Національна академія наук України

Iнститут молекулярної бiологiї та генетики НАНУ

На правах рукопису

Cолоденко Анжела Євгенiвна

УДК 575.11.113:854.78

Дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму соняшника за допомогою аналiзу довiльно амплiфiкованої ДНК

03.00.26-молекулярна генетика

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеню

кандидата бiологiчних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі генної інженерії Селекційно-генетичного інституту УААН (м.Одеса)

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор,

член-кор. УААН

Сиволап Юрій Михайлович,

Селекційно-генетичний інститут УААН, зав.відділом

генної інженерії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Малюта Станіслав Станіславович

завідувач відділом молекулярної генетики

Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

кандидат біологічних наук

Комарницький Ігор Климентійович

старший науковий співробітник

Інституту клітинної біології і

інженерії НАН України

Провідна установа:

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України

Захист дисертації відбудеться 20 квітня 1999 р. о 10 год. На засідінні Спеціалізованої Вченої Ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул. Заболотного, 150

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту Молекулярної біології і генетики НАН України

Автореферат розіслано 19 березня 1999 р.

Вчений секретар Спеціалізованої Вченої Ради

кандидат біологічних наук Л.Л.Лукаш

Актуальнiсть проблеми. Соняшник є однiєю з найбiльш цiнних сiльскогосподарських рослин України, полiпшенню якої надається велика увага. Селекцiя на високий гетерозис, а також необхiднiсть використання дикорослих видiв для полiпшення генофонду культурного соняшника, потребує застосування эфективних методiв оцiнки генетичного потенцiалу цiєї культури.

Вирiшення селекцiйних задач, класифiкацiя та еволюцiйнi дослiдження базуються на вивченнi генетичного полiморфiзму. Використання ДНК-маркерiв пiднесло на новий рiвень методи оцiнки генетичної варi-абельностi i знаходить пряме застосування в селекцiйнiй практицi. Успiхи, досягнутi за останнi 3-5 рокiв в галузi аналiзу генома соняшника на молекулярному рiвнi, суттєво доповнюють результати традицiйного генетичного аналiзу, отриманi за усю попередню iсторiю вивчення культури.

Найбiльшого розповсюдження у генетико-селекцiйних програмах за останнi роки набув аналiз полiморфiзму довжини амплiфiкованих в результатi полiмеразної ланцюгової реакцiї (ПЛР) фрагментiв ДНК. Дослiдження полiморфiзму довiльно амплiфiкованої ДНК (RAPD) дозволяє отримати характеристику генетичного рiзноманiття як основи для фiлогенетичних побудов, вiдбиття зв'язкiв спорiдненостi серед генотипiв селекцiйного матерiалу, пошуку зв'язку мiж молекулярними маркерами та конкретними ознаками, що цiкавлять селекцiонера. Мета i завдання роботи. . Метою дисертацiйної роботи є аналiз полiморфiзму довiльно амплiфiкованої ДНК соняшника на мiж- i внутрiшньовидовому рiвнях для уточнення фiлогенетичних взаємовiдносин в родi Helianthus, класифiкацiї селекцiйних лiнiй згiдно ступеня генетичної спорiдненостi, а також з'ясування можливого зв'язку мiж молекулярно-генетичним рiзноманiттям та агрономiчними показниками гiбридiв.

Безпосереднiми завданнями роботи були:

- дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму серед 35представникiв роду Helianthus та отримання дендрограми, що вi-дображає фiлогенетичнi взаємовiдносини мiж ними;

- провести RAPD-аналiз та розподiл 30 iнбредних лiнiй со-няшника згiдно ступеню генетичної спорiдненостi;

- вивчити характер успадкування RAPD-фрагментiв;

- проаналiзувати зв'язок мiж молекулярно-генетичними маркерами та агрономiчними показниками 36 гiбридiв F1 вiд схрещування iнбредiв рiзного ступеня генетичної близькостi.

Наукова новизна i практичне значення роботи. . Наукова новизна дисертацiї полягає у уточненнi генетичної спорiдненостi низки диких та культурних форм соняшника. Уточнено фiлогенетичну схему роду Helianthus. Визначено таксономiчне положення деяких видiв Helianthus, не наданих у морфологiчнiй класифiкацiї. Показана генетична близькiсть H.rigidus до видiв серiї Corona-Solis.

_Практичне значення отриманих результатiв. . Розробленi умови дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму соняшника за допомогою ПЛР. Установлено зв'язок мiж молекулярно-генетичними маркерами та показниками гiбридiв за врожаєм насiння, олiйнiстю, врожаєм олiї, а також гетерозисом за даними показниками. Здiйснена класифiкацiя iнбредних лiнiй, що чiтко диференцює їх на пули батькiвських та материнських форм та вiдбиває iнформацiю про родовiд, дозволить спростити селекцiонерам роботу з лiнiями, педiгрi яких не зрозумiлi або загубленi, при доборi батькiвських комбiнацiй. Показана можливiсть вiдбракування низьковрожайних та низькогетерозисних гiбридiв за даними аналiзу полiморфiзма ДНК серед батькiвських форм.

_Особистий внесок здобувача . полягає в дослiдженнi полiморфiзму амплiфiкованої ДНК дикорослих видiв та культурних форм соняшника, в проведеннi аналiзу придатностi RAPD-технологiї для диференцiацiї вивчаємих генотипiв, для вiдображення взаємовiдносин спорiдненостi на мiж- та внутрiшньовидовому рiвнях, в з'ясуваннi характеру успадкування RAPD-фрагментiв у соняшника, в оцiнцi характеру взаємозв'язку мiж ДНК-рiзноманiттям та селекцiйними показниками.

_Апробацiя роботи. . Основнi результати роботи були повiдомленi на мiжнароднiй конференцiї "Молекулярно-генетические маркеры растений" (Ялта, 1996), на науково-методичному семiнарi по використанню ПЛР-аналiзу в генетико-селекцiйних дослiдженнях (Одеса, 1997), на мiжнароднiй конференцiї "Молекулярная генетика и биотехнология" (Мiнськ, 1998).

_Публiкацiї. . Основнi положення дисертацiї вiдображенi в 8 друкованих працях.

_Структура i обсяг роботи. . Дисертацiя складається iз вступу, огляду лiтератури, експериментальної частини, результатiв та їх обговорення та висновкiв.

Робота викладена на 112 сторiнках машинописного тексту, вмiщує 20 малюнкiв i 12 таблиць. Список використаної лiтератури становить 142 джерела.

_На захист виносяться :

1. Результати дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму серед видiв роду Helianthus.

2. Розподiл селекцiйного матерiалу згiдно ступеню генетичної близькостi за даними аналiзу довiльно амплiфiкованої ДНК.

3. Данi аналiзу зв'язку мiж молекулярно-генетичними маркерами та агрономiчними показниками гiбридiв F1.

МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ

Для дослiдження взято 35 видiв роду Helianthus L.: H.debilis ssp tardiflorus, H.debilis ssp silvestris, H.petiolaris, H.petiolaris ssp petiolaris, H.argophyllus, H.praecox, H.praecox ssp praecox, H.praecox ssp hithus, H.praecox ssp rungoni, H.mollis, H.maximiliani, H.divaricatus, H.giganteus, H.grosseceratus, H.nuttallii, H.salicifolius, H.scaberimus, H.trachelifolius, H.microcefalus, H.laevigatus, H.hirsutus, H.decapetalus, H.macrophylus, H.californicus, H.tuberosus, H.eggertii, H.rigidus, H.multiflorus, H.bolanderi, H.resinosus, H.laetiflorus, H.pauciflorus ssp rigidus, H.pauciflorus ssp subrhomboides, представники двох близьких до Helianthus L. родiв - Simsia foetida, Titonia speciosa, а також 30 iнбредних лiнiй соняшника селекцiї СГI.

ДНК видiляли з етиольованих проросткiв та молодих корiнцiв, якi розтирали скляним товкачиком у еппендорфi з 0,5 лiзуючого розчину (1,4M NaCl, 20 mM EDTA-Na, 100 mM трисHCl pH 8,5, 2% CTAB). Тримали на протязi 60 хвилин за температурою 60 С. Депротеiнiзували в хлороформ-iзоамiловому спиртi (24:1). ДНК осаджували з водносольової фази 0,5 об'ємом iзопропанолу та центрифугували при 14000 об/хв на центрифузi Eppendorf. Промиту 70% етанолом ДНК розчиняли у 500 мкл ТЕ.

Амплiфiкацiю ДНК з довiльними праймерами проводили на приладi "Биотерм модель 91". Реакцiйна сумiш об'ємом 20 мкл для ПЛР вмiщувала 50 mM KCl, 20 mM трисHCl pH 8,4 (25 C), 2 mM MgCl , 0,01% Tween-20, по 0,2 mM кожного dNTP, 0,2 мкМ праймера та 1 одиницю Tag-полiмерази. У пробiрки поверх реакцiйного розчину наносили 50 мкл мiнеральної олiї. Амплiфiкацiю проводили в режимi : перший цикл - 3 хвилини 94 С, чотири цикли - 94 С 1 хв., 39 C 2 хв., 72 C 2 хв., 33 цикли - 94 С 1 хв., 47 С 1,6 хв., 72 C 2 хв., остання елонгацiя тривала 8 хв.

Продукти амплiфiкацiї фракцiонували електрофорезом в 2% агарозному гелi з 1хТВЕ.

Комп'ютерний аналiз RAPD-даних проводили за допомогою прог-рами TREE [Календар, 1994].

Оцiнку 36 гiбридiв F1 та їх батькiвських лiнiй за показниками врожаю насiння, олiї та олiйностi проводили згiдно типових методик.

Кореляцiйний та дiсперсiйний аналiзи здiйснили на обчислю-вальному центрi СГI.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕННЯ

1. RAPD-аналiз соняшника на мiж- та внутрiшньовидовому рiвнях.

При дослiдженнi представникiв дикорослих Helianthus не було виявлено праймерiв, що не познаходжували б внутришньовидового полiморфiзму. Рiзниця у спектрах амплiфiкацiї становила вiд 25 до 65%. За цими даними для вивчення мiжвидового рiзноманiття у Helianthus використали 5 праймерiв, виявляючих 25 - 37% полiморфiзму внутри виду.

Для добору праймерiв, що дозволяють вивчати полiморфiзм iнбредних лiнiй соняшника, проводили ПЛР з ДНК 8-10 iндивiдуальних рослин кожної лiнiї. 11 мономорфних для кожної лiнiї праймерiв в подальшому виявили 50 - 74% мiжлiнейний полiморфiзм.

Продукти ПЛР уявляли собою фрагменти амплiфiкацiї розмiром 400-1400 пн. Кiлькiсть рiзноманiтних за молекулярною масою смуг залежно вiд праймера складала вiд 12 до 20 (для видiв) та вiд 12 до 21 (для лiнiй). Взагалi знайдено 82 RAPD-локуса у дикунiв (усi полiморфнi) та 194 (серед них 124 полiморфних) - у культурного соняшника. Рiвень полiморфiзму вiдповiдно склав 100 та 64%.

За даними Gentzbittel et al. (1992), якi вивчали RFLP у родi Helianthus L., ступiнь мiжвидової рiзницi досягала 0,73.

Серед рiзних наборiв лiнiй соняшника за допомогою RFLP Gentzbittel et al.(1994) та Zhang et al.(1995) виявляли 35 i 60% полiморфiзму вiдповiдно. Таким чином, треба вiдзначити значно бiльший потенцiал RAPD-аналiзу для отримання можливих маркерiв.

Виявленi в результатi аналiзу полiморфiзма довiльно амплiфiкованої ДНК RAPD-локуси розподiлили за частотою появи у дослiджуваних генотипiв на групи. У вивчених видiв Helianthus найбiльша кiлькiсть RAPD-локусiв з'являється з частотою 0,4 та 0,5 (по 21% вiд загального числа), тодi як для самозапилених лiнiй бiльш характернi неполiморфнi RAPD-локуси (35%).

Вiдзначена наявнiсть видоспецифiчних (P28, P55) праймерiв та праймерiв, бiльш вiдповiдних для диференцiацiї iнбредних лiнiй (P37).

Порiвняння амплiфiкацiйних спектрiв представникiв рiзних геномiв дозволяє отримати кiлькiсну оцiнку їх дiвергенцiї. За даними RAPD-аналiзу, порiвнюючi ПЛР-профiлi рiзних видiв та лiнiй, визначили генетичнi дистанцiї (D) мiж ними. Значення мiжлiнейних D, у середньому, на порядок нижче, нiж мiжвидових. Розмах генетичних дистанцiй для видiв склав вiд D=0,158 (мiж H.praecox rungoni та H.praecox hithus) до D=0,773 (мiж H.praecox praecox та H.rigidus); для iнбредних лiнiй : вiд D=0,0152 (мiж лiнiями 6237 та 6085) до D=0,0426 (мiж лiнiями 2281 та 16В).

2. Аналiз успадкування RAPD-маркерiв у F1 гiбридiв соняшника.

Для визначення можливостi використання аналiзу полiморфiзма довжини амплiфiкованих фрагментiв ДНК для iдентифiкацiї iнбредних батькiв простих гiбридiв соняшнику проводили тестування F1 гiбридiв та оцiнювали, наскiльки успадкування амплiконiв вiдповiдає простому менделiвському. Використано три батькiвськi лiнiї (1036, 3369, 1750) та два гiбрида вiд схрещувань 1036х3369 та 1750х3369. Взагалi дослiджено 185 RAPD-локусiв.

У бiльшостi випадкiв ДНК-профiль гiбрида вмiщував суму фрагментiв, що характернi для обох батькiв. 94,4% RAPD-маркерiв успадковувались за домiнант-рецесивним типом. У 3% вiдзначена вiдсутнiсть батькiвського фрагменту у гiбрида, а у 2,6% - поява нехарактерного для спектру батькiв фрагмента амплiфiкацiї.

Ряд авторiв [Davis,1995; Heun,1993; Halden,1995] для з'ясування варiантiв успадкування ПЛР-фрагментiв пропонують проводити змiшування батькiвських ДНК-матриць. При порiвняннi амплiфiкацiйних профiлiв ДНК iнбредних лiнiй, ДНК вiдповiдного їм гiбрида та сумiшi 1:1 ДНК батькiв даного гiбрида поява нових смуг у спектрi гiбрида не спостерiгалась. У гiбрида 1036х3369 був вiдсутнiм амплiфiкований фрагмент, характерний для лiнiї 3369 та сумiшi ДНК батькiвських форм.

Зроблено висновок, що успадкування продуктiв амплiфiкацiї з довiльними праймерами у бiльшостi випадкiв вiдбувається згiдно менделевським правилам за домiнант-рецесивним типом. Наявнiсть вiдхилень вiд такого успадкування не дає змоги вважати використання аналiзу полiморфiзма довiльно амплiфiкованої ДНК для iдентифiкацiї iнбредних батькiв простих гiбридiв соняшника оптимальним.

3. Фiлогенетичнi взаємовiдносини мiж дослiджуваними видами Helianthus L.

На базi RAPD-аналiзу та оцiнки генетичних дистанцiй мiж дослiджуваними видами отримана кладограма, що вiдбиває генетичну спорiдненiсть 35 дикорослих видiв Helianthus, Simsia foetida, Titonia speciosa, а також культурних представникiв H.annuus (мал.1).

На побудованiй схемi видiляються декiлька кластерiв. При порiвняннi з класифiкацiєю роду за морфологiчними ознаками [Schilling, Heiser,1981], можна визначити, загальну тенденцiю сумiсного угрупування представникiв певних таксономiчних одиниць. Визначенi окремi кластери з видами серiї Corona-Solis ( ) та Helianthus ( ). Представники H.annuus - селекцiйнi лiнiї 2В, OD20, 1036, 3369 - зiбранi в групу, що є часткою великого субкластеру, до якого уходять усi види секцiї Helianthus.

Генетична дистанцiя мiж пiдвидами H.praecox rungonii та H.praecox hithus (D=0,074) не перевищує такову мiж лiнiями культурного соняшнику.

За даними Schilling, Heiser (1981) група видiв серiї Microcephali найбiльш близька до представникiв серiї Corona-Solis. За нашим дослiдженням H.laevigatus та H.microcephalus також показують генетичну близькiсть до таких видiв Corona-Solis як H.californicus, H.giganteus.

H.rigidus класифiкується морфологами як представник секцiї Divaricati серiї Atrorubentes. У Gentzbittel et al.(1992) за ПДРФ-даними цей вид входить до однiєї групи з видами Corona-Solis. За результатами ПЛР-аналiзу показана близькiсть H.rigidus до серiї Corona-Solis, а саме до H.decapetalus, H.strumosus, H.hirsutus.

Найменьшi генетичнi дистанцiї мiж H.annuus та H.laetiflorus, H.salicifolius, H.bolanderi, H.petiolaris, H.tuberosus дозволяють визнавати їх найбiльш iмовiрними донорами корисних агрономiчних ознак при полiпшеннi культурного соняшника. Бiльше за

+------------------------------------------ H.eggerti

+-----¦

¦ +---------------------------------------- H.maximiliani

+--¦

¦ ¦ +----------------------------- H.hirsutus

¦ ¦ +----------¦

¦ ¦ ¦ +----------------------------- H.trachelifolius

¦ +-----¦

¦ ¦ +---------------------------------- H.strumosus

¦ +-----¦

¦ +---------------------------------- H.macrophilus

+------------------¦

¦ ¦ +------------------ H.scaberimus

¦ ¦------------------------------¦

¦ ¦¦ +------------------ H.decapetalus

¦ +¦

¦ +------------------------------------------------ H.rigidus

¦

¦ +------------------------------------- H.tuberosus

¦ +-----¦

¦ ¦ +------------------------------------- H.grosseseratus

¦ +---¦

¦ ¦ ¦ +----------------------------- H.giganteus

¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦+----------------------------- H.nuttalli

¦ ¦ ¦ +--------+¦

¦ ¦ ¦ ¦ +----------------------------- H.laevigatus

¦ ¦ +---¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------- H.californicus

¦ ¦ +-------¦

¦ ¦ +------------------------------- H.multiflorus

¦ +-------¦

¦ ¦ +----------------------------------------------- Sinsia

¦ +---¦

¦ ¦ ¦ +--------------------------------------------------- H.microcephalus

¦ ¦ +---¦

¦ ¦ +--------------------------------------------------- Titonia

¦ +-¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------------ H.mollis

¦ ¦ +----------------------¦

¦ +------------------------------------ H.divaricatus

¦ +-¦

¦ ¦ ¦ +------------------------ H.pauciflorus subrhomb.

¦ ¦ ¦ +-----¦

¦ ¦ ¦ ¦ +------------------------ H.pauciflorus rigidus

¦ ¦ ¦ +------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +------------------------------ H.laetiflorus

¦ ¦ ¦ +------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +------------------------------------- H.resinosus

¦ ¦ ¦ +--¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-------------------------------------- H.debilis silvestris

¦ ¦ ¦ ¦ +-----¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +----------------------------- H.petiolaris petiolaris

¦ ¦ ¦ ¦ +--------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +----------------------------- H.petiolaris

¦ ¦ ¦ +---¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------------------------------------- H.salicifolius

¦ ¦ ¦ ¦ +-------¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +----------------------------- H.annuus (????? 2B)

¦ ¦ ¦ ¦ +---------¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------------------------ H.annuus (????? DO80)

¦ ¦ ¦ ¦ +----¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------------- H.annuus (????? 1036)

¦ ¦ ¦ ¦ +----------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +------------- H.annuus (????? 3369)

¦ ¦ ¦ +---¦

¦ ¦ ¦ ¦ +--------------------------------------------------- H.bolanderi

¦ ¦ +-----¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------------------- H.debilis tardiflorus

¦ ¦ +-----------¦

¦ ¦ +------------------------------------------- H.argophyllus

+----¦

¦ +------------------------------------- H.praecox

¦ +----------------¦

¦ ¦ ¦ +-------- H.praecox rungoni

¦ ¦ +----------------------------¦

¦ ¦ +-------- H.praecox hitus

+--------¦

+------------------------------------------------------ H.praecox praecox

________¦_________¦_________¦_________¦_________¦_________¦_________¦

0.487 0.406 0.325 0.244 0.162 0.081 0.000

D

Мал.1. Дендрограма фiлогенетичних взаємовiдносин мiж деяки-

ми представниками Helianthus.

iнших генетично вiддаленi вiд H.annuus такi види як H.multiflorus, H.rigidus, Simsia foetida, схрещування з якими H.annuus повинно iндукувати чоловiчу цитоплазматичну стерильнiсть.

Ряд узятих до дослiдження видiв (H.macrophillus, H.laetiflorus, H.pauciflorus, H.scaberimus, H.multiflorus, H.trachelifolius) не наведений у морфологiчнiй класифiкацiї. Це пов'язано з тим, що кiлькiсть видiв, вiдносимих до роду Helianthus, зазнавала значних змiн, бiльшiсть видiв є видами-синонiмами. У зв'язку з цим вважалось доцiльним з'ясувати генетичнi взаємовiдносини таких видiв, що є у колекцiях та залучаються селекцiонерами до вiддаленої гiбридiзацiї з культурним соняшником, з iншими представниками Helianthus.

В результатi нашої роботи можна вiдзначити, що H.macrophillus, H.scaberimus, H.multiflorus та H.trachelifolius виявляють максимальну генетичну близькiсть до H.decapetalus, H.hirsutus, H.strumosus, H.californicus, що дозволяє вiднести їх до серiї Corona-Solis. Види H.laetiflorus та H.pauciflorus, у зв'язку з їх мiнiмальним вiддаленням вiд H.rigidus, можуть розглядатися як представники серiї Atrorubentes.

4. Класифiкацiя селекцiйного матерiалу згiдно ступеня генетичної спорiдненностi.

Для з'ясування характера генетичних взаємовiдносин у вивчаємому селекцiйному матерiалi за допомогою кластерного аналiзу генетичних дистанцiй отримана дендрограма, що вiдбиває спорiдненiсть iнбредних лiнiй соняшника (мал.2).

На отриманiй схемi лiнiї утворили два основних кластера. Один з них залучає лiнiї-вiдновники фертильностi, що використуються як батькiвськi форми гiбридiв. До другого кластеру увiйшли материнськi лiнiї. Виключенням є лiнiї 67 та 13В.

Схеми, що вiдображають взаємозв'язки в даному селекцiйному матерiалi, були побудованi в результатi обрахування рiзних довiльно узятих наборiв ПЛР-даних : по 5, 8, 10, 11 праймерам, що вiдповiдає 60, 96, 117 та 125 полiморфним RAPD-локусам. Два основних кластера, що диференцюють материнськi та батькiвськi форми, можна видiлити вже при аналiзi даних по 60 варiабельним локусам (48,2% iнформативних полiморфних фрагментiв амплiфiкацiї). Це говорить о високiй дискримiнацiйнiй здiбностi метода класифiкацiї лiнiй на базi аналiзу полiморфiзма ДНК.

Одним з показникiв об'єктивностi отриманих дендрограм є їх вiдповiднiсть що до iнформацiї о родоводi. Дендрограма, вiдбива-

+--------------------------------------- 2B

+---¦

¦ +--------------------------------------- 67

+-¦

¦ ¦ +--------------------------------- 15B

¦ ¦ +-¦

¦ ¦ ¦ +--------------------------------- OD18

¦ +-------¦

¦ +----------------------------------- OD19

+--¦

¦ ¦ +------------------------------- 7B

¦ ¦ +----------¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------- 11B

¦ +--¦

¦ ¦ +-------------------------------- 12B

¦ +---------¦

¦ +-------------------------------- 14B

+-¦

¦ ¦ +------------------------------------- 4B

¦ +----------¦

¦ +------------------------------------- 5B

+---------¦

¦ +-------------------------------------------------- 16B

+--¦

¦ +------------------------------------------------------------ OD20

¦

¦ +------------------------------------------------ 13B

¦ ¦

¦ +------------------------------------------------ 2071

¦ +------¦

¦ ¦ ¦ +--------------------------------------- 42

¦ ¦ ¦ +-¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-------------------------------- 6253

¦ ¦ ¦ ¦ +------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +-------------------------------- 2593

¦ ¦ ¦ +¦

¦ ¦ ¦ ¦¦ +---------------------------------- 1036

¦ ¦ ¦ ¦+------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +---------------------------------- 2925

¦ ¦ ¦ +--¦

¦ ¦ ¦ ¦ +------------------------------------------ 1122

¦ ¦ +--¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------------------ 2085

¦ ¦ +--¦

¦ ¦ ¦ +-------------------------------- 2281

¦ ¦ ¦ +-------¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +----------------------------- 3369

¦ ¦ ¦ ¦ +--¦

¦ ¦ ¦ ¦ +----------------------------- 6121

¦ ¦ +-¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------------- 3497

¦ ¦ +--¦

¦ ¦ ¦ +------------------------ 6237

¦ ¦ +------------¦

¦ ¦ +------------------------ 6085

¦ +¦

¦ ¦+------------------------------------------------------- 6071

+------¦

+-------------------------------------------------------- 1750

¦________¦________¦________¦________¦________¦________¦________¦

0.038 0.032 0.027 0.022 0.016 0.011 0.005 0.000 D

Мал.2. Генетичнi взаємовiдносини мiж вивчаємими iнбредними

лiнiями соняшника, визначенi за допомогою RAPD-аналiзу.

юча спорiдненiсть мiж материнськими формами (мал.3), в цiлому згiдна з їх педiгрi. Група лiнiй (2281, 6121, 6237, 6085), створена на базi лiнiї 3369, складає один субкластер. Лiнiя 1036, що є основою лiнiй 6253 та 2593, також поєднана з ними до однiєї пiдгрупи. Лiнiї 2071 та 6071, видiленi в рiзнi роки з гiбриду 1036х3369, значно вiддаленi одна вiд одної, та не входять нi до одного з субкластерiв.

Використання ПЛР з довiльними праймерами дозволило у данiй роботi проаналiзувати достатньо велику кiлькiсть селекцiйного матерiалу та виявити високий полiморфiзм серед iнбредних лiнiй соняшника на рiвнi ДНК; чiтко розподiлити їх на пули батькiвських та материнських форм; вiрогiдно вiдбити iнформацiю о родоводi iнбредiв. Знання генетичної спорiдненостi лiнiй уявляється корисним для генетико-селекцiйних дослiджень.

5. Аналiз зв'язку мiж молекулярно-генетичними маркерами та показниками гiбридiв.

Генетичнi дистанцiї мiж лiнiями, визначенi на основi обчислення 194 RAPD-локусiв, розглядали як мiру генетичного рiзноманiття серед вихiдних батькiвських генотипiв. Згiдно даних рiзних дослiдникiв, кореляцiї мiж такими параметрами як генетичнi дистанцiї та врожайнiсть значно вар'юють. Lee et al.(1989) знайшов кореляцiю r=0,74 мiж показниками специфiчної комбiнацiйної здiбностi та генетичними дистанцiями за ПДРФ-даними у кукурудзи. В роботi Melchinger et al.(1990) аналогiчний показник був значно меншим : r=0,39.

У 1996р. на полях СГI (с.Дачне, Одеська обл.) було проведено схрещування пiд iзоляторами за системою топ-кроса та отримане насiння 36 гiбридiв з рiзним рiвнем генетичних дистанцiй мiж батькiвськими лiнiями, залучаючи близько-, средньоспорiдненi та найбiльш вiддаленi. Середня врожайнiсть батькiвських лiнiй по насiнню - 10ц/га, по олiї - 4,2ц/га, олiйнiсть - 46,4%, що складає по вiдношенню до нацiонального стандарту України (стандарт 249) вiдповiдно 47,6%, 45,2% та 92,2%. Мiнiмальнi середнi показники за усiма розглядаємими ознаками (врожайнiсть насiння, врожайнiсть олiї, олiйнiсть, гетерозис за врожайнiстю насiння та олiї, гетерозис за олiйнiстю) спостерiгали у гiбридiв I групи (генетичнi дистанцiї мiж батькiвськими лiнiями 0,0152<D<0,0250), максимальнi - у гiбридiв II групи (0,0250<D<0,0350), з подальшим збiльшенням генетичних дистанцiй (III група гiбридiв,

+-------------------------------------------------- 42

+--¦

¦ ¦ +----------------------------------------- 6253

¦ +--------¦

¦ +----------------------------------------- 2593

¦

¦ +-------------------------------------------- 1036

+--------¦

¦ +-------------------------------------------- 2925

+----¦

¦ +----------------------------------------------------- 1122

+----¦

¦ ¦ +----------------------------------------------------- 2085

¦ +----¦

¦ ¦ +----------------------------------------- 2281

¦ ¦ +---------¦

¦ ¦ ¦ ¦ +------------------------------------- 3369

¦ ¦ ¦ +---¦

¦ ¦ ¦ +------------------------------------- 6121

¦ +-¦

¦ ¦ +----------------------------------------------- 3497

¦ +---¦

¦ ¦ +-------------------------------- 6237

¦ +--------------¦

¦ +-------------------------------- 6085

+---¦

¦ ¦+-------------------------------------------------------------- 67

¦ +¦

¦ +-------------------------------------------------------------- 2071

+--¦

¦ +------------------------------------------------------------------- 6071

¦

+---------------------------------------------------------------------- 1750

¦_________¦_________¦_________¦_________¦_________¦_________¦_________¦

0.033 0.028 0.023 0.019 0.014 0.009 0.005 0.000

D

Мал.3. Схема генетичної спорiдненостi материнських лi-

нiй соняшника.

0,0350<D<0,0450) показникi декiлька зменьшуються. Мiнiмальнi значення за усiма тестуємими ознаками виявлено у гiбрида 6237х6085, мiж батьками якого знайдена найменьша генетична дистанцiя (0,0152). Гетерозис, що перевищує 100%, визначено тiльки в одному випадку для гiбрида з I групи. Гiбрид 3497х6121 показав 130% гетерозис по врожаю олiї. Гiбриди I групи не досягають показникiв нацiонального стандарту. У 57% гiбридiв II групи врожайнiсть насiння була бiльше нiж у стандарту на 2 - 35,7%. З III групи також 57% гiбридiв перевищили врожайнiсть насiння стандарту на 2 - 30%. Половина гiбридiв II групи та 71% гiбридiв III групи вiдрiзняються збiльшеними значеннями врожаю олiї у порiвняннi з стандартом. Збiльшення складає 35,7 - 126,2% по II групi та 7,1 - 95,2% по III групi.

Отриманi данi дозволяють погодитися з думкою Frei et al.(1986), що молекулярно-генетичнi дистанцiї можуть мати велике значення саме для вибраковки близькоспорiднених схрещувань.

Дана теза пiдтверджується кореляцiйним аналiзом, результати якого наданi у табл.1. Значення коефiцiєнтiв кореляцiї для даного набору iнбредiв у 1,8 - 2,5 рази перевищують вiдповiднi показники, отриманi для гiбридiв, серед яких не було представникiв I групи.

Табл.1

Коефiцiєнти кореляцiї

--------------------------------------------------------------------

x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7

--------------------------------------------------------------------

1 1.00 0.37# 0.36# 0.08 0.08 0.45# 0.40#

--------------------------------------------------------------------

# - достоверно (Р=0.01) R#=0.438

1- генетичнi дистанцiї

2- врожайнiсть насiння

3- гетерозис за врожайнiстю насiння

4- олiйнiсть

5- гетерозис за олiйнiстю

6- врожайнiсть олiї

7- гетерозис за врожайнiстю олiї

Щонайменшi значення отриманi для коефiцiєнтiв кореляцiї мiж генетичними дистанцiями та найменш вар'юючими ознаками : олiйнiстю та гетерозисом за олiйнiстю. Значення r вiдрiзняються залежно вiд розглядаємого агрономiчного показника, но, в цiлому, вiдповiдають результатам iнших дослiдникiв. Кореляцiї мiж генетичним рiзноманiттям за молекулярними (ДНК) маркерами та показниками гiбридiв рису були 0,338 i 0,165 [Zhang et al.,1996], у пшеницi - 0,49 i 0,47 [Perenzin et al.,1996], у кукурудзи - <0,5 [Melchinger et al.,1990], а також 0,54 i 0,53 [Вербицька, у друку].

В нашiй роботi максимальне значення r=0,45 виявлено для D та показникiв врожайнiстi олiї.

Розвиток молекулярного маркування локусiв кiлькiсних ознак, у тому ж числi i локусiв елементiв, формуючих врожай, повинен збiльшити значущiсть та прогнозуючу здiбнiсть маркерiв на основi ДНК.

ВИСНОВКИ

Дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму соняшника на мiж- та внутришньовидовому рiвнях за допомогою аналiзу продуктiв полiмеразної ланцюгової реакцiї з довiльними праймерами дало можливiсть зробити наступнi висновки :

1. Розробленi умови i пiдiбранi праймери, що дозволяють диференцiювати генотипи соняшника i видiв роду Helianthus.

2. Вид H.rigidus (секцiя Divaricati), класифiкований морфологами як представник серiї Atrorubentes, за даними аналiзу полiморфiзма ДНК виявляє найбiльшу генетичну спорiдненiсть з видами серiї Corona-Solis.

3. В результатi RAPD-аналiзу визначенi генетичнi дистанцiї мiж культурним соняшником та його дикорослими спорiдненими видами. Максимальну близькiсть до культивованого H.annuus на рiвнi ДНК показали H.laetiflorus, H.salicifolius, H.bolanderi, H.petiolaris, H.tuberosus.

4. Дослiдження мiжлiнейного полiморфiзму дозволяє диференцувати на рiвнi ДНК материнськi та батькiвськi форми, що використовуються для створення гiбридiв.

5. Визначений домiнант-рецесивний характер успадкування амплiфiкованих фрагментiв ДНК у соняшника.

6. Зв'язок мiж генетичними дистанцiями, грунтованими на полiморфiзмi ДНК, та деякими показниками гiбридiв соняшнику значно вар'юють в залежностi вiд розглядаємого селекцiйного показника.

7. ДНК-полiморфiзм може служити надiйним критерiєм для вибраковки близькоспорiднених схрещувань при створеннi високопродуктивних гiбридiв.

Список робiт, опублiкованих по темi дисертацiї:

1. Sivolap Yu.M., Solodenko A.E., Burlov V.V. Inter- and intraspecific polymorphism of sunflower revealed by RAPD-analysis // Eucarpia: Proceedings of the Symposium, Zaporozhye, 1996.-P.262-266.

2. Ю.М.Сиволап, А.Е.Солоденко, В.В. Бурлов. RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus) // Генетика.-1998.-34.-N2.-С.266-271.

3. Кожухова Н.Э., Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Наследование продуктов амплификации ДНК у F1 гибридов кукурузы и подсолнечника // Цитология и генетика.-1998.-N4.-С.26-31.

4. Солоденко А.Е. Молекулярно-генетический полиморфизм на межвидовом уровне // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях. Научно-методическое руководство. Под ред. Сиволапа Ю.М.-Киев: Аграрна Наука, 1998.- 156с.

5. Солоденко А.Е. Внутривидовой полиморфизм подсолнечника // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях. Научно-методическое руководство. Под ред. Сиволапа Ю.М. -Киев: Аграрна Наука, 1998.-156с.

6. Продан А.Е., Сиволап Ю.М., Бурлов В.В. Дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму соняшника та класифiкацiя селекцiйного матерiалу за допомогою RAPD-аналiзу // Наслiдки наукових пошукiв молодих вчених-аграрникiв в умовах реформування АПК: Тези доповiдей мiжнар. науково-практ. конф. мол. вчених та спец., Чабани, 1996.-С.221.

7. Солоденко А.Е., Cиволап Ю.М., Бурлов В.В. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника на меж- и внутривидовом уровнях // Молекулярно-генетические маркеры растений: Тез. докл. Межд. конф. 11-17 ноября 1996.-Ялта.-С.82-83.

8. А.Е.Солоденко, Ю.М.Сиволап. Использование ПЦР для дифференциации генотипов подсолнечника // Молек. генетика и биотехнол.: Тез. докл. Межд. конф. 6-8 апреля 1998.-Минск.-С.97-99.

Солоденко А.Є. Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму соняшника за допомогою аналізу довільно амфлікованої ДНК.-Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біолігічних наук за спеціальністю 03.00.26 - молекулярна генетика.- Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 1999

До захисту надається дисертацiя, яка вмiщує теоретичний та експериментальний матерiал по використанню аналiзу довiльно амплi-фiкованої ДНК для вивчення молекулярно-генетичного полiморфiзму соняшника на мiж- та внутрiшньовидовому рiвнях. Уточненi фiлогенетичнi взаємовiдносини мiж 35 представниками роду Helianthus. Виявленi види, найбiльш генетично близькi до культурного соняшника, як потенцiйнi донори цiнних господарських ознак. Проведено класифiкацiю селекцiйного матерiалу згiдно рiвня генетичних дистанцiй. Двi пари батькiвських лiнiй та їх гiбриди використанi для вивчення характеру успадкування амплiфiкованих фрагментiв ДНК. Проаналiзовано зв'язок мiж молекулярно-генетичним рiзноманiттям батькiвських лiнiй на рiвнi ДНК i такими показниками гiбридiв як: врожайнiсть насiння та олiї, олiйнiсть, а також гетерозисом за даними показниками.

Ключові слова: Молекулярно-генетичний полiморфiзм, мiж- та внутрiшньовидова варiабельнiсть, RAPD, соняшник

Солоденко А.Е. Исследование молекулярно-генетического полиморфмзма с помощью анализа произвольно амплифицированной ДНК.- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 -молекулярная генетика.- Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1999

Представляется к защите диссертация, которая содержит теоретический и экспериментальный материал по использованию анализа произвольно амплифицированной ДНК для исследования молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника на меж- и внутривидовом уровнях. Уровень полиморфизма определен по данным электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК. Детектировано 82 RAPD-локуса у дикорастущих видов Helianthus и 194 – у инбредных линий культурного подсолнечника. Уровни полиморфизма соответственно составили 100 и 64%. Отмечены видоспецифичные праймеры для Helianthus и праймеры, более информативные при исследовании полиморфизма на внутривидовом уровне. Уточнены филогенетические взаимоотношения между 35 представителями рода Helianthus, среди которых 6 видов, не представленных в морфологической таксономии. Кластеризация видов на основании RAPD-анализа, в основном, соответствует морфологической системе. Выявлены виды, наиболее генетически близкие к культурному подсолнечнику, как потенциальные доноры ценных хозяйственных признаков. Проведена классификация селекционного материала согласно уровню генетических дистанций. Получена четкая дифференциация инбредных линий на группы материнских и отцовских форм гибридов. Определен высокий потенциал RAPD-технологии для отражения информации о педигри. Две пары родительских линий и их гибриды использованы для изучения характера наследования амплифицированных фрагментов ДНК. 94,4% амплифицированных фрагментов наследовались по доминант-рецессивному типу. В 5,6% случаев отмечено неменделевское поведение ампликонов. Обсуждаются аспекты использования продуктов ПЦР с произвольными праймерами для идентификации родителей простых гибридов подсолнечника. Генетические дистанции, определенные на основании анализа полиморфизма ДНК, рассматривались как мера генетического разнообразия между исходными родительскими генотипами. Проанализирована связь между молекулярно-генетическим разнообразием родительских линий на уровне ДНК и такими показателями гибридов как: урожайность семян и масла, масличность, а также гетерозисом по данным показателям. Показана высокая разрешающая способность RAPD-анализа для выбраковки близкородственных скрещиваний.

Ключевые слова: Молекулярно-генетический полиморфизм, меж- и внутривидовая вариабельность, RAPD, подсолнечник

Solodenko A.E. Investigation of the molecular-genetic polymorphism of sunflower by analisis of random amplified DNA.- Manuscript.

Thesis for a degree of candidate of biological science by speciality 03.00.26 - molecular genetic.- The Institute of molecular biology and genetics, Kyiv, 1999

Dissertation contains theoretical and experimental material for using the analysis of random amplified DNA for investigation molecular-genetic polymorphism of sunflower on inter- and intraspecies level. It was detalization the phylogenetics relationships between 35 accessions of Helianthus genera.The closest to cultivated sunflower species was found. They are potential donors of valuable agronomic traits. The classification of the breeding material in accordance with genetic distances is received. The character of hereditance of random amplified fragments is studied. Relation between molecular-genetic variability of inbred lines and hybrids characteristics (seed and oil yield, oilness and heterosis) is analysed.

Key world: Molecular-genetic polymorphysm, inter- and intraspecies variability, RAPD, sunflower