ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ»

Шалькова Марія Юліївна

УДК 618.145 – 006.6 – 036:575.113

РАК ендометрію: МЕТИЛування ГЕНІВ hМLН1

І АРС ЯК ФАКТОРИ РИЗИКУ ТА ЗАКОНОМІРНІСТЬ ПРОГРЕСУВАННЯ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор

Карташов Сергій Михайлович, завідувач кафедри онкологічної гінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Воробйова Люся Іванівна,

Державна установа «Національний інститут раку», керівник науково-дослідного відділу онкогінекології;

доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, завідувач відділу ензимології.

Захист дисертації відбудеться «16» квітня 2008 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.560.01 в Державній установі «Національний інститут раку» (03022, м. Київ, вул. Ломоносова, 33/43).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Національний інститут раку» (03022, м. Київ, вул. Ломоносова, 33/43).

Автореферат розісланий «14» березня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук С.О. Родзаєвський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. У структурі злоякісних новоутворень рак ендо-метрію (РЕ) залишається однією з найпоширеніших форм новоутворень, складаючи 7,9% і посідаючи 4-те місце серед онкологічних захворювань у жінок (Шалімов С.О., Федоренко З.П., Воробйова Л.І., Гулак Л.О., 2006). В останні десятиліття у світі відзначене збільшення захворюваності на РЕ, а показник захворюваності в Україні в період з 1996 до 2006 року збільшився з 20,7 до 25,2 на 100 000 населення (Бюлетень національного канцер-реєстру України №7). Кількість жінок, які захворіли на РЕ в 2006 році, склала 6448 випадків. Чітка тенденція до зростання захворюваності на РЕ відзначена в групі жінок передменопаузального віку (Вишневська К.Ю., 2004).

Основними причинами, що впливають на зростання захворюваності жінок на РЕ, є збільшення тривалості життя, збільшення кількості жінок з нейроендокринно-обмінними порушеннями, збільшення кількості генетичних порушень і не завжди адекватне використання гормональних препаратів з високим вмістом естрогенів. Оскільки для України не характерне, ні збіль-шення тривалості життя, ні широке застосування гормоно-замісної терапії, логічно припустити значну роль нейро-ендокринних порушень та генетичних чинників у зростанні захворюваності на РЕ.

Фактори ризику виникнення РЕ чітко визначені, але їх використання для профілактики РЕ не завжди призводить до бажаних результатів. Це об-ґрунтовує необхідність розробки й вивчення нових критеріїв як для визна-чення ризику розвитку РЕ, так і для прогнозування перебігу цього захворю-вання (Семикоз Н.Г., 2000).

З огляду на фактори ризику, варто пам'ятати, що для розвитку РЕ має значення не стільки кількість факторів, скільки поєднання порушень у двох системах: фенотипу й генотипу (Мельник М.М., 2005).

Виникнення РЕ відбувається на тлі патологічно зміненого ендомет-рію. Однак фонові зміни ендометрію в більшості випадків не трансформу-ються в передрак і РЕ, що обумовлено значною мірою і генетичними факто-рами (Бучинскька Л.Г., Поліщук Л.З., Воробйова Л.І., 2004). В останні роки велика увага приділяється епігеномним порушенням, зокрема питанню метилування генів, яке призводить до порушення функціонування гена. Пору-шення метилування, тобто запрограмована інактивація генів, може призводи-ти до активації протоонкогенів і таким чином сприяти малігнізації. За даними літературних джерел, перспективним напрямком і об'єднуючим моментом у визначені ризику розвитку як передраку, так і РЕ (як гормонозалежного, так і автономного) може бути визначення ролі генів hМLН1 і АРС (Пишак В.П., Сенютович Р.В., Пересунько О.П., 2004; ., ., . et al., 2005).

За даними літератури, інактивація генів hМLН1 і АРС сприяє розвиткові сімейного аденоматозного поліпозу товстої кишки, спадкового неполіпозного колоректального раку (Імянітов Е.М., 2005). Оскільки рак товстої кишки і рак ендометрію відносять до гормонозалежних пухлин, логічно припустити, що ці гени відіграють роль і у виникненні та розвитку раку ендометрію. Механі-зми залучення генів hМLН1 і АРС і їх роль у процесі малігнізації та прогре-суванні РЕ залишається маловивченими та фрагментованими. Саме через від-сутність достатніх критеріїв прогнозу РЕ на сьогодні не відзначено значних успіхів ні в діагностиці, ні в лікуванні захворювання. Дані літератури вказу-ють на можливість використання генів hМLН1 і АРС для оцінки ефективності лікування РЕ та прогнозу захворювання (., ., . et al., 2001).

З огляду на викладене вище, дослідження значення генів hМLН1 і АРС у патогенезі гіперплазій і РЕ є актуальними, оскільки дозволять обґрунтувати нові фактори ризику РЕ і індивідуальні підходи до формування лікувальної тактики та профілактики захворювання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер-таційна робота виконана в межах планової науково-дослідної роботи кафедри онкохірургії та онкогінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти: «Етіопатогенетичні фактори розвитку раку органів репродуктивної системи у жінок і їх вплив на перебіг і рецидивування захворювання», № державної реєстрації 0105В002871. Тема дисертації затверджена РПК № 2 від 17.01.06.

Мета роботи – оцінити значення епігеномних змін генів-супресорів hМLН1 і АРС як маркерів прогресування гіперплазії ендометрію та уточнити їх роль у патогенезі виникнення і прогресування РЕ.

Задачі дослідження:

1. Вивчити частоту метилування генів hМLН1 і АРС у хворих на зало-зисту та атипову гіперплазію ендометрію.

2. Дослідити частоту метилування генів hМLН1 і АРС у хворих на РЕ.

3. Вивчити морфологічні критерії РЕ залежно від метилування генів hМLН1 і АРС.

4. Розробити алгоритм лікування хворих на гіперластичні процеси з врахуванням метилування генів hМLН1 і АРС.

Об’єкт дослідження – хворі на гіперплазію та РЕ.

Предмет дослідження – частота метилування генів hМLН1 і АРС у хворих на гіперпластичні процеси та РЕ, вплив метилування генів hМLН1 і АРС на результати лікування гіперплазії та РЕ.

Методи дослідження – клінічні, морфологічний, молекулярно-генетичний, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше доведено, що роз-виток гіперпластичних процесів і РЕ супроводжується змінами експресії ге-нів-супресорів пухлинного росту, метилування яких спостерігається з найбі-льшою частотою у хворих на атипову гіперплазію ендометрію та РЕ.

Вперше встановлена тенденція до зниження ефективності гормонотера-пії у хворих на гіперплазію ендометрію, що мають епігеномні порушення ге-нів hMLH1 і АРС.

Встановлено, що частота метилування гена hMLH1 частіше зустрічаєть-ся у хворих з ендометріоїдним раком ніж з неендометріоїдним РЕ, що вказує не тільки на істотні морфологічні зміни, а і на функцію зміни геному.

Вперше встановлено, що метилування гена hMLH1 властиве новоутво-ренням з більш високим ступенем диференціювання.

Вперше встановлено, що вірогідно частіше рецидив РЕ виникає у хво-рих з ендометріоїдними формами раку гормононезалежного варіанту, без епі-геномних порушень генів hMLH1 і АРС.

Практична значимість отриманих результатів. На підставі отрима-них результатів доведена можливість використання нових прогностичних критеріїв ризику виникнення РЕ – наявності метилування генів-супресорів hMLH1 і АРС. Розроблено алгоритми лікування хворих із залозистою, реци-дивною та атиповою гіперплазією ендометрію з урахуванням нових прогнос-тичних факторів – наявності метилування генів hMLH1 і АРС, що дозволило індивідуалізувати підходи до лікування хворих. Обґрунтована необхідність раннього хірургічного лікування атипової гіперплазії ендометрію з метою профілактики виникнення РЕ на основі епігеномних порушень. Результати дослідження впроваджені в роботу Харківського обласного клінічного онко-логічного диспансеру та Державної установи «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України .

Особистий внесок здобувача. Ідея дисертаційного дослідження нале-жить доктору медичних наук, професорові Карташову С.М. На підставі ви-вчення даних літератури та проведення патентного пошуку за темою дисер-тації, автором були визначені мета, завдання дослідження і підходи до їх ви-рішення. Здобувачем самостійно проводився набір і формування банку даних первинного матеріалу, клінічне обстеження хворих. Самостійно оброблені й проаналізовані результати дослідження, сформульовані основні положення та висновки дисертації, підготовлені публікації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації до-повідались і обговорювались на клінічних конференціях ХОКОД (2004); нау-ково-практичній конференції «Пухлини жіночих репродуктивних органів» (Харків, 2005); обласній науково-практичній конференції: «Рак тіла матки» (Харків, 2005), ХІ з'їзді онкологів України (Судак, 2006); ІV з'їзді онкологів і радіологів СНД (Баку, 2006); Харківському науковому товаристві онкологів (2006); науково-практичній конференції молодих вчених (Харків, 2006); VIII конференції молодих онкологів з міжнародною участю «Сучасні проблеми експериментальної й клінічної онкології» (Київ, 2007).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в 5 статтях у наукових журналах, 4 матеріалах і тезах конференцій.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційна робота складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, чотири розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, висновків і списку використаної літератури, що містить 157 джерел вітчизняних та зару-біжних авторів. Робота викладена на 140 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 25 таблицями і 11 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В основу роботи покладено аналіз історій хвороби, амбулаторних карток пацієнтів, даних комплексного клініч-ного обстеження хворих, які перебували на стаціонарному лікуванні в Хар-ківському обласному клінічному онкологічному диспансері, Державній уста-нові «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України, Харків-ській обласній клінічній лікарні з 2004 до 2007 року.

До дослідження було включено 364 жінки віком від 35 до 80 років. Ос-новну групу складали 39 пацієнток із залозистою, рецидивною і атиповою гіперплазією ендометрію та 164 пацієнтки хворі на РЕ, у яких було визначено метилування генів hMLH1 і АРС. Контрольну групу склали 105 жінок із зало-зистою, рецидивною та атиповою гіперплазією ендометрію і 56 хворих на РЕ, у яких було відсутнє метилування досліджуваних генів (hMLH1 і АРС). Ком-плексне обстеження всіх жінок включало: гінекологічний огляд, цитологічне дослідження мазків із шийки та порожнини матки, гістологічне вивчення операційного матеріалу, визначення наявності або відсутності метилування генів hMLH1 і АРС у тканині ендометрію. У пацієнток збирали анамнез хво-роби, з'ясовували особливості менструальної, репродуктивної, статевої функ-цій. У всіх випадках діагноз було верифіковано при морфологічному дослі-дженні.

Хворим з діагнозом гіперпластичні процеси ендометрію (залозиста гі-перплазія ендометрію, рецидивна гіперплазія та атипова гіперплазія ендомет-рію) проводили курс гормонотерапії керуючись нормативними документами. Гормонотерапія залозистої гіперплазії, рецидивної гіперплазії ендометрію була проведена з урахуванням вікового періоду жінок, наявністю порушень менструального циклу. У репродуктивному періоді хворі отримували: Депо-Провера 400 мг 1 раз на тиждень внутрішньом'язово, сумарною дозою 4 – 5 г (залежно від ваги тіла) потім, дуфастон 10 мг двічі на день (per os) – 2 місяці в неперервному режимі, потім дуфастон по 10 мг 1 раз на день (per os) протя-гом 2 місяців; у клімактеричному періоді: Депо-Провера 400 мг 1 раз на тиж-день внутрішньом'язово, сумарною дозою 5 – 6 г (залежно від ваги тіла), по-тім, дуфастон 10 мг двічі на день (per os) – 2 місяці в неперервному режимі, потім дуфастон по 10 мг 1 раз на день (per os) протягом 2 місяців; у менопау-зальному періоді – Депо-Провера 400 мг 2 рази на тиждень внутрішньом'язо-во, сумарною дозою 9 – 10 г (залежно від ваги тіла).

Пацієнтки з діагнозом атипова гіперплазія ендометрія отримували гор-монотерапію за схемою: Депо-Провера 1000 мг 1 раз на тиждень внутрі-шньом'язово, сумарною дозою 15 – 18 г (залежно від ваги тіла).

За стадією пухлинного процесу хворі на РЕ розподілялись так: I стадія – 60,9% (Iа – 23,9%, Ib – 43,3%, Iс – 32,8%); II стадія – 24,5% (IIа – 48,1%, IIb – 51,9%) і хворі з III стадією процесу – 14,6%; віком: у репродуктивному пері-оді знаходилося 11,4% жінок, у клімактеричному – 32,7%, у періоді менопау-зи – 55,9%; гістологічною структурою пухлини: ендометріоїдний рак – 87,3%, неендометріоїдний рак – 12,7%.

Визначення метилування генів hMLH1 і АРС було проведено на матері-алі 130 хворих на залозисту гіперплазію ендометрію, 14 – на атипову гіпер-плазію ендометрію, 220 – хворих на рак ендометрію. Після операції дослі-джувану тканину (пухлинну тканину ендометрію розмірами 0,5Ч0,3 см) замо-рожували (до –10…18 єС). Наступним етапом дослідження було виділення ДНК, для чого з тканини одержували гомогенат, до якого додавали протеїна-зу К та інкубували 12 годин при tє 37 С°. Потім робили екстракцію ДНК і по-лімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) за допомогою програмованого термоци-клера фірми «Techne» з використанням термофільної ДНК- полімерази (НПО «Ферментас», м. Вільнюс). Для визначення метилування промоторної ділянки генів hMLH1 і АРС ДНК обробляли метилчуттєвими рестриктазами. Пошук сайтів рестриктації здійснювали за допомогою програми «WIN-SUN». Дослі-дження проводили в лабораторії «Вірола» ХМАПО (зав. лабораторії Куль-шин В.Е.).

Гістологічне дослідження тканин включало вивчення зскрібків з матки, пухлинної тканини ендометрію, лімфатичних вузлів, тканини сальника. Об-робку матеріалу та отримання гістологічних препаратів проводили за станда-ртною методикою.

Усі пацієнтки з патологією ендометрію були розподілені на дві групи за ознакою наявності чи відсутності метилування генів АРС і hMLH1.

У всіх хворих вивчали безпосередні результати лікування. Критеріями оцінки ефективності лікування були тривалість безрецидивного періоду та частота виникнення рецидиву.

Результати досліджень та їх обговорення. Згідно з даними літератури, в 25% випадків протягом одного-трьох років атипова гіперплазія ендометрію переходить в інвазивний рак (Чушкова О.В., 2000). У канцерогенезі РЕ особ-ливо важливу роль відводять генетичним факторам, а також епігеномним змінам функціонування генів (Берштейн Л.М., 2004). Проте, у доступній літе-ратурі нам не вдалося знайти даних про роль метилування генів hMLH1 і АРС у розвитку залозистої гіперплазії ендометрію і її подальшого прогресування в атипову гіперплазію і РЕ (Mutter G.L., 2000). З цією метою обстежених хво-рих було розподілено на дві групи: перша група – 78 осіб з вперше встанов-леним діагнозом залозистої гіперплазії ендометрію; друга група – 52 жінки з рецидивною гіперплазією, у яких ця патологія була діагностована повторно. Після встановлення діагнозу хворі одержували лікування синтетичними про-гестинами у термін від 3 до 6 місяців, а потім перебували під спостереженням гінеколога за місцем проживання.

Було встановлено, що частота метилування гена hMLH1 у хворих на за-лозисту гіперплазію, діагностовану вперше, склала 7,7±3,1%, а в групі хворих на рецидивну гіперплазію – вірогідно зросла до 23,1±5,8%. У хворих на ати-пову гіперплазію ендометрію частота епігеномних порушень збільшилася до 28,6±12,1% випадків. При метилуванні гена АРС були отримані наступні да-ні: у хворих на залозисту гіперплазію ендометрію, діагностовану вперше, час-тота метилування склала 7,7±2,7%; у хворих на рецидивну гіперплазію ендо-метрію – 15,4±5,0%, а у хворих на атипову гіперплазію ендометрію – 21,4±10,9% випадків. Отже, за ступенем прогресування захворювання (гіпер-плазія ендометрію > рецидивна гіперплазія ендометрію > атипова гіперпла-зія ендометрію) частота епігеномних порушень досліджуваних генів зростає (рис. 1).

Рис. 1. Частота метилування генів hMLH1 і АРС у хворих з гіперпла-стичними процесами ендометрію.

За даними літератури, розвиток гіперплазії ендометрію і її подальше прогресування залежать від гормональних порушень. Причому ці зміни по-різному реалізуються у жінок різного віку (Воробйова Л.І., 2005; Умаханова М.М., 1997). Тому ми проаналізували дані про частоту метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на гіперплазію ендометрію та рецидивну гіперплазію залежно від віку жінок.

У хворих репродуктивного віку з гіперплазією ендометрію, що вперше діагностована, метилування гена hMLH1 визначено тільки в 2,3%, а гена АРС – у 6,8% випадків. У хворих клімактеричного періоду з аналогічною патологі-єю епігеномні порушення гена hMLH1 виявлені в 14,8%, а у 14,3% випадків у хворих у періоді менопаузи. Порушення функції гена АРС відзначено відпо-відно в 7,4% і 14,3% випадків. Вірогідних змін нами не встановлено, проте слід відзначити тенденцію до збільшення частоти порушення функції гена hMLH1 у хворих клімактеричного віку порівняно з репродуктивним. У хво-рих на рецидивну гіперплазію в репродуктивному періоді частота метилуван-ня генів hMLH1 і АРС була однаковою: 12,5% і 12,5%, у клімактеричному періоді – 29,2 % і 16,7% випадків і в періоді менопаузи – 25,0% і 16,7% випа-дків відповідно. У всіх хворих на гіперплазію ендометрію (діагностовану і вперше, і повторно) найбільші зміни були виявлені для гена hMLH1. Так, час-тота метильованого гена hMLH1 у хворих репродуктивного віку була виявле-на в 5,0±2,8% випадків, у клімактеричному періоді зросла до 21,6±5,8% (р<0,05), а у періоді менопаузи практично не змінилася порівняно з клімакте-ричним періодом, і склала 21,1±9,3%. Тобто вірогідні зміни досліджуваних генів залежно від віку виявлені для гена hMLH1 в преклімактерічному пері-оді, для якого більш характерні гормональні порушення.

Отже, нами встановлено, що між різними видами гіперплазії ендометрію є не тільки істотні морфологічні, а й генетичні розбіжності. Зокрема, за сту-пенем зростання морфологічних змін в ендометрії частіше зустрічається по-рушення функції гена hMLH1, відповідального за репарацію ДНК, ушко-дження якої найчастіше виникають під час поділу клітини. Необхідно врахо-вувати, що такі зміни відбуваються в ендометрії, біологічна особливість якого обумовлена його гормонозалежністю і динамічністю клітинного складу. Так, ендометрій репродуктивного періоду здатний щомісяця обновляти майже весь свій клітинний склад, тобто, ендометріальні клітини первинно запрогра-мовані на частий поділ. У клітинах, що часто діляться, частіше виникають незначні ушкодження ДНК, що не є патологією і не призводить до серйозних ускладнень, оскільки в нормі існують механізми, що відповідають за репара-цію таких ушкоджень, і клітина знову набуває нормальних властивостей (Сойфер В.Н., 1997). У випадку, якщо в жінки є метилування гена hMLH1 в ендометрії, тобто функція цього гена блокована, репаративні процеси ДНК порушуються, внаслідок чого вчасно невиправлена структура ДНК, навіть при незначному її ушкодженні, дає нащадкам клітин ендометрію змінені ге-нетичні властивості. Процес канцерогенезу в ендометрії, за участю порушеної функції гена hMLH1, є досить тривалим. Це дозволяє первісно несуттєвим змінам у генотипі клітини ендометрію, поступово, минаючи тим самим «за-хисний кордон варти генома» гена р53, трансформуватись у неопластичні клітини. Отримані результати дають підстави припустити інший причинно-наслідковий зв'язок у канцерогенезі ендометрію при порушенні функції гена АРС порівняно з геном hMLH1, що вимагає подальших досліджень у тісній співпраці з морфологами.

Ми вивчили частоту метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ за-лежно від стадії захворювання. Проведеними дослідженнями з’ясували, що у хворих на РЕ є значна частота епігеномних порушень функцій як гена hMLH1 (43,6±3,3%), так і гена АРС (30,9±3,1%) (р<0,01). З поширеністю злоякісного процесу частота метилування гена hMLH1 практично не змінюється (Iа ст. – 37,5±8,6%, Iв – 46,6±6,6%, Iс – 43,2±7,5%, IIа – 42,3±9,9%, IIв – 46,4±9,4%, III ст. – 43,8±8,8%). Разом з тим частота порушень функції гена АРС коливається (Iа ст. – 15,6±6,4%, Iв – 32,8±6,2%, Iс – 34,1±7,1%, IIа – 26,9±8,7%, IIв – 28,6±8,5%, III ст. – 43,8±8,8%). Отримані дані про високу частоту метилуван-ня генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ вказують, що обидва досліджуваних гени мають значення в розвитку РЕ, а відсутність чіткого зв'язку з поширеніс-тю процесу свідчить про їх незначний вплив на прогресування захворювання, що простежується тільки в гена АРС.

Розвиток РЕ має чітку вікову закономірність, тому ми вивчили частоту метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ з урахуванням віку пацієнток (рис. 2).

Встановлено, що частота метилування гена hMLH1 у репродуктивному періоді виявлена в 20,0±8,0%, у клімактеричному періоді – у 38,8±5,7% хво-рих (0,1>р>0,05), а в менопаузі – у 51,2±4,5% хворих (р<0,01). Частота метил-ування гена АРС в усіх вікових групах виявилася практично ідентичною: 32,0±9,3%; 30,6±5,4% і 30,9±4,2% випадків відповідно. Отже, зв'язку між час-тотою епігеномних порушень гена АРС і віковим періодом хворих на РЕ встановити не вдалося, на відміну від метильованого гена hMLH1.

Рис. 2. Частота метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ з урахуванням віку пацієнток.

При порівнянні частоти метилування обох генів розбіжностей, що за-лежали від вікового фактора хворих на РЕ, у репродуктивному та клімактери-ному періодах не виявлено (р>0,05). У той же час у хворих віком понад 56 років вірогідно (р<0,01) частіше зустрічаються порушення функції гена hMLH1. Встановлено також, що середній вік пацієнток з метильованим геном hMLH1 склав 63,8 року, а вік хворих, у яких був метильований ген АРС, – 54,3 року.

Проведеними дослідженнями доведено, що метилування, тобто пору-шення функції гена hMLH1, виникає в старшому віці, частіше в менопаузі, а метилування гена АРС виникає раніше, починаючи з репродуктивного віку. У всіх вікових групах хворих виявлена більша частота порушень гена hMLH1. Виявлені зміни вказують на загальногенетичну закономірність: зі збільшен-ням віку зростає кількість генетичних порушень. Ця залежність збігається із закономірностями розвитку РЕ при I патогенетичному варіанті. За нашими даними, частота порушень функції гена АРС мало залежить від віку. Ці пока-зники більш характерні для закономірностей канцерогенезу РЕ II патогенети-чного варіанта й, на наш погляд, можуть бути пов'язані з тим, що метилуван-ня даного гена виникає в молодому віці. Імовірно, порушення функції цього гена є одним з пускових механізмів розвитку РЕ і в поєднанні з іншими фак-торами, більшість з яких не вивчені (Імянітов Е.М., Хансон К.П., 1998), ген АРС реалізує свою негативну дію у вигляді розвитку карциноми ендометрію. Тривалість канцерогенезу при РЕ II патогенетичного варіанта залежить від багатьох факторів, унаслідок чого РЕ розвивався у жінок в різні вікові пері-оди. Саме тому, імовірно, епігеномні порушення функції гена АРС при РЕ зустрічається з однаковою частотою у хворих різного віку.

Оскільки, в розвитку РЕ виділяють два патогенетичних варіанти, ми ви-вчили частоту метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ з їх урахуван-ням (табл.).

Таблиця

Частота метилування генів hMLH1 і АРС

у хворих на РЕ з урахуванням патогенетичного варіанту

Патогенетичний варіант | Частота метилування гена, n, %

А. hMLH1 | В. АРС | С. Контроль

I

n = 127 |

68(53,5±4,4) | *А

49(38,6±4,3) |

10(7,9±2,4)

II

n = 93 | **I

28(30,1±4,8) | **I

19(20,4±4,1) |

46(49,5±5,2)

Всього

n = 220 |

96(43,6±3,3) | **А

68(30,9±3,1) |

56(25,5±2,9)

Примітки:

*А – розбіжність вірогідна відносно показника групи А (р<0,05)

**А – розбіжність вірогідна відносно показника групи А (р<0,01)

**I – розбіжність вірогідна відносно показника групи I (р<0,01)

У хворих з I гормонозалежним варіантом частота метилування гена hMLH1 була виявлена в 53,5±4,4%, а гена АРС – 38,6±4,3% випадків (р<0,05). У хворих, гормононезалежним варіантом, частота метилування гена hMLH1 була виявлена в 30,1±4,8%, а гена АРС – 20,4±4,1% випадків. Тобто, епігено-мні порушення досліджуваних генів при II варіанті зустрічаються рідше, ніж при I (р<0,01). Однак, порушення функції генів hMLH1 і АРС характерні як для I, так і для II патогенетичного варіантів РЕ.

Гістологічна структура є однією з головних характеристик злоякісної пухлини, від якої залежить перебіг захворювання (Бохман Я.В., Лившиц М.А., Вінокуров В.Л., Максімов С.Я., 1993). Ми вивчили частоту метилуван-ня генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ з урахуванням гістологічної будови пухлини (рис. 3). Встановлено, що при ендометріоїдних формах раку частота метилування гена hMLH1 склала: у хворих з ендометріоїдною аденокарцино-мою – 47,5±3,4% випадків, а у хворих з аденоакантомою – 33,3±15,7% випад-ків (р>0,5). Частота метилування гена hMLH1 при неендометріоїдних формах РЕ склала: у хворих із серозно-папілярною аденокарциномою – 25,0±12,5% випадків і у хворих із світлоклітинною аденокарциномою – 18,8±9,8% випад-ків. Отже, у хворих на ендометріоїдні форми раку частота метилування гена hMLH1 встановлена в 46,9±3,6% випадків, а у хворих на неендометріоїдні форми – в 21,4±7,8% випадків (р<0,01).

Рис. 3. Частота метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на РЕ з урахуванням гістологічної будови пухлини.

Метилування гена АРС було виявлено в 30,9±3,1% хворих на РЕ. При ендометріоїдних формах РЕ частота метилування гена АРС склала 31,3±3,3% випадків, а при неендометріоїдних формах була встановлена в 28,6±8,5% ви-падків.

Аналіз частоти метилування гена АРС у хворих з різними гістологічни-ми варіантами ендометріоїдного РЕ показав наступне. Так, при ендометріоїд-ній аденокарциномі метилування гена АРС було виявлено у 31,1±3,4% випад-ків, а при аденоакантомі були отримані практично ідентичні дані – 33,3±15,7% випадків.

Частота епігеномних порушень гена АРС у хворих з різними гістологіч-ними варіантами неендометріоїдного РЕ мала значну відмінність. Зокрема, у хворих із серозно-папілярною аденокарциномою частота метилування дослі-джуваного гена (41,7±14,2% випадків) була в 2,2 раза вища порівняно з ана-логічним показником у хворих на світлоклітинну аденокарциному (18,8±9,8% випадків), але незначна кількість спостережень не дозволяє встановити віро-гідної розбіжності.

Ступінь диференціювання пухлини, як і стадія захворювання, є одним з основних параметрів, що визначають лікувальну тактику та прогноз при РЕ (Бохман Я.В., Лившиц М.А., Вінокуров В.Л., Максімов С.Я., 1993; Воробйо-ва Л.І., 2006). Однак навіть у межах клінічно однорідних груп пацієнток, РЕ характеризується високою гетерогенністю перебігу й відповіді на терапію; очевидно, в межах того самого морфологічного типу пухлин приховуються кілька різновидів захворювання, що різняться за своїм молекулярним патоге-незом. У цьому зв'язку нами була вивчена частота метилування гена hMLH1 і АРС у хворих на ендометріоїдні форми РЕ залежно від ступеня диференцію-вання пухлини. Встановлено, що у хворих на РЕ в кожному другому випадку виявлено метилування гена hMLH1 при високодиференційованій (53,3±6,4%) і помірнодиференційованій (51,3±5,7%) аденокарциномах і лише в 33,3±6,4% випадків аналогічне порушення функції гена hMLH1 встановлено при низь-кодиференційованому раку. Тобто метилування гена hMLH1 властиве ново-утворенням з більш високим ступенем диференціювання.

Частота метилування гена АРС виявлена в кожному третьому випадку у хворих з високодиференційованою (31,6±6,2%) і помірнодиференційованою (37,8±5,6%) аденокарциномою і в кожному четвертому – у хворих з низькодиференційованою формою (26,9±6,1%) РЕ. Аналіз частоти епігеномних порушень гена АРС у групах хворих залежно від ступеня диференціювання пухлини не виявив чіткої тенденції у зміні показників.

При зіставленні частоти метилування генів hMLH1 і АРС залежно від ступеня диференціювання пухлини нами встановлені принципові відмінності у хворих на РЕ з високим ступенем диференціювання – частота епігеномних порушень гена hMLH1 була вірогідно вища порівняно з частотою порушення функції гена АРС (р<0,01). У хворих з помірнодиференційованими формами РЕ достовірних змін не відзначено, однак досить чітко простежується тенде-нція до більш частого епігеномного порушення гена hMLH1 порівняно з ге-ном АРС. При низькодиференційованих аденокарциномах ендометрію часто-та метилування досліджуваних генів не мала істотної відмінності.

Отже, проведені дослідження дозволили виявити зв'язок між пору-шенням функції гена hMLH1 і морфологічними особливостями захворюван-ня. При більш диференційованому РЕ ми частіше виявляли порушення функ-ції гена hMLH1 у вигляді метилування, що дозволяє припустити зв'язок між гормональним канцерогенезом, характерним для I патогенетичного варіанта, і метилуванням гена hMLH1. Проте зв’язок між метилуванням гена АРС і сту-пенем диференціювання пухлини не простежується.

Одним з основних методів лікування гіперплазії ендометрію є гормоно-терапія (Антонова І.Б., 1999; Татарчук Т.Ф., 2006). Але ефективність гормо-нотерапії у пацієнтах різних вікових групах різна, що обумовлено багатьма причинами, до яких належать і генетичні фактори. Ми оцінили ефективність гормонотерапії з урахуванням метилування генів hMLH1 і АРС, сподіваю-чись на те, що результати можуть стати критерієм вибору (обґрунтування) гормонотерапії. Нами встановлено, що без урахування метилування дослі-джуваних генів ефект від проведеної гормонотерапії спостерігався в 73,61±3,67% (у 106 пацієнток з гіперплазією ендометрію), а неефективною гормонотерапія виявилась у 26,39±3,67% (у 38 осіб). У групі жінок, де ген hMLH1 був неметильований, гормонотерапія виявилась ефективною в 77,05±3,8%, а з наявністю метильованого гена hMLH1 – в 54,55±10,6% випад-ків (р<0,05). Отримані результати вказують на нижчу ефективність гормоно-терапії у хворих з метильованим геном hMLH1.

У групі жінок з гіперплазією ендометрію та геном АРС без епігеномних порушень, позитивного ефекту від проведеної гормонотерапії було досягнуто у 76,38±3,78% випадків, а в групі жінок з порушенням функції гена АРС – тільки в 52,94±12,1% випадків. При порівнянні результатів ефективності гор-монотерапії у хворих з метильованим і неметильованим геном АРС виявлена майже вірогідна різниця (0,1>р>0,05), що пов’язано з малою кількістю хво-рих, тобто простежується чітка тенденція до зниження ефективності гормоно-терапії у хворих на гіперплазію ендометрію з епігеномними порушеннями гена АРС (рис. 4а, 4б).

Рис. 4а. Ефективність застосування гормонотерапії у хворих з гіперпластич-ними процесами ендометрію залежно від метилування генів hМLН1.

Рис. 4б. Ефективність застосування гормонотерапії у хворих з гіперпластич-ними процесами ендометрію залежно від метилування генів АРС.

Ми оцінили частоту рецидивування РЕ з урахуванням метилування генів hMLH1 і АРС. Усього, без урахування стадії захворювання, у хворих контро-льної групи рецидив РЕ зустрічався в 19,6±5,3% випадків. У групі жінок з виявленими епігеномними порушеннями гена hMLH1, рецидив РЕ був вияв-лений у 5,2±2,2%, а в пацієнток з порушенням функції гена АРС частота ре-цидиву склала 5,9±2,9% випадків. Таким чином, при порівнянні аналізованих груп, є вірогідні дані, які свідчать, що рецидив частіше спостерігається у хво-рих з нормальною функцією генів (р<0,05) (рис. 5).

Рис. 5. Частота рецидивування РЕ з урахуванням метилування генів hМLН1 і АРС.

Залежно від стадії захворювання і метилування генів hMLH1 і АРС були отримані наступні дані. Усього у хворих з I стадією процесу рецидив захво-рювання був виявлений у 4,5% випадків, а в контрольній групі – у 13,5%. У групі з епігеномними порушеннями гена hMLH1 рецидив не виник у жодному випадку, а у хворих з епігеномними порушеннями гена АРС – 2,6%. У хворих з II стадією РЕ рецидив захворювання мали в 11,1% порівняно з 26,7% випад-ків у контрольній групі. У групі з порушенням функції гена hMLH1 частота розвитку рецидиву склала 8,3%, а в групі з епігеномними порушеннями гена АРС рецидиву не було у жодному випадку. При III стадії захворювання реци-див РЕ зустрічався в 25,0% випадків, а в контрольній групі – 50,0%. У групі пацієнток з наявністю метильованого гена hMLH1 рецидив РЕ був виявлений у 21,4% випадків і в 21,4% у групі жінок з виявленими порушеннями функції гена АРС.

Також ми оцінили частоту рецидивування РЕ залежно від віку хворих та метилування генів hMLH1 і АРС. У хворих репродуктивного періоду рецидив захворювання виник у 12,0±6,5% випадків, а в контрольній групі – у 16,7±10,8%. У групі з епігеномними порушеннями гена hMLH1 рецидив за-хворювання виявлений не був, а в групі пацієнток з метилуванням гена АРС рецидив зустрічався в 12,5±11,7% випадків. Можна відзначити, що у хворих репродуктивного періоду простежується тенденція до збільшення частоти виникнення рецидиву в групі без порушення функції досліджуваних генів.

У групі хворих клімактеричного періоду рецидив захворювання зустрі-чався в 9,7±3,5% випадків порівняно з 18,2±8,2% – у пацієнток контрольної групи. У групі з наявністю метилування гена hMLH1 рецидив РЕ виник у 7,1±4,9%, а в групі з епігеномними порушеннями гена АРС – 4,5±4,4% випад-ків. Можна відзначити, що у хворих клімактеричного періоду й відсутністю епігеномних порушень досліджуваних генів рецидив захворювання виникає в 2,5 раза частіше, ніж у хворих з порушенням функції гена hMLH1, і в 4 рази частіше, ніж у хворих з порушенням функції гена АРС. Отже, у хворих кліма-ктеричного періоду простежується тенденція до збільшення частоти виник-нення рецидиву в групі, де досліджувані гени нормально функціонують.

Всього у хворих жінок у періоді менопаузи рецидив захворювання вияв-лений в 8,1±2,5% випадків. У контрольній групі частота виникнення рециди-ву склала 22,7±8,9% випадків, у хворих з наявністю метильованого гена hMLH1 в 4,5 раза нижче, ніж у групі контролю – 4,8±2,7% випадків (0,1>р>0,05), а в групі пацієнток з виявленими епігеномними порушеннями гена АРС частота виникнення рецидиву була в 4 рази нижча, ніж у контроль-ній групі, і склала 5,3±3,6%. При порівняльному аналізі хворих контрольної групи і групи хворих з метилуванням досліджуваних генів, простежується близька до вірогідної розбіжність (0,1>р>0,05). Отже, у хворих жінок у пері-оді менопаузи з відсутністю метилування досліджуваних генів рецидив за-хворювання виникає частіше, ніж у хворих з метилуванням генів hMLH1 і АРС.

Ми розглянули частоту рецидивування РЕ залежно від гістостологічної структури пухлини й метилуванням генів hMLH1 і АРС. У контрольній групі хворих з ендометріоїдними форми раку, частота виникнення рецидиву склала 16,7±5,8%. У групі пацієнток з ендометріоїдними формами раку й метилуван-ням досліджуваних генів виникнення рецидиву спостерігалось у 4,7±1,7% випадків. При порівняльному аналізі хворих з ендометріоїдними формами раку без епігеномних порушень досліджуваних генів і, групи хворих з пору-шенням функції досліджуваних генів, виявлена вірогідна розбіжність (р<0,05). Отже, у групі хворих з ендометріоїдними формами раку вірогідно частіше виникає рецидив, де відсутні епігеномни порушення досліджуваних генів.

У контрольній групі пацієнток з неендометріоїдними формами раку час-тота виникнення рецидиву склала 28,6±12,1%. У групі жінок з епігеномними порушеннями генів hMLH1 і АРС частота виникнення рецидиву склала 14,3±9,3% випадків (р>0,05). Таким чином, у хворих з ендометріоїдними фо-рмами раку вірогідно частіше виникає рецидив захворювання, де досліджува-ні гени hMLH1 і АРС неметильовані; для хворих на неендометріоїдні форми раку відзначена аналогічна залежність, однак у вигляді тенденції.

Аналіз результатів лікування залежно від патогенетичного варіанту роз-витку РЕ показав наступне: у групі з виявленими епігеномними порушеннями гена hMLH1, при I патогенетичному варіанті частота виникнення рецидиву склала 1,5%; при II патогенетичному варіанті – 14,2%, а в контролі – 21,7%. У хворих з виявленими порушеннями функції гена АРС, рецидив РЕ при I пато-генетичному варіанті виник у 4,1%, а при II варіанті – 10,5% випадків. Отже, простежена чітка тенденція до збільшення частоти виникнення рецидиву у хворих з II патогенетичним варіантом розвитку РЕ і відсутністю метилування досліджуваних генів (контрольна група).

З урахуванням усіх вищевикладених положень та результатів нами були запропоновані алгоритми лікування хворих репродуктивного віку з гіперпла-зією ендометрію (рис. 6, 7).

Таким чином, проведеними дослідженнями встановлено взаємозв'язок між метилуванням генів hMLH1 і АРС та ризиком розвитку РЕ у хворих з гіперпластичними процесами ендометрію; оцінено вплив цих генів на ефек-тивність гормонотерапії гіперплазії ендометрію; визначено зв'язок між мор-фологічними властивостями пухлини і метилуванням генів hMLH1 і АРС; встановлено вплив цих генів на перебіг пухлинного процесу і ризик рециди-вування захворювання. На підставі отриманих даних доведена можливість використання при РЕ нових прогностичних критеріїв – наявності метилуван-ня генів hMLH1 і АРС, що дозволило індивідуалізувати підходи до лікування хворих. Обґрунтована необхідність раннього хірургічного лікування атипової гіперплазії ендометрію з метою профілактики виникнення РЕ на основі епіге-номних порушень.

ВИСНОВКИ

У дисертації на великому клінічному матеріалі встановлена зміна ре-гуляції експресії генів hMLH1 і АРС шляхом їх метилування при гіперплас-тичних процесах і РЕ, що має значення для клінічного перебігу цих процесів.

1. Аналіз частоти метилування генів hMLH1 і АРС у хворих на гіпер-плазію ендометрію, рецидивну гіперплазію, атипову гіперплазію та РЕ свід-чать що обидва досліджуваних гени мають значення в розвитку атипових і неопластичних змін в ендометрії, бо за ступенем прогресування хвороби від-мічається збільшення порушень функції генів hMLH1 і АРС у 3 і 2,5 раза від-повідно.

2. У хворих з гіперпластичними процесами (залозиста, рецидивна та атипова гіперплазії) і епігеномними порушеннями генів hMLH1 і АРС ефект від гормонотерапії синтетичними прогестинами зменшується вдвічі (при по-рушенні функції гена hMLH1 ефект був відсутній у 45,5%, а гена АРС – у 47,1% випадків), що можна пов’язати зі зниженням репаративних властивос-тей генів.

3. Частота метилування гена hMLH1 у хворих на РЕ не залежить від поширеності пухлинного процесу. А частота метилування гена АРС залежить від поширеності процесу, оскільки збільшується у хворих з III стадією (I ст. – 29,1%, II ст. – 27,8%, III ст. – 43,8%).

4. Порушення функції гена hMLH1 у хворих на РЕ (43,6%) виникає у старшому віці, частіше в менопаузі (у репродуктивному віці – 20,0%, клімак-теричному – 38,9%, у менопаузі – 51,2%), а метилування гена АРС (30,9%, р<0,01) виникає з репродуктивного віку (32,0%, 30,6% і 30,9% відповідно).

5. Метилування гена hMLH1 вірогідно частіше зустрічається у хворих з ендометріоїдними формами РЕ (46,9%, р<0,05) порівняно з неендометріоїд-ними формами (21,4%). Для гена АРС такої залежності не встановлено (31,3% і 28,6% відповідно).

6. Встановлено, що розвиток рецидиву РЕ не пов’язаний з метилуван-ням генів hMLH1 і АРС , що вказує на включення у прогресію пухлинного процесу ряду інших геномних порушень.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Карташов С.М., Шалькова М.Ю., Яковлева Н.Г. Метилирование гена АРС и рак эндометрия // ХI з’їзд онкологів України: Матеріали з’їзду. 29 травня – 02 червня 2006 р. м. Судак, АР Крим. – К., 2006 – С.27.

2. Шалькова М.Ю. К вопросу метилирования генов hMLH1 и АРС при раке эндометрия // Харківська хірургічна школа. – 2006. – № 2. – С.