НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

СТРУТИНСЬКИЙ РУСЛАН БОРИСОВИЧ

УДК 612.17+616.12:092

ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ НОВИХ АКТИВАТОРІВ

АТФ-ЗАЛЕЖНИХ КАЛІЄВИХ КАНАЛІВ НА ФУНКЦІЇ СЕРЦЯ ТА ВАЗОМОТОРНІ РЕАКЦІЇ В НОРМАЛЬНИХ ТА ПАТОЛОГІЧНИХ УМОВАХ

14.03.04- Патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ 2002

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в відділі експериментальної кардіології

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук,

академік НАН України,

Олексій Олексійович Мойбенко

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

заступник директора

завідуючий відділом експериментальної кардіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук

Анатолій Іванович Соловйов,

Державний фармакологічний центр МОЗ України

керівник сектору доклінічних випробувань

лікарських засобів

доктор біологічних наук, професор

Михайло Михайлович Філіпов

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця

завідуючий кафедрою фізичного виховання

Провідна установа: Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України

Захист відбудеться 25.02.2003 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інститут фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою:

01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розісланий 24.01.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серцево-судинні захворювання головна причина високої та все зростаючої смертності населення України. В теперішній час в загальній структурі смертності серцево-судинні хвороби займають перше місце, приблизно 60 відсотків людей помирають від захворювань серця і судин (Москаленко ВМ, 2001). Поряд з іншими причинами, переважно соціального характеру, важливе значення мають недостатнє визначення етіології та патогенезу серцево-судинних захворювань та пов'язана з цим недостатня ефективність їх лікування. Тому експериментальне вивчення нових шляхів профілактики та лікування цих захворювань є важливим і вельми актуальним напрямком сучасної фізіології та медицини. Серед інших наукових підходів до розвязання цих проблем велику увагу привернуло останнім часом практично нове питання про фізіологічні та фармакологічні властивості так званих АТФ-залежних калієвих каналів (КАТФ каналів). Як було недавно встановлено, КАТФ канали відіграють велику роль в регулюванні судинного тонусу та приймають участь в патогенезі серцево-судинних захворювань, які супроводжуються гіпоксією та ішемією тканин (Nichols CG, 1991; Yao Z, 1993; Cavero I, 1995). Фармакологічно викликане активування КАТФ каналів (наприклад, за допомогою синтетичних активаторів цих каналів) може суттєво поліпшити перебіг ряду хвороб серцево-судинної системи, сприяти компенсаторним процесам і, навпаки, інгібування дії цих каналів може ускладнити його, а також зменшити реактивність серцево-судинної системи та її резістентність до патологічних чинників.

Оскільки вивчення ролі КАТФ каналів в розвитку патологічних процесів, а також механізми їх кардіопротекторної (захисної) дії тільки недавно (середина 80-тих років XX сторіччя) розпочато (Noma A, 1983), багато питань зв'язанних з механізмами дії активаторів КАТФ каналів лишається нез'ясованими.

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження вазомоторних ефектів нових фторвмісних активаторів КАТФ каналів в нормальних умовах, при спонтанній артеріальній гіпертензії та визначення їх можливого кардіопротекторного впливу при гострій ішемії та реперфузії міокарда. Відповідно з метою роботи були поставлені наступні завдання:

1. Визначити динаміку та вірогідний механізм вазомоторної дії нових фторвмісних синтетичних сполук, аналогів відомого активатора КАТФ каналів – пінацидилу, названих в даній роботі як ПФ-5 та ПФ-10.

2. Провести порівняльне дослідження їх вазомоторної активності та відомого активатора КАТФ каналів – пінацидилу, що дасть можливість виявити їх відносну ефективність.

3. Провести порівняльне дослідження реакцій ізольованих судинних препаратів, опосередкованих активацією КАТФ каналів на фоні дії вазоконстрикторів, а саме ангіотензину ІІ та норадреналіну, що дасть можливість вивчити механізми взаємовідношення між вазодилататорами та різної природи вазоконстрикторними впливами та окреслити спектр можливого використання активаторів КАТФ каналів в клініці.

4. Провести порівняльне дослідження ефектів нових фторвмісних активаторів КАТФ каналів в нормальних умовах та при спонтанній артеріальній гіпертензії, що дасть можливість визначити вірогідність їх застосування при артеріальній гіпертензії в клініці.

5. Провести дослідження впливу нових фторвмісних активаторів КАТФ каналів на функціонування серця в нормальних умовах, визначити їх можливий кардіопротекторний вплив при моделюванні гострої ішемії-реперфузії серця та порівняти його з кардіопротекторними ефектами іншого активатора цих каналів – левкромакаліма та феноменом ішемічного прекондиціювання.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше були досліджені вазомоторні та кардіопротекторні ефекти нових вітчизняних фторвмісних активаторів АТФ-залежних калієвих каналів – ПФ-5 та ПФ-10.

Показано, що нові фторвмісні сполуки дійсно активують АТФ-залежні калієві канали та мають добре виражені дозозалежні вазодилататорні ефекти.

Вперше було показано, що норадреналін частково пригнічує активність судинних КАТФ каналів та підтвержено поодинокі літературні повідомлення про можливе пригнічення активності КАТФ каналів ангіотензином ІІ.

Вперше виявлено, що в умовах артеріальної гіпертензії пригнічення КАТФ каналів ангіотензином ІІ досить суттєво збільшується (на 22.6%). Показано, що новий активатор калієвих каналів ПФ-10 в концентраціях 1мкмоль/л - 10мкмоль/л має антиаритмічну дію, значно покращує функцію ішемізованого серця в період його реперфузії, практично повністю імітуючи кардіопротекторний феномен ішемічного прекондиціювання.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані є обгрунтуванням для створення та впровадження в виробництво лікарських засобів на основі нових фторвмісних активаторів КАТФ каналів та подальше застосування їх в клініці для корекції порушень серцево-судинної системи, пов'язаних з гіпоксією та ішемією тканин та при артеріальній гіпертензії. Отримані результати лягли в основу комплексних медико-біологічних досліджень по створенню нових препаратів – активаторів КАТФ каналів – проведення їх токсикологічних (Інститут фармакології та токсикології АМН України) та клінічних випробувань (Інститут кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України).

Апробація результатів дисертації. Основні положення і окремі фрагменти роботи були представлені та обговорені на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998 р.), ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000 р.), ХVIII з'їзді фізіологічного товариства ім. І.П.Павлова (Росія, Казань, 2001 р.) та на Пленумі Наукового товариства патофізіологів України (Одеса, 2002 р.).

Публікації. Результати дисертації викладені в 8 публікаціях: статті – 4, тези конференцій, з'їздів, пленумів – 4.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 168 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 25 рисунками, 5 таблицями, 6 схемами та 10 формулами. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалів і методів дослідження, 4 розділів результатів досліджень, розділу аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних літературних джерел. Список літератури охоплює 318 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Для отримання експериментальних даних були проведені тензометричні вимірювання на ізольованих, перфузованих при температурі 370С нормальним розчином Кребса, кільцевих смужках аорти морської свинки, щурів з нормальним рівнем систолічного тиску - нормотензивних щурів (119±11мм.рт.ст.) та щурів з генетично детермінованою артеріальною гіпертензією - спонтанно гіпертензивних щурів (рівень систоличного артеріального тиску - 160±10мм.рт.ст.), проведені експерименти на ізольованих, перфузованих по Лангендорфу при температурі 370С розчином Кребса-Хензелейта серцях самців морської свинки та для оцінки вазомоторних реакцій периферичних судин в умовах in vivo проводились експерименти на анестезованих під хлоралозно-уретановим наркозом (хлоралоза – 70мг/кг та уретан – 200мг/кг, внутрішньовенно) собаках з аутоперфузією судин задніх кінцівок за допомогою насоса з постійним протоком та реєстрацією перфузійного тиску в стегновій артерії.

Для проведення тензометричних досліджень використовували тварин вагою 0.2 – 0.25 кг., для експериментів на ізольованому серці - вагою 0.3 - 0.35 кг., та в експериментах in vivo використовувались безпородні собаки різної статі вагою від 16 до 25 кг.

Ізольовані судинні кільця мали діаметр 2мм, ширину 1.5мм. Усі тестування судинних смужок проводили в ізометричному режимі при початково заданій напруженості, при якій вони генерували максимальну силу у відповідь на інфузію норадреналіну (10мкмоль/л). Напруженність судинної смужки розраховувалась в н/м2. Перед вимірюванням, препарати, закріплені в експериментальній камері, витримувалися протягом 60хв у нормальному розчині Кребса. Дослідження вазодилататорних ефектів активаторів калієвих каналів проводили на фоні підвищеного судинного тонусу препаратів аорти, яке отримували, в залежності від поставленої мети експерименту, за допомогою норадреналіну (10мкмоль/л), ангіотензину ІІ (1мкмоль/л) чи гіперкалієвого розчину Кребса (KCl - 90ммоль/л). Для виявлення вазодилататорного резерва використовували максимальні вазодилататорні реакції на аденозин (1ммоль/л) на фоні норадреналінової (10мкмоль/л) вазоконстрикції. Цілісність судинного ендотеліального шару клітин визначали за наявністю ендотелій-залежних тестових реакцій на ацетилхолін (1мкмоль/л).

В експериментах на ізольованому серці тварин анестезували уретаном (140-160мг на 100гр маси) за 10хв до вилучення серця. Грудну порожнину відкривали на рівні з'єднання ребер і грудини та видаляли серце, яке одразу поміщали в льодовий розчин Кребса-Хензелейта. Швидкість перфузійного потоку контролювали перистальтичним насосом при підтриманні постійного об'єму перфузії в коронарних судинах (17.2мл/хв ± 0.5мл/хв). Реєстрували перфузійний тиск в коронарних судинах за умов постійної об'ємної швидкості перфузії (метод резистографії) та зміну скоротливої діяльності, яку визначали за змінами тиску в латексному балончику, який вводили в лівий шлуночок. Кількість аритмій обраховувалась на участках, де на протязі 1хв їх кількість була максимальною.

В експериментах на ізольованому серці і судинних смужках перфузуючий розчин насичували киснем за допомогою карбогена (газовою сумішю 95% О2 і 5% СО2) та підтримували температуру системи на рівні 370С ±0.50C за допомогою автоматичного термостата.

З ціллю визначення впливу активаторів калієвих каналів на резістивні судини в умовах in vivo, а саме на зміни артеріального тиску в стегновій артерії анестезованої собаки активатори вводились в перфузовану кров'ю стегнову артерію. Реєстрацію результатів в експериментах in vivo та в експериментах на ізольованому серці тварин здійснювали за допомогою полікардіографа "Mingograph-82" та "Mingograрh-34" фірми "Siemens-Elema" (Швеція).

Перед використанням активатори калієвих каналів розчиняли в диметилацетаміді. Глібенкламід розчиняли в суміші диметилсульфоксиду та етилового спирту (1:1). Норадреналін, ангіотензин ІІ, ацетилхолін, аденозин, глібенкламід, пінацидил, диметілсульфоксид та уретан були виробництва "Sigma Chemical" (США). Левкромакалім був виготовлений "Smith Kline Beecham Pharmaceuticals" (Велика Британія).

Нові фторвмісні активатори КАТФ каналів ПФ-5 (1.1) та ПФ-10 (1.2) створені співробітниками Інституту органічної хімії НАН України (під керівництвом проф. Л.М.Ягупольського) мають значно меншу токсичність ніж вже відомі активатори КАТФ каналів (їх середньосмертельна доза складає 2150 мг/кг, тоді як для пінацидилу лише 600 мг/кг) та відрізняються від пінацидилу (1.3) присутністю у молекулі замість піридильного - бензольного кільця з дифторометоксигрупою у 4 положенні для ПФ-5 та дифторометилтіогрупою у 4 положенні для ПФ-10.

Результати дослідження обробляли методом варіаційної статистики з використанням критерію t Стьюдента. Значення Р<0.05 розглядали як статистично достовірні.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Вплив нових активаторів калієвих каналів на тонус судинної стінки.

Вплив нових активаторів калієвих каналів на судинну гладеньком'язову тканину досліджувались in vitro на ізольованих смужках аорти морської свинки (три серії експериментів), нормотензивних і гіпертензивних щурів (дві серії), на ізольованому серці морських свинок та in vivo на стегновій артерії анестезованої собаки (дві серії).

Виявлено, що ПФ-5 та ПФ-10 мають добре виражені дозозалежні вазодилататорні властивості. Так, в експериментах на ізольованій аорті морської свинки, попередньо скороченій норадреналіном (10мкмоль/л), порогові дози ПФ-5 (0.1мкмоль/л) та ПФ-10 (0.5мкмоль/л) викликали зменшення напруження судинних смужок від вихідного рівня у середньому на 1016.75±133.51н/м2 (n=12; p<0.002) та 933.6±173.74н/м2 (n=9; p<0.006) відповідно, що в відсотковому розрахунку від максимального розслаблення ізольованих судинних смужок на дію аденозину (1ммоль/л) складало 2.53±0.2% та 2.57±0.2% відповідно. Максимальний ефект спостерігався при концентраціях 0.1ммоль/л для ПФ-5 та 0.5ммоль/л для ПФ-10 і складав у середньому 10085.5±1492.18н/м2 (n=15; p<0.001) та 17768.52±1749.85н/м2 (n=9; p<0.001) відповідно, що відповідало розслабленню смужок на 28.39±3.2% та 48.98±6.1% від вихідного рівня відповідно (рис.1).

В серії експериментів на ізольованому серці морських свинок виявлено, що ПФ-10 розслаблює коронарні судини серця дозозалежним чином при концентраціях 1мкмоль/л -10мкмоль/л. Максимальні ефекти ПФ-10 (зменшення перфузійного тиску в коронарних судинах у середньому на 16.38±1.38мм.рт.ст., n=12; p<0.001) відбувались при його концентрації в перфузуючому розчині 10мкмоль/л і складали в середньому 22.87±1.97% від вихідного рівня. Збільшення концентрації до 0.1ммоль/л не викликало подальшого зменшення перфузійного тиску в коронарних судинах та складало в середньому 15.81±2.12мм.рт.ст., n=10; p<0.002, що відповідало зменшенню коронарного перфузійного тиску на 21.19±2.82% від вихідного рівня.

В експериментах in vivo на анестезованих уретаном собаках досліджували вплив ПФ-5 на резістивні судини, а саме на зміни перфузійного тиску в стегновій артерії собаки. Виявлено, що при його введенні в дозах 0.05-0.2мг він розслаблює стегнову артерію собаки дозозалежним чином (рис.2).

Рис.1 Залежність величини реакцій препаратів Рис.2 Залежність зменшення перфузійного

аорти від діючої концентрації активаторів КАТФ тиску в стегновій артерії собаки від введеної

каналів; 1- ПФ-5; 2- ПФ-10; 3- пінацидил дози ПФ-5; 1- ПФ-5; 2- пінацидил

P<0.05 *- P<0.05; **- P<0.02

Зменшення перфузійного тиску в стегновій артерії від вихідного рівня в мм.рт.ст. в середньому складало 34.67±16.04 (n=6; p>0.05), 45.25±10.33 (n=6; p<0.03) та 53.67±5.49 (n=6; p<0.02) при введенні 0.05, 0.1 та 0.2мг ПФ-5 відповідно. При введенні таких доз пінацидилу (контроль) отримали зменшення перфузійного тиску в стегновій артерії собаки на 46.75±4.99 (n=6; p<0.003), 52.25±11.39 (n=6; p<0.02) та 64.67±2.6 (n=6; p<0.002) мм.рт.ст. відповідно. Для більшої наглядності, результати експериментів на рисунку 2 представлені в відсотках (за 100% взятий початковий перфузійний тиск в стегновій артерії піддослідної тварини), що дає змогу реально оцінити вплив активаторів калієвих каналів на судинний тонус.

Отримані нами результати на ізольованих смужках аорти морських свинок, щурів, на коронарних судинах ізольованого серця морских свинок in vitro та на стегновій артерії собак in vivo дозволяють вважати нові фтормісні активатори КАТФ каналів - ПФ-5 та ПФ-10 досить потужними модуляторами судинного тонусу. Особливо потужними їх ефекти були в експериментах на ізольованих смужках щурів - при концентрації ПФ-5 в експериментальній камері 0,1ммоль/л коли розслаблення судинних смужок складало у середньому 81-82% (n=7; p<0.001) від вихідного рівня (рис.5, рис.6(ІІ)). Таким чином, за певних концентрацій в експериментах in vitro, а саме в межах концентрацій від 0.1мкмоль/л до 0.1ммоль/л для ПФ-5 та від 0.5мкмоль/л до 0.5ммоль/л для ПФ-10 на ізольованих препаратах аорти та при концентрації ПФ-10 в межах від 1мкмоль/л до 10мкмоль/л на ізольованому серці морських свинок, а також в експериментах на стегновій артерії собак in vivo при введенні доз ПФ-5 від 0.05мг до 0.2мг нові фтормісні активатори калієвих каналів проявляють добре виражені дозозалежні вазодилататорні властивості.

Ідентифікація механізму дії нових активаторів калієвих каналів.

При дослідженні іонних каналів клітинних мембран та мембран клітинних органел неоціненну роль відіграють канальні інгібітори, використання яких надає можливість ідентифікувати та досліджувати функціональну роль іонних каналів. Найбільш відомими та надзвичайно ефективними інгібіторами КАТФ каналів є сульфонілуреатичний клас сполук (найвідоміші представники - глібенкламід та тольбутамід), які використовують як основні тест-агенти для визначення цих каналів та їх активаторів (Quayle JM, 1997). Тому, з метою ідентифікації механізму дії нових фторвмісних активаторів калієвих каналів, позначених у нас як ПФ-5 та ПФ-10, ми використовували глібенкламід.

Проведено дві серії експериментів: з попередньою блокадою КАТФ каналів глібенкламідом та додаванням глібенкламіду вже під час дії активаторів калієвих каналів.

Експерименти проводились на ізольованих, перфузованих при температурі 370С нормальним розчином Кребса кільцевих смужках аорти морської свинки, попередньо скорочених норадреналіном (10мкмоль/л).

Попередня 5 хвилинна перфузія глібенкламідом (10мкмоль/л) зменшувала вазодилататорні ефекти активаторів калієвих каналів. Так, ефекти ПФ-5, ПФ-10 та пінацидилу (концентрації всіх активаторів - 10мкмоль/л) в середньому складали 2161.55±477.39н/м2 (n=11; p<0.05), 2181.77±326.18н/м2 (n=11; p<0.003) та 3176.27±357.76н/м2 (n=11; p<0.004) відповідно, що було значно меншим порівняно з контролем (експерименти без глібенкламіду) - 8175.98±1336.55н/м2 (n=12; p<0.001), 3237.62±754.58н/м2 (n=11; p<0.002) та 9834.37±1300.5н/м2 (n=18; p<0.001) відповідно. В відсотках від вихідного рівня експериментах з попереднім застосуванням глібенкламіду розслаблення судинних препаратів ПФ-5, ПФ-10 та пінацидилом відповідно складало в середньому 3.277±0.7%, 2.32±0.12% та 5.71±0.98%, в контролі для них же –

8.64±1.4%, 6.74±1.03% та 14.11±1.44% відповідно.

Таким чином, глібенкламід в значній мірі попереджував вазодилататорні ефекти нових активаторів калієвих каналів ПФ-5 та ПФ-10 на 67.07% і 65.59% відповідно, що співпадало з величиною блокади ефектів пінацидилу - 59.53% в наших експериментах (рис.3) та з величиною блокади вазодилататорних ефектів левкромакаліму (10мкмоль/л) - близько 65%, описаних Theis JGW в 1997 році.

Додавання глібенкламіду (10мкмоль/л) в експериментальну камеру вже після повного розслаблення судинних смужок новими активаторами калієвих каналів (10мкмоль/л) повністю знімало їх вазодилататорні ефекти та повертало судинний тонус в вихідний рівень.

Отримані дані дозволяють припустити, що нові фторвмісні сполуки ѕ ПФ-5 та ПФ-10 можна ідентифікувати як активатори КАТФ каналів.

Рис.3 Зміна напруженності препаратів аорти Рис.4 Залежність величини ефектів ПФ-5 в

активаторами КАТФ каналів до (І) і після (ІІ) аорті морської свинки від типу попередньої

блокади КАТФ каналів глібенкламідом; вазоконстрикції;

100% - відповідає максимальній зміні напру- 100% - відповідає максимальній зміні напру-

женності при дії аденозину (1ммоль/л); женності при дії аденозину (1ммоль/л);

*- Р<0.01; **- P<0.05 І- гіперкалієвий розчин Кребса + ПФ-5;

ІІ- норадреналін + ПФ-5;

ІІІ- ангіотензин ІІ + ПФ-5;

*- Р<0.001; **- P<0.02

Ефекти активаторів КАТФ каналів на фоні вазоконстрикції різної

природи в аорті нормотензивних та гіпертензивних тварин.

Метою даних досліджень являлось визначення взаємовідносин різних механізмів регуляції судинного тонусу, а саме ми досліджували вплив норадреналіну та ангіотензину ІІ на вазодилататорні ефекти нового фторвмісного активатора КАТФ каналів ПФ-5.

На ізольованих смужках аорти морської свинки виявлено, що ПФ-5 (0,1ммоль/л) розслаблює аорту морської свинки на фоні норадреналінової (10мкмоль/л), ангіотензинової (1мкмоль/л) та гіперкалієвої деполяризації (KCl-90ммоль/л) у середньому на 10085.5±1492.45н/м2 n=15; p<0.001), 3756.52±966.74н/м2 (n=12; p<0.02) та 10122.76±1576.59н/м2 (n=11; p<0.002) відповідно, що в відсотках від вихідного рівня у середньому складало 28.39±3.1% (n=15; p<0.001), 24.12±2.4% (n=12; p<0.02) та 39.23±4.72% (n=11; p<0.001) відповідно (рис.4).

Таким чином, вазодилататорні ефекти ПФ-5, викликані активацією КАТФ каналів на фоні норадреналінової та ангіотензинової деполяризації (відповідно 28% і 24%) були значно меншими ніж його ефекти на фоні калієвої деполяризації - 39%. Отже, якщо самий потужний (39.23%), тобто максимальний при даних умовах експерименту, вазодилататорний ефект ПФ-5 прийняти за 100%, то розслаблення смужки на фоні норадреналінової та ангіотензинової деполяризації буде складати відповідно 72.37% і 61.48% від 100%, тобто, воно буде меньшим на 27.63% на фоні норадреналінової та на 38.52% на фоні ангіотензинової деполяризації відповідно. Ці дані можуть свідчити про те, що норадреналін та ще в більшій мірі ангіотензин ІІ можуть частково пригнічувати активність КАТФ каналів в аорті морської свинки, а саме на 27.63% перший та на 38.52% останній, а отже, можна вважати, що вони можуть реалізовувати свої ефекти не тільки за рахунок прямої вазоконстрикторної дії, а і як інгібітори вазодилататорних ефектів КАТФ каналів.

Відомо, що ангіотензин ІІ може відігравати суттєву роль в розвитку артеріальних гіпертензій (Марков Х.М., 1970), тому, нами було проведено порівняльне дослідження його впливу на активність судинних КАТФ каналів, активованих за допомогою нового фторвмісного активатора КАТФ каналів ПФ-5, в аорті гіпертензивних та нормотензивних щурів, що дало можливість визначити їх взаємовідносини в умовах артеріальної гіпертензії.

Проведено 8 серій експериментів - по 4 спарені серії на препаратах аорти гіпертензивних та нормотензивних тварин:

1 пари серій – дія ангіотензину ІІ (17 і 16 дослідів відповідно),

2 і 3 пари серій – ефекти ПФ-5 на фоні ангіотензинової (по 9 дослідів) та калієвої (28 і 32 досліда відповідно) деполяризації відповідно,

4 пара серій – дія ацетилхоліну (13 та 16 дослідів).

Виявлено, що, як і в дослідах на аорті морської свинки, в аорті щурів також відбувається пригнічення вазодилататорних ефектів ПФ-5 ангіотензином ІІ, (рис.6 (І, ІІ)). Так, в серії експериментів на препаратах аорти нормотензивних тварин, на фоні ангіотензинової (1мкмоль/л) вазоконстрикції розслаблення судинної смужки ПФ-5 (0,1ммоль/л) складало у середньому 48.65±1.44% (n=9; p<0.001) від вихідного рівня (рис.6 (І, 1)). Тоді як на фоні гіперкалієвої деполяризації розслаблення судинної смужки ПФ-5 (0,1ммоль/л) складало у середньому 81.135±1.27% (n=7; p<0.0001) від вихідного рівня (рис.6 (ІІ, 1)). Достовірність результатів вазодилататорних ефектів ПФ-5 на препаратах аорти нормотензивних тварин між серіями на фоні гіперкалієвої та ангіотензинової деполяризації складає: для даних в н/м2 PAT,KCl<0.0001; для даних в відсотках PAT,KCl<0.0001.

Рис.5 Залежність величини реакцій ізольованих Рис.6 Залежність величини ефектів ПФ-5 в

препаратів аорти від діючої концентрації ПФ-5 аорті нормотензивних та гіпертензивних щурів

на фоні К+-деполяризації; від типу попередньої вазоконстрикції;

1- нормотензивні щури; 1- контроль; 2- гіпертензивні тварини;

2- гіпертензивні щури; І- ангіотензин ІІ + ПФ-5;

*- Р<0.001; **- P<0.02 ІІ- гіперкалієвий розчин Кребса + ПФ-5;

ІІІ- гіперкалієвий розчин Кребса + ацетилхолін *- Р<0.001; **- P<0.02

Таким чином, на препаратах аорти нормотензивних щурів вазодилататорні ефекти активатора КАТФ каналів ПФ-5 на фоні ангіотензинової деполяризації, порівняно з вазодилататорними ефектами ПФ-5 на фоні калієвої деполяризації були меншими на 32.485%, а якщо максимальне в наших умовах (81.135%) розслаблення судинної смужки прийняти за 100%, то пригнічення активності КАТФ каналів ангіотензином ІІ складає 40.04±2.2% (n=9; p<0.001).

В серії експериментів на препаратах аорти спонтанно гіпертензивних тварин, на фоні ангіотензинової (1мкмоль/л) вазоконстрикції вазодилататорні ефекти ПФ-5 (0,1ммоль/л) складали у середньому 41.88±2.18% (n=9; p<0.001) від вихідного рівня (рис.6 (І, 2)), тоді як на фоні гіперкалієвої деполяризації вони складали у середньому 82.26±5.2% (n=7; p<0.001), (рис.6 (ІІ, 2)).

Достовірність результатів вазодилататорних ефектів ПФ-5 на препаратах аорти гіпертензивних щурів між серіями на фоні гіперкалієвої та ангіотензинової деполяризації складає: для даних в н/м2 PAT,KCl<0.0001; для даних в відсотках PAT,KCl<0.0001.

Таким чином, на препаратах аорти спонтанно гіпертензивних щурів вазодилататорні ефекти активатора КАТФ каналів ПФ-5 на фоні ангіотензинової деполяризації, порівняно з вазодилататорними ефектами ПФ-5 на фоні калієвої деполяризації були меншими на 40.38%, тобто також відбувалось часткове пригнічення активності КАТФ каналів ангіотензином ІІ, а саме, якщо максимальне в наших умовах (82.26%) розслаблення судинної смужки прийняти за 100%, то пригнічення активності КАТФ каналів ангіотензином ІІ в аорті спонтанно гіпертензивних щурів складало 49.09±1.83% (n=9; p<0.001).

Отже, пригнічення вазодилататорних ефектів ПФ-5 ангіотензином ІІ на препаратах аорти нормотензивних і спонтанно гіпертензивних щурів становило у середньому 40.04±2.2% та 49.09±1.83% відповідно (достовірність між ними складає p1,2<0.02), тобто, якщо 40,04 (контроль – нормотензивні щури) прийняти за 100%, то пригнічення вазодилататорних ефектів ПФ-5 при спонтанній гіпертензії посилювалось на 22.6% (p<0.005).

Слід зауважити, що судинні реакції у спонтанно гіпертензивних щурів були істотно зміненими. Так, ангіотензин ІІ (1мкмоль/л) збільшував напруження стінки аорти нормотензивних щурів від вихідного рівня у середньому на 8434.19±678.47н/м2 (n=16; p<0.0001), тоді як збільшення напруження стінки аорти спонтанно гіпертензивних щурів від вихідного рівня у середньому складала 11998.65±941.54н/м2 (n=17; p<0.0001).

Достовірність між ними складає p1,2<0.006.

Порівнюючи ці результати з вазоконстрикцією судинних смужок нормотензивних та гіпертензивних щурів, що викликалась калієвою деполяризацією (яка є практично незмінною в обох типах тварин), можем зазначити, що вазоконстрикторна дія ангіотензину ІІ у спонтанно гіпертензивних щурів, порівняно з такою у нормотензивних щурів, значно посилювалась.

В той же час, вазодилататорні реакції на ацетилхолін (1мкмоль/л) в аорті гіпертензивних щурів значно (в два рази) зменшувалися порівняно з реакціями на ацетилхолін у нормотензивних щурів. Так, на фоні гіперкалієвої деполяризації, ацетилхолін зменшував напруження судинних смужок перших у середньому на 6860.45±844.7н/м2 (n=13; p<0.001) та останніх у середньому на 13781.98±1496.9н/м2 (n=16; p<0.001), що в відсотках від вихідного рівня складало у середньому 32.5±3.48% (n=13; p<0.05) проти 62.28 ±2.9 % (n=16; p<0.01) відповідно (рис.6 (ІІІ)).

Достовірність між серіями складає p1,2<0.001.

Ці результати збігаються з уявленнями про порушення функції ендотеліюза умов спонтанної гіпертензії, що призводить до зменшення продукції оксидуазоту і відповідно до зменшення вазодилататорних реакцій в

відповідь на дію ацетилхоліну (Van de Voorde J, 1992).

Літературні дані що до функціонування КАТФ каналів в умовах артеріальної гіпертензії є досить протиречивими ѕ частина дослідників вважає, що їх активність зменшена (Sobey CG, 2001), і в той же час існують дані, що функціональна активність КАТФ каналів в умовах артеріальної гіпертензії залишається незмінною (Fujii K et al, 1992; Van de Voorde J, 1992; Hutri-Kahonen N et al, 1999) або навіть посилюється (Miyata N et al, 1990).

Для прояснення цих протеречивих даних нами було проведене порівняльне дослідження вазодилататорних ефектів ПФ-5 на фоні калієвої деполяризації в аорті нормотензивних і спонтанно гіпертензивних щурів.

Виявлено, що вони практично збігаються (рис.5, рис.6 (ІІ)).

Отже, отримані дані про те, що вазодилататорні ефекти ПФ-5 в дослідах in vitro на аорті спонтанно гіпертензивних щурів є не меншими за виявлені в аорті нормотензивних щурів можуть свідчити про те, що здатність КАТФ каналів до активування та вірогідно їх кількість за умов артеріальної гіпертензії практично не змінюється, що в свою чергу зумовлює можливість застосування їх активаторів у терапевтичних цілях.

Таким чином, беручи до уваги практично нормальне функціонування КАТФ каналів у судинах спонтанно гіпертензивних щурів (що витікає з практично однакових ефектів активатора КАТФ каналів ПФ-5 на препаратах нормотензивних та гіпертензивних тварин), та їх потужніше пригнічення ангіотензином ІІ, ми можем припустити, що підвищення судинного тонусу та внаслідок цього збільшення кров'яного тиску при спонтанній артеріальній гіпертензії відбувається не лише через погіршення дії такого важливого вазодилататора, як ацетилхолін (як результат можливого ураження судинного ендотеліального шару), але й за рахунок більшого інгібування КАТФ каналів таким вазоконстриктором, як ангіотензин ІІ і посиленням його вазоконстрикторної дії в спонтанно гіпертензивних тварин.

Разом з цим, досить інтенсивні реакції на активацію КАТФ каналів в аорті гіпертензивних щурів - вазодилататорна дія ПФ-5 (0.1ммоль/л) на фоні ангіотензинової вазоконстрикції складала у середньому 41.88% (рис.6(І, 2)) від вихідного рівня - дають нам підстави сподіватися на можливе використання активаторів цих каналів у клініці.

Вплив нових активаторів КАТФ каналів на функціонування серця в нормальних умовах та при створенні ішемії-реперфузії серця.

Першою частиною роботи було дослідження впливу фторвмісних активаторів КАТФ каналів, зокрема ПФ-10, на функціонування серця (тобто на його скоротливу функцію та перфузійний тиск в коронарних судинах), як контроль використовували левкромакалім.

Досліди були проведені на ізольованих, перфузованих при температурі 370С розчином Кребса-Хензелейта серцях самців морської свинки.

Виявлено, що при всіх досліджуємих концентраціях ПФ-10 (1мкмоль/л - 0.1ммоль/л) майже завжди спостерігалось підвищення тиску в латексному балончику, введенному в лівий шлуночок серця, що відображало посилення серцевих скорочень від вихідного рівня, тобто збільшення скоротливої активності міокарду. Проте, дозозалежної реакції не спостерігалось.

Досить несподіваним є характер ефектів нового фторвмісного активатора КАТФ каналів ПФ-10 на скоротливу активність міокарду в малих концентраціях. Якщо використання невеликих доз таких активаторів як кромакалім та бімакалім (оба 1мкмоль/л) в експериментах на ізольованому серці щура та кроля відповідно (Grover GJ, 1996; Eells JT et al, 2000) та левкромакаліму (1мкмоль/л) в наших експериментах мало незначний вплив на скоротливу активність міокарду (посилення не більше як на 5% або не спостерігалось змін взагалі), то при використанні аналогічних концентрацій (1мкмоль/л) ПФ-10 - збільшення скоротливої активності в деяких випадках було досить потужним – на 10% та більше від вихідного рівня (максимальне ефект – 15,1%).

Як вже було вище описано, ПФ-10 в концентраціях 1 - 10мкмоль/л дозозалежно зменшує перфузійнй тиск в коронарних судинах серця, а у випадках нестабільно працюючого серця, призводить до стабілізації його скорочувальної активності та зменшення екстрасистолії.

При дослідженні впливу нового фторвмісного активатора КАТФ каналів ПФ-10 на функціонування серця при моделюванні гострої ішемії-реперфузії ізольованого серця морської свинки було проведено 4 серії експериментів. Ізольовані серця у всіх групах піддавались 20хв-ішемії з наступною 40хв-реперфузією:

І серія – контроль;

в другій та третій серіях перед створенням 20хв-ішемії активували КАТФ канали, подаючи в перфузуючий розчин протягом 5хв активатори КАТФ каналів - ПФ-10 (10мкмоль/л) в ІІ серії та левкромакалім (1мкмоль/л) в ІІІ серії;

в ІV серії відтворювали кардіопротекторний феномен - ішемічне прекондиціювання - три 5-ти хвилинних періода ішемії, в інтервалах між якими відбувались 5-ти хвилинні реперфузії.

CРС ішемія реперфузія

І. ѕѕѕѕѕѕфѕѕѕѕѕѕфѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕф

20 хв 20 хв 40 хв

СРС ПФ-5 ішемія реперфузія

ІІ. ѕѕѕѕѕѕфѕѕфѕѕѕѕѕѕфѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕф

20 хв 5 хв 20 хв 40 хв

СРС левкр. ішемія реперфузія

ІІІ. ѕѕѕѕѕѕфѕѕфѕѕѕѕѕѕфѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕф

20 хв 5 хв 20 хв 40 хв

СРС ішем репф ішем репф ішем репф ішемія реперфузія

ІV. ѕѕѕфѕѕфѕѕфѕѕфѕѕфѕѕфѕѕфѕѕѕѕѕѕфѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕф

20 хв 5 хв 5 хв 5 хв 5 хв 5 хв 5 хв 20 хв 40 хв

де, СРС- період стабілізації роботи серця ішем – ішемія

левкр – левкромакалім репф – реперфузія

Виявлено, що передішемічне активування КАТФ каналів за допомогою ПФ-10 спричиняє кардіопротекторний ефект, подібний до ефектів відтвореного в експерименті ішемічного прекондиціювання та фармакологічного левкромакалім-викликаного прекондиціювання (таб.1).

Таблиця 1. Результати експериментів в дослідах з моделюванням ішемії-реперфузії ізольованого серця морської свинки.

Оцінка експерименту Умови експерименту

1.Контроль (n=9) 2. ПФ-10 (n=12) 3. Левкрома-калім (n=7) 4.Ішем. пре-кондиц. (n=7)

Час до повної зупинки серця з початку ішемії, хв. 2.975±0.15 2.55±0.29 P2,3<0.05 3.925±0.3 P1,3<0.05 2.45±0.73

Час до початку скорочень з початку реперфузії, сек. 69±21.14 14.82±0.8 P1,2<0.001; P2,3<0.001 22.75±1.89 P1,3<0.05 16.5±2.53 P1,4<0.05

Час відновлення до передішемічного рівня тиску лівого шлуночка, хв. 17.15±4.44 6.6±1.8 P1,2<0.05 6.84±1.82 P1,3<0.05 5.4±1.12 P1,4<0.05

Час відновлення до передішемічного рівня коронарного тиску, хв. 13.75±1.27 11.06±1.2 P2,3<0.05 7.125±0.52 P1,3<0.01 11±1.58 P3,4<0.05

Кількість екстрасистол за 1 хв. 23±1.22 4.11±1.03 P1,2<0.001; P2,3<0.005 12.5±2.75 P3,1<0.05; P3,4<0.05 5.33±1.45 P1,4<0.005

Так, якщо час до повної зупинки серця від початку тотальної ішемії міокарда відрізнявся від контролю в різних варіантах дослідів несуттєво, то час, потрібний для відновлення серцевих скорочень після тотальної ішемії з початку реперфузії відрізнявся досить сильно - в контрольних дослідах серце відновлювало роботу тільки через 69±21.14 (n=9; p<0.05) секунд від початку реперфузії серця, тоді як в серії з ПФ-10 менше ніж через 14.82±0.8 (n=12; p<0.01) секунди (що в 4.6 рази швидше ніж в контролі). Аналогічний позитивний ефект ПФ-10 на функцію серця спостерігався і при розрахунках інших показників діяльності серця. Так, час, потрібний для відновлення скоротливої активності лівого шлуночка до передішемічного рівня після тотальної ішемії серця з початку реперфузії в контрольних дослідах складав 17.15±4.44хв (n=9; p<0.05), а в серії з ПФ-10 всього 6.6±1.8хв (n=9; p<0.01).

Дещо коротшим було і відновлення до вихідного рівня коронарного перфузійного тиску після тривалої ішемії порівняно з контрольними дослідами.

Як свідчать дані таблиці 1, позитивні зміни показників діяльності серця, які відбувались в дослідах з ішемією-реперфузією під впливом попереднього введення активатора калієвих каналів ПФ-10, були практично ідентичні тим, які мали місце при ішемічному прекондиціюванні. Це може свідчити про подібний кардіопротекторний потенціал обох факторів, та можливо сходні механізми розвитку кардіопротекторної реакції. Деяким підтверженням цього положення є дані, про практично одинаковий позитивний вплив ПФ-10 та ішемічного прекондиціювання на кількість екстрасистол під час ішемії-реперфузії. Як свідчать дані таблиці, під впливом ПФ-10 кількість екстрасистол, порівняно з контролем, зменшувалась в 5.6 рази; при ішемічному прекондиціюванні в 4.3 рази.

Слід також зауважити, що в динаміці реперфузії саме ПФ-10 в найбільшій мірі впливав на тонус коронарних судин. Якщо в контрольних дослідах в перші 10хв реперфузії коронарний перфузійний тиск дещо збільшувався, то в серії дослідів з ПФ-10, в той же час реакції, мало місце суттєве розширення коронарних судин, в перші 5хв ѕ на 25.09±1.32% (n=12; p<0.001), на 10 хвилині майже на 9%.

Таким чином, представлені дані свідчать про те, що новий фторвмісний активатор КАТФ каналів ѕ ПФ-10 має виражені кардіопротекторні властивості: проявляє антиаритмічну дію та значно покращує функцію ішемізованого серця в період його реперфузії, практично повністю імітуючи кардіопротекторний феномен широко відомого ішемічного прекондиціювання.

Слід відмітити, що ці захисні ефекти нового активатора КАТФ каналів виявляються при певних дозах препарату. Вірогідно, що оптимальними дозами препарату слід вважати 1мкмоль/л-10мкмоль/л, коли виявляється дозозалежне розширення коронарних судин та збільшення скоротливої активності міокарду, але ще не проявляються проаритмічні якості препарату, а напроти, має місце антиаритмічний ефект. Отже, з метою корекції ішемічних та реперфузійних порушень діяльності серця дуже важливим питанням є вибір оптимальних доз активаторів КАТФ каналів. Справа в тому, що як виявилось в останні роки, позитивний чи негативний ефекти активаторів КАТФ каналів в великій мірі залежить від дози та від місця переважної дії активатора. Як було показано в наших дослідах, вже в дозах 0.1ммоль/л ПФ-10 може викликати поодинокі екстрасистоли, тоді як його коронародилататорний ефект дещо зменшувався; інший активатор КАТФ каналів - левкромакалім - ще в меньших дозах - 10мкмоль/л - призводив до інгібування скоротливої активності міокарду. Така сувора залежність позитивного і негативного ефектів від дози в значній мірі зв'язана з тим, на які структури та типи КАТФ каналів переважно діє даний активатор. КАТФ канали локалізуються як в судинній стінці, так і в кардіоміоцитах, як в сарколемі, так і в мітохондріях. З одного боку активація КАТФ каналів судинних гладеньком'язових клітин та ендотеліоцитів призводить до компенсаторного розширення коронарних судин і збільшення кровопостачання серця, з другого боку, активація КАТФ каналів кардіоміоцитів може призводити до різних по характеру ефектів в залежності від типу активуємого каналу. Якщо позитивний характер активації мітохондріальних КАТФ каналів начебто не викликає сумніву у більшості дослідників тому, що призводить до активації процесів дихання через електронтранспортний ланцюжок, збереження та запасання АТФ і зменшення Ca2+ перенавантаження (Bhatnagar A, Bolli R, 1999; GrossG.J, Fryer RM, 1999; Takashi En et al, 1999; GrossG.J, Fryer RM, 2000), то активація, особливо інтенсивна, сарколемальних КАТФ каналів може призводити до негативних наслідків в зв'язку з різким зменшенням тривалості потенціалу дії та рефрактерного періоду, що може закінчуватися порушеннями ритму і навіть фібріляцією шлуночків серця (Bhatnagar A, Bolli R, 1999). Отже, більшість авторів кардіопротекторні властивості приписують активуванню КАТФ каналів саме мітохондріального типу (Kevelaitis E et al, 1999).

Хоча для визначення питання до якого типу відносяться нові фторвмісні активатори КАТФ каналів ПФ-5 та ПФ-10 потрібні додаткові дослідження, опираючись на отримані нами експериментальні дані, вже зараз слід припустити, що вони, як і пінацидил можуть активувати як сарколемальні, так і мітохондріальні АТФ-залежні калієві канали.

Таким чином, виявлено, що нові фторвмісні сполуки – ПФ-5 та ПФ-10 є активаторами саме КАТФ каналів та проявляють добре виражені дозозалежні вазодилататорні властивості. Вперше показано, що норадреналін, та ще в більшій мірі ангіотензин ІІ частково пригнічують активність КАТФ каналів, а в умовах артеріальної гіпертензії пригнічуюча дія ангіотензину ІІ значно посилюється. В експериментах на ізольованому серці морської свинки, перфузованому по методу Лангендорфа, показано, що новий фторвмісний активатор КАТФ каналів ѕ ПФ-10 дозозалежно зменшує перфузійнй тиск в коронарних судинах серця, збільшує його скоротливу активність, має виражені кардіопротекторні властивості: він проявляє антиаритмічну дію та стабілізує скорочувальну діяльність міокарду при початково нестабільно працюючому серці, значно покращує функцію ішемізованого серця в період його реперфузії, практично повністю імітуючи кардіопротекторний феномен широко відомого ішемічного прекондиціювання.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено вплив нових вітчизняних фторвмісних активаторів калієвих каналів на функції серця та вазомоторні реакції в нормальних та патологічних умовах, що дозволило вивчити відносну ефективність різних активаторів КАТФ каналів, механізми їх взаємовідношення з різної природи вазоконстрикторними впливами, виявити їх кардіопротекторний вплив при гострій ішемії та реперфузії ішемізованого серця та окреслити спектр їх можливого використання в клініці.

2. За допомогою специфічного блокатора КАТФ каналів ѕ глібенкламіду показана ступінь інгібування вазодилататорних ефектів нових фторвмісних активаторів КАТФ каналів, порівняно з відомими активаторами (пінацидил).

3. В дослідах in vitro на ізольованих препаратах аорти морської свинки, гіпертензивних і нормотензивних щурів та ізольованому серці морської свинки, в дослідах in vivo на судинах кінцівок собаки показано, що нові активатори калієвих каналів мають добре виражені дозозалежні вазодилататорні властивості.

4. В дослідах на морських свинках та щурах вперше показано, що норадреналін та ще в більшій мірі ангіотензин ІІ зменшують вазодилататорні ефекти активаторів КАТФ каналів,