ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ

АМН УКРАЇНИ

АНДРУСИШИНА ІРИНА МИКОЛАЇВНА

УДК 546.3+614.876+615.9+616-76:616.697

МОРФОЛОГІЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ЗМІНИ ЧОЛОВІЧИХ ГАМЕТ (СПЕРМАТОЗОЇДІВ) ПРИ ПОЄДНАНІЙ ДІЇ ІОНІЗУЮЧОГО

ОПРОМІНЕННЯ І ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

(експериментальне дослідження)

14.02.01 – Гігієна

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті медицини праці АМН України

Науковий керівник: - доктор медичних наук, професор, академік АМН України,

член-корр. НАН України

ТРАХТЕНБЕРГ Ісаак Михайлович,

керівник лабораторії промислової токсикології,

Інститут медицини праці АМН України

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук

ТОМАШЕВСЬКА Людмила Анатоліївна

головний науковий співробітник

лабораторії гігієни електромагнітних випромінень,

Інститут гігієни та медичної екології ім.О.М.Марзеева

АМН України

доктор медичних наук

ШЕПЕЛЬСЬКА Нінель Рішадівна

провідний науковий співробітник

лабораторії канцерогенезу, тератогенезу

та репродуктивної функції,

Інститут екогігієни та токсикології ім Л.І.Медведя

Провідна установа: - Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця.

Захист дисертації відбудеться “ 2 “ липня 2002 року о 14.00 год. на засіданні спеціалізованної вченої ради Д 26.554.01 в Інституті медицини праці АМН за адресою: 01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту медицини праці.

Автореферат розісланий 29.05.2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

к.м.н.,ст.науковий співробітник Г.І.Ковальова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Серед найважливіших проблем в галузі медико-біологічних досліджень особливо гостро стоїть проблема сумісної дії факторів радіаційної і хімічної природи, оскільки в реальному житті навряд чи можливо розраховувати на ізольовану дію лише одного джерела шкідливості. Наприклад, в металургійній промисловості, на підприємствах радіоелектроніки і напівпровідників, гірськодобувній промисловості можлива поєднана дія на працюючих радіаційного і хімічного чинників. Для України особливе значення мають наслідки Чернобильської катастрофи, коли значна кількість населення зазнала поєднаної дії радіації, та важких металів, особливо свинцю. Серед хімічних речовин, що забруднюють навколишнє середовище, важкі метали і їх сполуки утворюють значну группу токсикантів, які віднесені до пріоритетних забруднювачів виробничого та оточуючого середовища. Тому першочергове значення досліджень в цьому напрямку неодноразово відмічалось у роботах Трахтенберга І.М. та інш., 1994, Гончарука Є.Г. та інш., 1996, Кундієва Ю.І. 1998, Штабського Б.М. та інш., 1999.

В той же час дані літератури про поєднану дію іонізуючого опромінення і важких металів стосуються лише окремих, викликаних ними біологічних ефектів і не розкривають суті патогенетичних механізмів їх впливу на організм (Тиунов Л.А и др., 1977, Гончарук Е.Г. и др., 1996). Відомо, що ізольована дія на репродуктивну функцію людини і тварин свинцю і, особливо, кадмію специфічна для гонад. Встановлено, що гонади людини і тварин є найбільш чутливими до дії радіації. Водночас причиною безпліддя у 30% випадків вважаеться погана екологія (Малишкин И.Н., 1997, Артюхин А.А., 1999). За даними експертів ВООЗ, в останні роки були знижені нормальні показники спермограми чоловіків. Однак дані про поєднану дію іонізуючого опромінення і важких металів на репродуктивну функцію чоловіків є взагалі поодинокими (Стусь В.П., 1997).

Значна кількість робіт стосовно репродуктивної системи людини присвячена дослідженню впливу іонізуючого опромінення в широкому спектрі доз на клітини сперматогенного ряду в експерименті (Померанцева М.Д. и др., 1990, Асташева Н.Л. и др., 1994, Pogany G.C.,1987) і в кліниці, зокрема у осіб, які брали участь в ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській АЕС (Стусь В.П., 1992, Кульбах О.С. и др., 1992, Bourioukov A.M., 1993, Конопля Е.Ф. и др., 1996, Горпинченко И.И., 1992, Люлько А.А. и др., 1995). Опубліковані роботи щодо вивчення впливу свинцю і кадмію на репродуктивну функцію експериментальних тварин (Авцын А.П., 1991, Kaushal D. еt al,1996, Стоянов М и др., 1997, Ohta H. et al., 1997) і людини (Михалева Л.М., 1988, Ashton J. et al., 1992, Alexsander B. et al., 1996, Mettita S.T., 1997,). Однак поєднана дія малих доз важких металів і іонізуючого опромінення вивчалась дуже мало (Іваницька М.Ф. 1991, 1993, 1995, Верповський А.Н., 1996, Гончарук Е.Г. и др., 1996). В той же час ряд питань цитопатології статевих гамет як одного із найважливіших показників стану репродуктивної функції залишився виясненим недостаньо. До них відносяться: стан мембранного апарату чоловічих гамет після ізольованої і поєднаної дії важких металів і опромінення, ультраструктура в цих умовах апарату руху сперміїв, взаємодія між ступенем пошкоджуючого впливу ізольованої і поєднаної дії опромінення і важких металів і морфофункціональним станом сперматозоїдів (рухливість, патологічні, атипічні форми). До числа недостатньо вивчених питань відноситься визначення співвідношень між вмістом важких металів в крові і спермі та супроводжуванні їх накопиченням і впливом радиації, біохімічні зміни обміну електролітів та енергетичного ( за вмістом АТФ, загальних ФЛ і фруктози).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом галузевих пріоритетних НДР МОЗ та АМН України “Биологические показатели экспозиции при воздействии тяжёлых металлов как загрязнителей производственной и окружающей среды: критерии, принципы обоснования и оценки” (№ держреєстрації 0193003636), “Установить особенности взаимодействия иммунологических, иммунных и биохимических механизмов гомеостаза с носительством тяжёлых металлов на примере свинца, кадмия и марганца” (№ держреєстрації 019U017100), “Обоснование применения метода лазерной корреляционной спектроскопии плазмы крови и определение его специфичности для скрининговых исследований риска развития свинцовой интоксикации” (№ держреєстрації 01944017100), “Корреляционные связи между данными биомониторинга и гигиенического мониторинга производственной (окружающей) среды на модели тяжёлых металлов и пестицидов” (№ держреєстрації 0196U009095), “Вплив важких металів (свинцю, марганцю, ртуті, заліза) як токсичних факторів зовнішнього середовища на вікові зміни адаптації та продовження життя (експериментальні та клініко-гігієнічні дослідження)” (№ держреєстрації 0100U002246).

Мета роботи. Метою данного експериментального дослідження є вивчення особливостей морфофункціонального і біохімічного стану чоловічих гамет щурів при ізольованій і поєднаній дії іонізуючого опромінення і важкіх металів. Досягнення поставленої мети базувалося на вирішенні наступних завдань:

1..Оцінити зміни деяких морфометричних показників стану організму піддослідних тварин у підгострому експерименті.

2. Вивчити динаміку накопичення свинцю і кадмію в індикаторних середовищах – крові, сім'яниках та сперматозоїдах щурів в умовах ізольованої і поєднаної дії g-опромінення і солей свинцю і кадмію.

3. Встановити особливості морфологічних і ультраструктурних змін сперматозоїдів експериментальних тварин в умовах експерименту і у відновлювальний період.

4. З'ясувати особливості обміну електролітів чоловічих гамет щурів-самців в умовах експерименту.

5. Визначити стан енергетичного обміну в сперматозоїдах, в умовах дії g-опромінення і важких металів.

6. Виявити кореляційні зв'язки між змінами морфологічних і біохімічних показників стану чоловічих гамет в умовах ізольованої і поєднаної дії факторів, що вивчались.

7. Порівняти різні математичні підходи щодо розрахунків Ксд за результатами показників, що вивчались в експерименті.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено морфофункціональний і біохімічний стан чоловічих гамет (сперматозоїдів щурів) в умовах поєднаної дії іонізуючого опромінення і сполук важких металів (свинцю і кадмію). На основі результатів комплексних електронномікроскопічних і біохімічних досліджень в поєднанні з традиційними методами (визначення загальної кількості, рухливості і кількості патологічних форм сперміїв) математично встановлено наявність кореляційних зв'язків між структурно-функціональними порушеннями і змінами деяких сторін енергетичного обміну в сперматозоїдах щурів, які зазнали впливу опромінення і дії важких металів. Встановлено, що провідну роль при ізольованій і поєднаній дії важких металів відіграють виснаження енергетичних субстратів і зміни обміну електролітів, тобто має місце порушення біокаталітичних процесів в статевих клітинах. При изольованій і поєднаній дії опромінення має місце порушення морфофункційних і ультраструктурних змін в цих клітинах. Виявлено зв'язок між порушенням енергетичного обміну і обміну електролітів з деструкцією плазмалеми і мітохондріальних мембран клітин. Визначено зв'язок між накопиченням важких металів в крові і сперматозоїдах. Показано, що кумуляція цих металів призводить до пригнічення кількісних і якісних характеристик спермограми щурів. Отримані дані дозволяють розширити і поглибити уявлення про механізми ізольованої і поєднаної дії опромінення і важких металів на репродуктивну функцію піддослідних тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Показано, що поряд з відомими показниками оцінки функціонального стану сперматозоїдів (цитологічними і хемілюмінесцентними) показники електролітного обміну і енергозабезпечення рухливості сперматозоїдів доцільно використовувати в арсеналі методів експериментальних і клінічних лабораторій, які вивчають репродуктивну функцію тварин і людини.

У 2001 р. видано інформаційний лист “Морфологічні і біохімічні крітерії оцінки впливу сполук свинцю, кадмію і g-опромінення на репродуктивну функцію чоловіків і ризик для здоров'я їх нащадків.”

Подано проект методики визначення свинцю і кадмію у крові і сперміях. Матеріали досліджень використано при підготовці розділу 2 “Репродуктивные показатели норми человека”, які увійшли у довідник ”Основные показатели физиологической нормы у человека” под ред. И.М.Трахтенберга.- К., Авицена, 2001.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно сформульовано мету і завдання роботи, самостійно поставлено експерименти і проведено забір матеріалу та виконано електронно-мікроскопічні, хіміко-аналітичні і біохімічні методи дослідження. Проведена статистична обробка цифрових даних та аналіз отриманих результатів і їх узагальнення.

Апробація роботи. Основні положення дисертації були викладені на науково-практичній конференції з актуальних питань охорони здоров'я (м. Одеса, 1990); Всесоюзній школі-семінарі “Механизмы адаптации к экстремальным факторам среды” (м. Ростов-на-Дону, 1990); VIII Міжнародному сімпозіумі “Trace element in mаn and animals ” (м. Дрезден, 1993); V Міжнародному сімпозіумі “Metal ions in biology and medicine” (м. Мюнхен, 1998); конференції молодих вчених, присвяченій 70-річчю Інституту медицини праці (м. Київ) і 17-ому та 18-ому семінарах з токсикології клітини (Scandinavian Society of Cell Toxicology Annual Workshop on In Vitro Toxicology) (м. Ростанга, м. Стокгольм, 1999, 2000), на 4-ому европейському симпозіумі і 15-ій Словацькій конференції з атомно-абсорбційной спектроскопії (2000) та на 1 з'їзді Токсикологів України (Київ, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 робіт, які відображають зміст дисертаційної роботи.

Структура та об'єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 184 сторінках. Робота включає вступ, аналітичний огляд літератури, розділ, що характерізує матеріали і методи дослідження, розділ власних досліджень, узагальнення, висновки, додатки. Диссертація ілюстрована 37 мікрофотографіями, 23 таблицями, 15 рисунками. Список цитованої літератури включає 249 бібліографічних посилань, з яких 95 – зарубіжні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкти та методи досліджень. Експерименти проводилися на 395 нелінійних статевозрілих щурах-самцях масою 170-250 г розводки віварія Інституту медицини праці. Всі тварини знаходилися на однаковому харчовому та водному режимі і утримувалися в однакових умовах. Досліди проводилися в осінній період. Кількість тварин в статистичних групах дорівнювала 6-8. В експериментах по моделюванню дії сполук свинцю, кадмію і іонізуючого опромінення всі тварини були розділені на 5 груп:

- перша група була контрольною. Тварини отримували внутрішньочеревно фізіологічний розчин;

- друга група отримувала внутрішньочеревно водний розчин ацетату свинцю в дозі 1/200 ЛД50 (ЛД50 солі Pb= 250 мг/кг);

- третя – водний розчин хлориду кадмію в дозі 1/200 ЛД50 (ЛД50 солі Cd= 3 мг/кг);

- четверта група 2 рази на тиждень підлягала дії g-опромінення в дозі 1/30 ЛД 50/30

(ЛД 50/30=6,0 Гр);

- п'ята група підлягала поєднаній дії факторів, які вивчалися, в тих же самих дозах,

що використовувались при ізольованому введенні.

Тривалість експерименту (48 днів) дорівнювала 1 циклу сперматогенезу і часу, необхідному для проходження статевими гаметами придатка сім'яника. Відновлювальний період також дорівнював 1 циклу сперматогенезу. Вказані терміни дозволяли оцінити морфофункційний і біохімічний стан сперматозоїдів щурів, які на протязі свого розвитку підлягали ізольованій і поєднаній дії факторів, що вивчались.

Опромінення тварин g-промінями проводили на установці “АГАТ-Р” з джерелом g-опромінення 60Со в разовій дозі 0,25 Гр при потужності дози 0,71 Гр/хв. Поле опромінення було розмірами 20х20 см, фокусна відстань – 15 см. Тварин декапітували на 1, 2, 5, 7 тижнях і у відновлювальний період (через 7 тижнів після закінчення дії). Сумарні дози важких металів, які отримували щури-самці були: на кінець 1 тижня експерименту-1/40 ЛД50 солей Pb,Cd , 2 тижня – 1/20 ЛД50 солей Pb,Cd, 5 тижня – 1/8 ЛД50 солей Pb,Cd, 7 тижня – 1/6 ЛД50 солей Pb,Cd. Дози ЛД50 важких металів були використані згідно з наведенними у дослідженях Любліної Е.І. і др. (1983), Іваницької Н.Ф. (1991). У контрольних і піддослідних тварин вилучали кров, сім'яники, епідідімальні сперматозоїди. В крові, сім'яниках і чоловічих гаметах контрольних і експериментальних тварин визначали кількість накопичених важких металів.

Спермії експериментальних тварин, що використовували в дослідах, вивчались у наступній послідовності.

У кожної з тварин відпрепаровували хвостові відділи придатків над'яєчка (cauda epididimis) та сім'явиносні протоки (vas deferentia). Їх розміщували в 2 мл теплого (37оС) фізіологічного розчину. Використовуючи тонкі очні пінцети, проколювали стінку vas deferentia і обережно вичавлювали їх вміст. Після ресуспендування сперму інкубували в стерильних пробірках при 37оС на протязі 25 хв у вологій атмосфері.

Підрахунок загальної кількості сперматозоїдів проводили в камері Горяєва за допомогою світлового методу мікроскопіювання при збільшенні х 600, запронованого Молнар Е. (1969) та Беглашвілі Т.В. (1989). Результат виражали в млн клітин в 1 мл розчину.

Для визначення рухливих і патологічних сперміїв застосовували метод Беглашвілі Т.В. (1989). Проби розбавляли в 20 разів фізіологічним розчином при підрахуванні кількості рухливих сперміїв. Патологічні форми визначали після пофарбування сперміїв. Препарати досліджувалися у світловому мікроскопі при збільшені х600 та х800. Кількість рухливих сперміїв визначали в млн, а патологічні визначали підрахунком в випадковій вибірці 100 клітин в одній пробі.

Електронномікроскопічні дослідження сперматозоїдів (трансмісійна та скануюча електронні мікроскопії). Для трансмісійної електронної мікроскопії суспензію сперматозоїдів фіксували 2,5% розчином глютаральдегіду в 0,1 М фосфатному буфері (рН - 7,4) і дофіксовували в 1% чотирьохокису осмію за Мілонінгом (Волкова О.В., 1987). Дегідратацію матеріалу проводили за загальноприйнятою методикою у спиртах висхідної концентрації та ацетоні і заливали в суміш епону та аралдиту. Ультратонкі та напівтонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі системи “Reihord” (ФРГ), контрастували уранілацетатом, цитратом свинцю за Рейнольдсом (Уикли Б., 1975). Перегляд та фотографування зрізів проводили на електроному мікроскопі “Fillips” (Голландія) при прискорюючій напрузі 75 кВ, та збільшенні 10 000-80 000. Підготовку препаратів для скануючої електронної мікроскопії здійснювади за методом Карупу В.Я. (1984). Виготовлені зразки вивчали за допомогою скануючого мікроскопу “Comskan”(Англія). Ці спостереження були проведені при прискорюючій напрузі 20 кВ, та збільшеннях 1000 – 20 000. Фотографування об'єктів проводили за допомогою фотоаппарата “Mamiya.” Атипічні спермії визначали за їх довжиною у випадковій вибірці 100 клітин у фотографічному знімку.

Біохімічні досліди проводили за такою схемою. Фотометрично визначали вміст АТФ в сперміях по неорганічному фосфору за методом Лоурі і Лошицу (Болдырев А.А., 1988). Вміст АТФ визначали в мкМ Рн/106 кл. Визначення загальних фосфоліпідів в суспензії сперматозоїдів проводили за методом Лемешко В.В. і співавт. (1991) з використанням молібденового реактиву за Кейтс М. (1975) і фотометрування на СФ-64. Спектрофотометрію фруктози проводили за тіобарбітуровим методом за Карповою Е.А. (1985).

Атомно-абсорбційна спектрофотометрія свинцю і кадмію проводилася після кислотної мінералізації проб крові, сім'яників і суспензії сперматозоїдів за методами Dobrovolsky L. et al. (1993), Прайс В.(1976), Andrusishina I.(1998) і подальшому аналізу на приладі ААС “Сатурн-3” (Україна) та приладі ААС 5100 Z PC фірми Perkin –Elmer (США).

Обробка цифрових даних усіх видів досліджень проводилась з використанням методу варіаційної статистики (Лакін Г.Ф., 1973). Достовірність відмінностей середніх величин і їх помилок визначалась за критерієм Стьюдента. Математична обробка проводилась за допомогою програм “Статистика”.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Одним із важливих морфометричних показників стану організму експериментальних тварин є маса тіла і внутрішніх органів (Кондратенко В.Г., Газенко Л.Ф., 1985, Авцын А.П. и др., 1991, Стусь В.П., 1997, Люлько А.А., Стусь В.П., 1995, Котеров А.Н., 2000, Hysyoshi O.T., 1988, Toman R. еt al., 1995). Так, у підгострому (48-денному) експерименті було встановлено зниження абсолютної і відносної маси сім'яників при всіх видах впливу – іонізуючому опроміненні та дії важких металів, що говорить про радіаційний і токсичний вплив цих факторів в цілому на організм. При цьому встановлено, що головний внесок в поєднану дію робить ?-опромінення.

Про інтенсивність токсичного впливу свинцю і кадмію на організм говорить вміст їх у індикаторних біосередовищах. Показано (Ершов Ю.Т., Плетнева Т.В. 1989, Авцын А.П. и др., 1991, Трахтенберг И.М. и др., 1994), що визначення свинцю і кадмію у крові (Pb-K, Cd-K) відображає поточну експозицію. Вміст свинцю і кадмію у сім'яниках і сперматозоїдах (Pb-С, Cd-С, Pb-Сп, Cd-Сп) відображає ступінь навантаження ними репродуктивної системи. У 48-денному експерименті виявлено накопичення рівнів Pb-K та Cd-K. Коли рівні Pb-K зростали від 1 по 7 тиждень експериментів, то рівні Cd-K мали характер найбільшого росту на 1,2 тижнях спостереження. Виявлена поведінка накопичення кадмію у крові є характерною для даного металу (Красовский Г.Н. и др., 1976. Михалева Л.М., 1988, Pooman S. et al., 1989, Tooman R. et al., 1995, Oho Y. et al., 1996 ). В відновлювальний період спостерігалось зниження рівнів (Pb-K, Cd-K), але порівняно з контролем, вони залишались достатньо високими.

Особливостями накопичення Pb та Cd в сім'яниках при ізольованій дії металів було зростання їх рівнів у весь час спостережень, і у відновлювальний період рівні продовжували залишатись високими. При ізольованій дії ?-опромінення також спостерігалось зростання рівнів Pb-С, Cd-С, яке було обумовлено надходженням з оточуючого середовища - з їжею і водою.

В сперматозоїдах щурів також накопичувалися свинець і кадмій. Встановлено, що дія ?-опромінення сприяє зростанню рівнів Pb-Сn і Cd-Сn при сумісній дії факторів, що вивчались. У відновлювальний період рівні Pb-Сn і Cd-Сn продовжували зростати, особливо при поєднаній дії.

Оцінка радіологічного і токсичного впливу на сперматозоїди щурів за морфофункційними показниками – загальній кількості і кількості рухливих сперміїв - виявила пригнічення цих показників при всіх видах впливу, особливо вираженою вона була при ізольованій дії ?-опромінення. У відновлювальний період спостерігалось зниження загальної кількості сперміїв при ізольованій дії ?-опромінення і поєднаній на 46,3% і 43,5%. Кількість патологічних сперміїв зростала при ізольованій дії 3 факторів і особливо вираженою була при ізольованій дії важких металів. Змінювалась довжина сперматозоїдів, особливо суттєво при дії ? -опромінення (61,3%) і поєднаній дії (61,2%). Найбільші зміни співвідношень довжини сперматозоїдів були виявлені при ізольованій дії ?-опромінення (68,7%). Виявлено також збільшення кількості великих сперміїв, найбільш суттєве збільшення спостерігалось при поєднаній дії (до 80%). Поява великої кількості малих і великих гамет свідчить про погіршення репродуктивного матеріалу, бо відомо, що їх поява може змінювати в'язкість суспензії і в зв'язку з цим знижувати рухливість сперміїв (Рузен-Ранге Э., 1980, Бурнашева С.А и др., 1982, Бідна Л.П., 1994, Стусь В.П., 1995).

Встановлена в поданій роботі динаміка субмікроскопічних альтернативних змін сперміїв, що зазнали дії сполук свинцю і кадмію в дозах 1/200 ЛД50 і гамма-опромінення в дозі 1/30 ЛД50/30, характеризується певною послідовністю змін. У відповідь на ізольовану і поєднану дію важких металів і опромінення в першу чергу реагує плазмалема сперміїв. Так, уже в ранні періоди підгострого експерименту порушується її конфігурація, що проявляється інвагінатами. Мембранні компоненти внутрішньоклітинних органел проявляють більшу резистентність, ніж плазматична мембрана. З накопиченням доз вивчаємих факторів ( після 5 тижня) з'являються спермії з множинними інвагінатами, спостерігається клазмоцитоз – відокремлення ділянок цитоплазми. Посилення клазмоцитозу і везикулоутворення є однією з ранніх реакцій клітин на різноманітні шкідливі впливи (Авцын А. П., 1991)

Характерним у цей період є шеддінг – відшарування плазматичної мембрани і порушення її цілісності та скидання фрагментів у міжклітинне середовище, а також псевдомієлінізація – утворення міеліноподібних структур, виникнення яких ймовірно ініціюється внаслідок розриву та скручування фрагментів плазмалеми, і є одним із проявів інтенсифікації перекисного окислення ліпідів (Авцын А.П., Шахламов В.А, 1979, Носов А.Т. и др., 1994). Зміна цитоархітектоніки чоловічих гамет, можливо, обумовлена вираженими змінами мікров'язкості і збільшенням плинності мембран.

Чутливими до дії опромінення і важких металів є мітохондрії. Ранньою реакцією з їх боку у переважній більшості клітин є підвищення електронної щільності матриксу. В подальшому спостерігається його набрякання, що призводить до утворення крупних вакуоль – утворів з електронно-прозорим вмістом, та втрата їх частини. Виявлені зміни мітохондрій з впевненістю свідчать про пригнічення енергоутворюючої функції цих органел і, тим самим, про загальне зниження рівня окисно-відновлювального фосфорилювання, що підтверджується даними обміну електролітів.

При поєднаній дії опромінення і сполук свинцю та кадмію спостерігається кон'югація плазмалеми в області екваторіальних сегментів головок, рідше злиття головок із конгломератами хвостових відділів. Можна припустити, що поєднана дія на чоловічи гамети опромінення і важких металів в порівнянні з ізольованою дією викликає в них посилення міжклітинної агрегації. Це може бути обумовлено порушенням цитоскелету, елементи якого тісно пов'язані як з ліпідним шаром мембрани, так і з глікокаліпсом. Збільшення в суспензії декапітованих гамет найбільше проявлялось при ізольованій дії кадмію і сумісній дії факторів, що вивчались.

Відомо, що однією з суттєвих реакцій біологічних мембран, у тому числі мембран сперматозоїдів, є забезпечення вибіркової проникності для речовин різної молекулярної маси. Іонний транспорт може здійснюватись за допомогою пасивної дифузії, або за допомогою транспортних АТФ-аз, роботи іонних насосів. Пошкодження системи транспорту іонів лежить в основі багатьох порушень у клітинах (Хансон К.Е., Комар В.Е., 1986). Отримані дані власних досліджень свідчать про те, що дія важких металів і радіації може призводити до різнонаправлених змін іонного балансу в чоловічих статевих клітинах. Так, рівні К+ знижувались при ізольованій дії свинцю (на 95,96 %) і зростали при ізольованій дії кадмію ( на 35,54%) і поєднаній (у 2,35 разів). У відновлювальний період знижувались рівні К+ при ізольованій дії важких металів і зростали при ізольованій дії г-?промінення і поєднаній. Зниження рівнів Na+ спостерігалось при ізольованій дії свинцю (на 42,46 %) і зростання при дії ?-опроміненя (на 70,65 %). При поєднаній дії рівень Na+ не змінювався, що вірогідно, обумовлено накладанням діючих факторів. У відновлювальний період також зростав рівень Na+ при ізольованій дії важких металів і при дії г-?промінення. При ізольованій дії свинцю, г-?проміненні та поєднаній дії рівень Са2+ у динаміці експерименту зростав (відповідно у 9,36 разів, 60,48 %, 46,88 %). У відновлювальний період він зростав тільки при ізольованій дії ?-опромінення, а при ізольованій дії важких металів знижувався. Ефект сумісної дії обумовлений дією ?-опромінення. При ізольованій дії кадмію і опромінення рівні Mg2+ зростали на протязі всього періоду спостережень (на 70,27 і 83,05%). У відновлювальний період зростали рівні Mg2+ при ізольованій дії кадмію, г-?промінення і сумісній. Вклад в ефект поєднаної дії обумовлений дією опромінення і кадмію. Зміни іонного балансу в чоловічих гаметах поетапні: так, першими реагують на вплив важких металів і г-опромінення К+ та Na+, далі Mg2+ і Ca2+. Такі зміни супроводжуються порушенням роботи мембранних насосів і пасивного транспорту іонів в клітині. Порушується пасивний транспорт К+ та Na+ - збільшується рівень Na+ і знижується рівень К+., що призводить до морфологічних змін плазмалеми – набряканню, інвангінатам та іншим явищам. Зміни концентрацій іонів Mg2+ і Ca2+ в свою чергу призводять до деструктивних змін плазмалеми і мітохондрій, причому зміна рівнів Са2+ і Mg2+ свідчить про більш глибокі деструктивні порушення в чоловічих гаметах. Відомо (Хансон К.П., Комар В.Е., 1985, Трамп Е., 1984), що Mg2+ переважно міститься в мітохондріях і відіграє там провідну роль у формуванні процесів окислювально-відновного фосфорилювання, а Ca2+ - є позаклітинним електролітом і при порушенні і набряканні плазмалеми його концентрація може зростати у 2 і більше разів, що призводить до міелінізації і загибелі клітини.

Дотепер накопичено значний експериментальний матеріал, який доводить важливу роль енергетичних субстратів у механізмах променевого і токсичного ураження біологічних тканин (Древаль В.И., 1992, 1993, Андрушкевич В.А., Календо Г.С., 1992, Crabowska M., 2000, Нейко Е.М., Моісеенко М.І., 1999). Основними об'єктами пошкоджуючої дії можуть бути аденозинтрифосфат (АТФ) - макроерг, ненасичені жирні кислоти мембранних фосфоліпідів, вуглеводи. Висока чутливість до дії радіаційного і токсичного фактору пов'язана з обмеженою можливістю сперматозоїдів до процесів репарації, дефіцитом антиоксидантних ферментів, накопиченням токсичних метаболітів (Aitkon R. J. et al., 1990,1992, Серебровська О.З., 2000).

В дослідах виявлено різнонаправлені зміни вмісту АТФ у сперміях. Так, при ізольованій дії свинцю і кадмію спостерігалось збільшення рівнів АТФ відповідно у 2,55 і у 1,84 рази. Ізольований вплив опромінення призводив до зниження рівня АТФ у 3,43 рази на кінець експерименту. При поєднаній дії вивчаємих факторів рівень вмісту АТФ у чоловічих гаметах знижувався у 1,75 рази. Накопичення вмісту АТФ при ізольованій дії важких металів обумовлено їх дією, тобто блокуванням механізмів відновлення молекули АТФ у сперміях щурів, що проявлялось підвищенням їх рухливости у суспензії. В той же час зниження рівня АТФ при ізольованій дії г-опромінення і поєднаній дії вивчаємих факторів свідчить про більш глибоки процесси порушення в чоловічих гаметах. Зниження кількості рухливих сперміїв також свідчить про це.

Згідно сучасним уявленням, в більшості патологічних процесів бере участь перекисне окислення ліпідів. Перекисного окислення зазнають і фосфоліпіди, оскільки вони містять поліненасичені жирні кислоти. В той же час, фосфоліпіди беруть участь у регуляції активності мембранозв'язаних і мембранолокалізованих ферментів, обмеженні інтенсивності гліколізу, компенсації дефіциту енергетичного субстрату (Патарая К.Н. и др., 1988, Кудяшева А.Н. та ін., 1996). Встановлено, що ізольована дія свинцю та кадмію призводить до зниження загальної кількості ФЛ у чоловічих гаметах щурів у 33 та 20 разів відповідно. При ізольованій дії г-опромінення загальна кількість ФЛ знижувалась на 41,03%, а при поєднаній на 60 %. Отримані дані свідчать, що головний вклад в поєднану дію обумовлений дією важких металів. В той же час вони свідчать про пригнічення процесів аеробного окислення. Дані щодо ультрастуктурних порушень – відшарування мембран та втрата їх ділянок - свідчать про пригнічення ролі ФЛ в збереженні структури мембран сперматозоїдів.

Рух сперматозоїдів відбувається ще і за допомогою анаеробного розщіплення вуглеводів. Наявність фруктози у чоловічих гаметах свідчить про здатність до капасітації та акросомної реакції, без яких неможливе запліднення (Langlous Y. et al 1985, Альбертс Б. 1987, Грин Н и др., 1990). Встановлено, що ізольована дія кадмію і опромінення призводить до накопичення рівня фруктози (відповідно на 41,8% та у 1,85 разів), в той же час рівень загальних ФЛ знижувався. Це свідчить про посилення процесів анаєробного окислення, що може призвести до порушення процесів капасітації та акросомної реакції в сперміях щурів, втраті рухливості гамет та здатності їх мембран до злиття з оолемою під час запліднення (Aithken R.J., et al., 1988, Baner H.W.G.,1996).

Можна зробити висновок, що висока щільність мітохондріального матриксу та гіпертрофовані органели свідчать про надлишок АТФ, тобто певно, про підвищений рівень клітинної енергетики (Иванов И.И.и др., 1959, Бурнакова С.А и др., 1982), що відповідає максимальному функціональному навантаженню цих органел. Гетерогенність реакції мітохондрій, яка має місце як в межах всієї популяції чоловічих гамет, так і в межах однієї і тої самої клітини, може бути пов'язана з різною швидкістю репаративних і компенсаторних процесів у органелах клітин. Перебудову метаболізму в статевих клітинах, яка спостерігається під ізольованим впливом важких металів, радіації і поєднаній їх дії можна охарактеризувати як направлену на пригнічення гліколітичних процесів і відносну активацію процесів анаеробіозу.

Деструктивні зміни клітинних і внутрішньоклітинних мембранних структур, які були встановлені в цій роботі, вказують на розходження біохімічних і морфологічних порушень у сперміях експериментальних тварин. Так, якщо при ізольованій дії важких металів відмічається зростання АТФ і фруктози, то зміни цитоархітектоніки мембран наростають. Вірогідно це можна пояснити тим, що компенсаторне посилення роботи енергетичних субстратів є недостатнім для усунення реакцій, що розвиваються в мембранах сперміїв і процес деструкції прогресує, особливо це проявляється у групах з ізольованою дією г-опромінення, кадмію та поєднаній, знижуючи функцію чоловічих гамет.

За даними корреляційного аналізу встановлено зв'язок між морфологічними і біохімічними змінами в чоловічих гаметах щурів. Так при ізольованій дії свинцю загальна кількість сперміів і їх рухливість залежали від рівнів АТФ і фруктози. При ізольованій дії кадмію рухливість залежала від рівнів АТФ, та Са2+ і Mg2+ . Під ізольованим впливом радіації виявлено кореляційні зв'язки між загальною кількістю і рухливістю гамет та рівнями вмісту у сперміях АТФ, К+ і Mg2+. При сумісній дії – між загальною кількістю і рухливістю сперматозоїдів і фруктозою. Встановлені факти свідчать про тісний зв'язок морфологічних порушень у чоловічих гаметах з біохімічними, а також про різні механізми реалізації цих пошкоджень.

За результатами проведенного дісперсійного аналізу фактори, що вивчались по зростаючій силі ефекту можна згрупувати у слідуючий ряд: сумісна дія ® Pb® Cd ® г-?промінення. Найбільший вплив на сперматозоїди чинить радіація, це зумовлено не тільки більшою дозою опромінення порівняно з дозою важких металів відносно ЛД50, а також з різними механізмами дії радіації і важких металів на клітини. Відомо, що дія радіації обумовлена посиленням окисно-відновлювальних процесів, утворенням вільних радикалів. Дія важких металів зумовлена їх амбівалентним характером поведінки у клітинах, тобто великим рідством до карбонільних, гідроксильних і сульфатних груп, що є причиною утворення комплексів зі свинцем і кадмієм при зв'язуванні цих металів з біологічно активними молекулами (білками, амінокислотами і нуклеотидами), велику роль при цьому відіграють атоми азоту і кисню.

Однак посилення єфекту дії при поєднаному впливі факторів, що вивчались, встановлено для вмісту К+, АТФ та загальних ФЛ і довжини клітин.

Відомо, що в умовах впливу невеликих доз опромінення і важких металів (Калистратова В.С., 1983), доцільно проводити оцінку поєднаної дії факторів у ряду функційно сполучених систем, щоб мати уявлення про напрямок порушень в них, що дозволяє оцінювати адаптивні зміни та доклінічну компенсаторну патологію.

Порівняння різних математичних підходів, щодо визначення ефектів поєднаної дії за коєфіціентом сумісної дії (Ксд) на прикладі змін морфофункційних та біохімічних показників чоловічих гамет у підгострому експерименті дозволило виявити, що Ксд розраховані через відносні відхилення математичної середньої (М) (за формулою Сваткова В.И., 1981) носили відповідь адитивну та більше адитивної дії для показників - Mg2+ (1,33) та АТФ (1,21) та загальних ФЛ (0,97). Використання модифікації формули за Нагорним П.А.(1985) дозволило виявити ефект більше адитивного для К+ (1,60) та Na+ (2,17) і адитивний для рівня Са2+(0,87). Ксд, розрахований з використанням коєфіціента вірогідності (Р) за формулою експертів ВООЗ (2000), виявив, що ефект більше адитивного був характерним для показників загальної кількості (2,58) обміну електролітів (K+- 1,67 Na+- 1,50 Ca2+- 1,35 Mg2+- 1,20) та енергетичного обміну (АТФ- 1,32, ФЛ- 1,24). Тому була застосована формула Антомонова М.Ю (1995) з урахуванням кратності середніх, їх помилок і напрямку змін показників. Було виявлено ефект поєднаної біологічної дії за Ксд, як більше адитивного і адитивний для рухливості сперміїв (0,98, 1,65), вмісту Mg2+ (1,49, 1,25, 0,95) і фруктози (0,92, 1,05). Отримані результати дозволяють припустити, що при поєднаній дії, можливо, необхідно розраховувати Ксд з урахуванням напрямку змін показників.

В цілому при розрахунках Ксд за формулами Сваткова, Нагорного і ВООЗ виявлено співпадання ефектів для показників загальної кількості сперміїв, вмісту Са2+ та АТФ, а при використанні формул ВООЗ та Антомонова – для показників вмісту К+ і АТФ. В той же час відомо, що для чоловічих гамет характерним є зниження загальної кількості та кількості рухливих форм у відповідь на дію хімічних і фізичних факторів. При цьому порушується обмін електролітів, зростає вміст Na+ та Са2+ і знижується вміст K+ і Mg2+, а це призводить до набрякання плазмалеми і змін енергетичного обміну (в цих клітинах знижується вміст АТФ). Тривалий вплив цих шкідливих факторів призводить до кількісних змін форм фосфоліпідів – порушуеться плазмалема і мембранний апарат мітохондрій. Зниження вмісту фруктози (також енергетичного субстрату) може призводити до пригнічення акросомної реакції та процесу капасітації. Тому зміни морфофункційних та біохімічних реакцій сперматозоїдів у відповідь на ізольовану і поєднану дію радіації та важких металів можуть призводити до порушень донації повноцінної генетичної інформації, заплідненню і взагалі можуть знижувати запліднюючу функцію експериментальних тварин. Стосовно ж впливу цих факторів на людину, то можна припустити, що поєднана дія іонізуючого опромінення і сполук важких металів може призводити до подібних морфофункційних і біохімічних змін характеристик репродуктивного матеріалу (сперматозоїдів) чоловіків, які контактують з ними на виробництві і призводити до порушень їх репродуктивного здоров'я.

ВИСНОВКИ

1. Ізольована і поєднана дія іонізуючого опромінення та сполук важких металів – свинцю і кадмію на організм експериментальних тварин супроводжується пригніченням таких морфометричних показників, як абсолютна і відносна маса сім'яників.

2. При багаторазовій дії на організм самців-щурів ?-опромінення і накопиченні в крові, сім'яниках і сперматозоїдах вказаних металів виникає ряд морфофункціональних, ультраструктурних і біохімічних змін в чоловічих гаметах щурів.

3. Морфофункціональні зміни сперматозоїдів щурів характеризуються зниженням загальної кількості, кількості рухливих сперміїв та появою значної кількості патологічних, атипічних їх форм у відповідь на вплив ?-опромінення та солей свинцю і кадмію.

4. Ізольована дія g-опромінення, свинцю і кадмію викликає в сперміях щурів ряд ультраструктурних порушень, які проявляються деструкцією плазмолеми і акросоми. Провідними ознаками, які відображають зміни ультраструктури чоловічих гамет при поєднаній дії, є деструкція мембран плазмолеми і мітохондрій та аглютинація до 80 % клітин.

5. Зміна обміну електролітів у чоловічих гаметах щурів при ізольованій і поєднаній дії радіації і важких металів призводить до ураження мембранного апарату клітин. Ранніми проявами було зниження рівнів К+ і підвищення Na+, які призводять до деструкції плазмалеми. Пізніми проявами було зростання рівня Mg2+ і Ca2+ впродовж експерименту та у відновлювальний період, що сприяло аглютинації і руйнуванню мітохондрій.

6. Особливостями порушень енергетичного обміну в сперматозоїдах щурів у відповідь на ізольовану дію солей свинцю і кадмію було накопичення енергетичного субстрату, яке супроводжувалося гіперактивацією частини чоловічих гамет. Поєднана дія і дія g-опромінення призводять до виснаження фондів АТФ в чоловічих гаметах щурів, яке супроводжувалось зниженням здатності до рухливості.

7. Виснаження запасів загальних ФЛ і накопичення фруктози внаслідок ізольованої і поєднаної дії факторів, що вивчались, призводить до порушень процесів аеробного та анаеробного окислення в клітинах, що є причиною ультраструктурних змін в чоловічих гаметах та здатності їх до акросомної реакції і капасітації.

8. Виявлено позитивний кореляційний зв'язок між загальною кількістю і кількістю рухливих сперміїв та змінами обміну електролітів – K+, Mg2+, Ca2+, зниженням запасів АТФ, фруктози.

9. Порівняльна характеристика Ксд продемонструвала, що при його розрахунках необхідно враховувати направленість змін показників. Ксд характеризує дію як адитивну так і більше адитивної відповіді для показників – рухливості сперміїв, рівнів вмісту К+, Mg2+ і фруктози.

10. Узагальнення і аналіз отриманих експериментальних даних дозволяють на достатніх підставах припустити, що як ізольована та і поєднана дія факторів, що вивчались може призводити до подібних змін морфофункціональних та біохімічних характеристик сперматозоїдів чоловіків, які контактують з ними на виробництві, та призводити до порушень їх репродуктивного здоров'я.

Список опублікованих автором праць за темою дисертації:

1. Андрейченко С.В., Андрусишина И.Н., Карась А.Ф., Нурищенко Н.Е., Мехед Н.В. Исследование влияния гамма-радиации на движущую функцию крысиных сперматозоидов //Физика живого.-1996.-№1.-С.113-121.

2.Андрусишина І.М. Вплив гострого та хронічного введення малих доз свинцю на обмін електролітів в сперматозоїдах щурів //Журн. Акад. Мед. Наук України.-1999.-Т.5. №1-С.165-170.

3.Андрусишина И.Н. Морфофункциональные изменения сперматогенеза при воздействии свинца и кадмия на самцов белых крыс //Совр. пробл. токсикологии.-1999.-№2.-С.22-26.

4.Трахтенберг И.М.,Андрусишина И.Н. К проблеме сочетанного гонадотоксического действия тяжелых металлов (свинца и кадмия) и ионизирующего излучения //Гигиена труда.-К., 2000.-Вып.31-С.101-110.

5.Андрусишина И.Н. Антомонов М.Ю. Сравнительная характеристика коэффициентов сочетанного действия на примере изолированного и сочетанного действия солей свинца, кадмия и ?-излучения // Гигиена труда.-К., 2001, вып. 32-С.257-263

6.Андрейченко С.В., Алексеенко В.Н., Андрусишина И.Н., Ильченко О.И., Тищенко А.В. Изучение структурной морфологии сперматозоидов различными микроскопическими методами /Тез.докл. науч.-практ.конф. по ЛФК. Одесса, 1990-С.73-74.

7.Андрейченко С.В., Андрусишина И.Н., Алексеенко В.Н., Нурищенко Н.Е. Влияние низких доз радиации на биохимические процессы