції. В залежності від доступності джерела вуглецю, частота спонтанної індукції коливається в межах 10-6 – 10-3. На відміну від налідиксової кислоти, мітоміцин С підвищує вихід фага на 3-4 порядки.

7. Наявність профага ZF40wt в клітинах дестабілізує дефектну множинну лізогенію E. carotovora subsp. carotovora. Зміну чутливості до дії коліцинподібних каротоворіцинів класифіковано як вид фагової лізогенної конверсії.

8. Профаг ZF40 здійснює конверсію патогенності у Е. carotovora. Лізогени по фагу ZF40wt виявляють підвищену питому пектолітичну активність в порівнянні з безвірусним штамом.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кушкина А.И., Товкач Ф.И. Индикаторная система для изучения лизогенного развития умеренного бактериофага ZF40 Erwinia carotovora // Мікробіол. журн. – 2005. – т. 67, № 3. – С. 50 – 60 .

2. Кушкина А.И., Товкач Ф.И. Функциональная организация профага и лизогения у Erwinia carotovora с участием умеренного бактериофага ZF40 // Мікробіол. журн. – 2006. – т. 68, № 3. – С. 21 – 32.

3. Кушкина А.И., Романюк Л.В., Горб Т.Е., Товкач Ф.И. Влияние профага ZF40 на секрецию пектатлиазы у Erwinia carotovora // Доп. НАН України. – 2006. – № 6. – С. 154 – 159 (Здобувач отримала лізогенні штами, встановила зміну характеру патогенності у лізогенів, приймала участь у дослідженні ферментативної активності, плануванні експерименту, аналізі і обговоренні одержаних результатів).

4. Кушкіна А.І., Панщина Г.І., Товкач Ф.І. Довгострокове зберігання нестабільних бактеріофагів ентеробактерій