Академія медичних наук України

Інститут фармакології та токсикології

_________________________________________________________

Бєленічев Ігор Федорович

УДК 547.856.1:615.012.1.07

Дослідження антиоксидантних властивостей в ряду похідних п’яти- та шестичленних азАгетероциклів і визначення їх ефективності при ішемії головного мозку

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі нормальної фізіології Запорізького державного медичного університету

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України ДУНАЄВ ВІКТОР Володимирович, Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Громов Леонід Олександрович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділом нейрофармакології

доктор медичних наук, професор Кульчицький ОЛег константинович, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії регуляціх метаболізму

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України лукянчук Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ України

Захист відбудеться “ 18_” _червня__ 2003 року о _13__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потє, 14.

Автореферат розісланий “_10__” _ травня_ __2003 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Захворювання, патологічну основу яких складає ішемічне "пошкодження" тканин головного мозку – одна з найбільш актуальних проблем сучасної медицини. Широке розповсюдження, високий рівень захворюваності, смертності та інвалідизації населення промисловорозвинутих країн диктує необхідність вдосконалення засобів профілактики та лікування даного виду патології [Н.В. Верещагин, Т.С. Гулевская, Ю.К. Миловидов, 1987; J. Nuglich, J. Krieglstein, 1989; Д. Кригер, 1998; Y. Brown, L. Magargal, 1998; О.Ю. Дубініна, 2002; А. Ярош, 2002].

Відповідно до сучасних уявлень про патогенез гострих порушень мозкового кровообігу, однією з його найважливіших ланок є порушення метаболізму тканин головного мозку, що сприяє утворенню активних форм кисню та подальшому розвитку вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ВРПО). Цей факт логічно передбачає застосування антиоксидантів в комплексній терапії захворювань, пов'язаних з ішемією головного мозку. Останнім часом широке застосування знаходять антиоксидантні засоби – дибунол, –токоферол [М.В. Биленко, 1989; И.М. Весельский, А.В. Сонник, 1997; С.В. Царенко, 1998; В.Д. Лукьянчук, 1999; L. Spaggiari et al., 1999; F. Aberget et al, 1999; Yamamoto Atsuko, Ishahara Kazuo, 2001; И.В. Полевик, 1999]. Однак виявлений у них ряд побічних ефектів і невисока ефективність обмежують їх застосування в практичній медицині.

На сьогодні простежується перспективність створення речовин, що взаємодіють не лише з ліпідними радикалами, тобто істинних антиоксидантів, але й речовин – інгібіторів активних форм кисню. Другим, не менш важливим напрямком у створенні антиоксидантних засобів, є пошук речовин, які реактивують систему антиоксидантних ферментів та інгібують основні шляхи утворення активних форм кисню.

В цьому плані особливу увагу привертають речовини – похідні 1,2,4-триазолу і хіназоліну, що мають високу протимікробну, протигрибкову, противірусну, анальгетичну, нейролептичну, антигістамінну, бронхолітичну, гепатопротективну активність [Gyryn R., 1989; Zhou Hong et al, 1998; S. Jantovo et al, 2000, R. Montgomery, 2002].

Дослідженнями співробітників Запорізького державного медичного університету і Національного фармацевтичного університету встановлено, що похідні 5-тіо-1,2,4-триазолу, 4-аміно-1,2,4-триазолу і 4-аміно-, 4-оксохіназо-лінів впливають на обмінні процеси в організмі, проявляючи анаболічну, ростостимулюючу, ранозагоюючу, антигіпоксичну активність [Е.Г. Кныш, 1987; В.Р. Стец и соавт., 1985-1998; Р.С. Синяк, 1991; И.А. Мазур и соавт., 1985-1999; Т.Ф. Сарбаш, 1992; С.М. Дроговоз и соавт., 1993]. Повідомлялось про наявність у речовин даного класу антиоксидантних властивостей [С.М. Дроговоз и соавт., 1988; Р.С. Синяк и соавт., 1988; В.В. Дунаев и соавт., 1987].

Проте механізм їх антиоксидантної дії не вивчений. Не проведені порівняльні дослідження "структура-дія" в ряду похідних 1,2,4-триазолу та хіназоліну. В літературі відсутні дані про антиоксидантну та протиішемічну активність S- і N-заміщених 1,2,4-триазолу та 4-аміно-, 4-оксохіназоліну. Вищезазначене обумовлює перспективність пошуку речовин з антиоксидантною активністю з метою створення на їх основі лікарських препаратів в ряду 1,2,4-триазолу і хіназоліну.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Запорізького державного медичного університету за Програмою “Синтез новых функциональных замещенных пяти-, шестичленных моно- и аннелированных азагетероциклических систем и их биологическая активность” (№ державної реєстрації № 0196 U 13916, шифр ІН 15.00.05.96), “Експериментально-клінічне дослідження механізмів системи детоксикації організму і шляхів підвищення її активності” (№ 1964 002256, шифр 1Н 14.02.03.96).

Мета і завдання дослідження. Дослідження антиоксидантних властивостей в ряду похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну з наступною оцінкою їх протиішемічної дії на різних моделях експериментального порушення мозкового кровообігу, виявлення закономірності "структура-дія", створення на основі найбільш ефективних сполук нового лікарського препарату.

Відповідно до поставленої мети були визначені наступні задачі:

1. Вивчити можливі шляхи активації та інтенсивності ВРПО, його роль в патогенезі ішемії головного мозку і обґрунтувати вибір експериментальних моделей ГПМК.

2. Вивчити антиоксидантну активність в ряду похідних 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислот, їх солей, ефірів, гідразидів, 1-алкіл-(карбоксалкіл)-4-бензиліденаміно-1,2,4-триазолія бромідів, 1-алкіл-1,2,4-триазоліл-5-тіонів, 3-алкіл-1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислот, 3-алкіл-1,2,4-триазоліл-5-тіоалканів, а також в ряду похідних 4(3Н)-хіназолону, 6-нітро-4(3Н)-хіназолону та 4-амінохіназоліну в дослідах in vitro в умовах ферментативного та неферментативного ініціювання перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) і по інгібіюванню супероксидрадикалу.

3. На підставі отриманих результатів провести аналіз закономірності "структура-дія" і обґрунтувати подальше вивчення антиоксидантної активності для найбільш перспективних сполук.

4. Вивчити антиоксидантну та протиішемічну активність перспективних сполук на моделях експериментального порушення мозкового кровообігу.

5. Провести оцінку антиоксидантного та протиішемічного ефекту похідних 1,2,4-триазолу та хіназоліну у період гострої ішемії-реперфузії головного мозку.

6. Провести оцінку ефективності інфузійного застосування деяких сполук похідних 1,2,4-триазолу (2 сполуки) та хіназоліну (2 сполуки) з високою антиоксидантною активністю на моделі ГПМК.

7. На основі результатів проведених досліджень розробити комбінований препарат ноотропної та церебропротективної дії, провести його доклінічні випробування.

Обєкт дослідження. Стан про- та антиоксидантної системи, процесів біоенергетики головного мозку експериментальних тварин (щурів, собак) за умов моделювання ішемії головного мозку.

Предмет дослідження. Антиоксидантні та протиішемічні властивості азагетероциклічних сполук – похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну, ноотропні та церебропротективні властивості таблеток "Ноотрил".

Методи дослідження. Фармакологічні, фармакокінетичні, токсикологічні, біохімічні (ензиматичні, спектрофотометричні, хроматоспектрофотометричні), морфологічні, електрофізіологічні, біофізичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі експериментально обґрунтована доцільність вибору моделей ішемії головного мозку, викликаних одно- та двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій і введенням аутокрові у внутрішню капсулу головного мозку, а також способів ініціювання ВРПО in vitro для оцінки антиоксидантної і протиішемічної дії синтезованих сполук.

Одержано дані про антиоксидантну активність 120 сполук – похідних 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислот, 3-пропіл-1,2,4-триазоліл-5-тіонів, 1-алкіл-(карбоксалкіл)-4-бензиліденаміно-1,2,4-триазолія броміду, 1-алкіл-1,2,4-триазолія-5-тіонів і 4-(3Н)-хіназолону, 6-нітро-4-(3Н)-хіназолону та 4-амінохіназоліну при ферментативному і неферментативному ініціюванні ВРПО і по інгібіюванню супероксидрадикалу в дослідах in vitro.

Встановлено, що антиоксидантна активність досліджуваних сполук проявляється також в умовах ішемії головного мозку.

Виявлено деякі закономірності "структура-дія" в ряду похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну, визначені основні структурні фрагменти молекул, що визначають наявність і силу антиоксидантної активності.

У результаті дослідження виявлені сполуки, що перевищують по силі дії препарати порівняння (-токоферол, метіонін, унітіол, дибунол і сечовина).

Вперше одержано дані про механізм антиоксидантної дії похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну. Встановлено, що в механізмі антиоксидантної дії досліджуваних сполук лежить їх здатність попереджати ініціювання супероксидрадикалу шляхом відновлення основних ланок енергетичного обміну і підвищувати активність ферментів антиоксидантного захисту (СОД, каталаза, ГПР, ГР), а також власний антирадикальний ефект. Виявлено, що антиоксидантна активність даних похідних корелює з їх протиішемічною дією.

Показано, що похідні 1,2,4-триазолу і хіназоліну проявляють високу антиоксидантну активність та виражений протиішемічний ефект у період гострої ішемії і реперфузії головного мозку при їх інтракаротидному введенні.

Встановлено, що інтракаротидне введення антиоксидантів похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну в складі інфузійних сольових розчинів підсилює ефективність експериментальної протиішемічної терапії. Комбінування тіотриазоліну з пірацетамом і натрію сукцинатом у складі сольового розчину підвищує протиішемічну дію інтракаротидної інфузії в умовах експериментального ГПМК.

Вперше показано, що помірна оксигенація інфузійних розчинів, які містять антиоксиданти, потенціює їх фармакологічні ефекти в умовах ішемії головного мозку.

Одержало подальший розвиток уявлення про взаємопотенціюючу дію пірацетаму і тіотриазоліну, що полягає у високої протиішемічній активності створеного на їх основі препарату "Ноотрил". Введення ноотрилу щурам із ГПМК сприяє підвищенню виживаності тварин, відновленню енергообміну, зниженню активності ВРО як у гострий, так і відновний період експериментальних інсультів.

Вперше отримані дані про ноотропну дію ноотрилу, що полягає в зменшенні явищ ретроградної та антероградної амнезії і поліпшенні показників короткочасної і довгострокової пам'яті.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено раціональний підхід до методів оцінки антиоксидантних властивостей біологічно активних речовин синтетичного походження у дослідах in vitro. Запропоновано методи оцінки АОА хімічних сполук у дослідах in vitro при ферментативному, неферментативному ініціюванні ВРО та по інгібіюванню супероксидрадикалу.

Обґрунтована можливість застосування антиоксидантів похідних 1,2,4-триазолу та хіназоліну в составі інфузійних розчинів для фармакологічної корекції патобіохімічних процесів при ішемічних та реперфузійних пошкодженнях органів.

Виявлено, що оксигенація інфузійних розчинів підсилює фармакологічну дію антиоксидантів, що входять до їх складу, за рахунок активації в ішемізованих тканинах мозку процесів біоенергетики та антиоксидантної системи.

Наукова новизна роботи підтверджена 3 патентами України та Російської Федерації. Матеріали дисертації використані в підготовці методичних рекомендацій.

Результати дисертаційної роботи використовуються у науковій роботі та навчальному процесі кафедр фармакології Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького, Національного фармацевтичного університету, Дніпропетровської дердавної медичної академії, Запорізького державного медичного університету.

Проведено перший розширений етап клінічного дослідження таблеток “Ноотрил” в якості ноотропного засобу (протокол № 3 від 27.03.2003 р., ДФЦ МОЗ України).

Особистий внесок здобувача. Дисертантом розроблений підхід до методів оцінки антиоксидантної активності біологічно активних сполук з використанням різноманітних способів ініціювання ВРО. Дисертантом розроблено програму, визначено мету та задачі досліджень, методичні підходи.

Дисертантом безпосередньо відтворені моделі ішемічного та геморагічного інсульту, гострої ниркової гіпертензії, емоційно-больового стресу. Проведено пошук речовин з антиоксидантною активністю серед 120 сполук похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну в дослідах in vitro на трьох моделях ініціювання ВРО. Розроблені інфузійні розчини з антиоксидантами, їх інтракаротидне застосування, режим оксигенування при експериментальній ішемії головного мозку. Самостійно проведені дослідження антиоксидантної і протиішемічної активності похідних 1,2,4-триазолу та хіназоліну, вивчені показники вуглеводньо-енергетичного обміну, антиоксидантної системи, вільно-радикального окиснення при моделюванні ішемічної патології. Творчий внесок дисертанта в розробку препарату "Ноотрил" складає 70%, у розробку всіх інших винаходів, опублікованих у співавторстві – не менше 65%.

Аналіз і узагальнення матеріалу, формування комп'ютерної бази даних, статистична обробка результатів експериментів, підготовка оглядових та оригінальних статей, формулювання висновків, оформлення дисертаційної роботи та автореферату виконано дисертантом самостійно.

Проведення морфологічних досліджень зразків тканин мозку експериментальних тварин виконано за участю проф. М.А.Волошина і В.О.Туманського, хірургічних операцій на собаках за участю проф. В.М.Кліменка, д.мед.н. В.О.Дмитрякова.

Апробація роботи. Основні фрагменти результатів дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на Международной конференции "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (г. С.-Петербург, 1992), Всеукраинском симпозиуме с международным участием "Биохимия стресса и пути повышения эффективности лечения заболеваний стрессорной природы" (г. Запорожье, 1992), Научно-практической конференции "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (г. Полтава, 1993), I Конгресі світової федерації українських фармацевтичних товариств (м. Львів, 1994), II Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (м.Київ, 1994), конференції “Пикамилон в современной неврологической и психиатрической практике (г Москва, 1994), XIV з’їзді фізіологів України (м. Київ, 1994), I національному з’їзді фармакологів України (м. Полтава, 1995), ), I міжнародному конгресу з інтенгративної антропології (м. Тернопіль, 1995), науково-практичній конференції “Научные достижения и проблемы производства лекарственных средств” (м. Харків, 1995), Міжнародній науково-практичній конференції (м.Харків, 1995), науково-практичній конференції “Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки і практики" (м. Запоріжжя, 1995), XV з’їзді фізіологів України (м. Донецьк, 1998), V національному з’їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи розвитку в новому тисячолітті” (м. Харків, 1999), Міжнародній конференції "Хімія азотовмісних гетероциклів" (Харків, 2000), Республіканській науковій конференції "Научные направления в создании лекарственных средств в фармацевтическом секторе Украины" (Харків, 2000), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Вчені України – вітчизняній фармації" (Харків, 2000), III Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2000), XIX Українській конференції з органічної хімії (Львів, 2001), IV з'їзді гематологів та трансфузіологів України (Київ, 2001), конференції "Механізми фізіологічних функцій в експерименті та клініці" (Львів, 2001), II Національному з'їзді фармакологів України "Фармакологія 2001 – крок у майбутнє" (Дніпропетровськ, 2001), науково-практичній конференції "Тіотриазолін – підсумки та перспективи використання в медицині" (Запоріжжя, 2002), XVI з'їзді фізіологів України (Вінниця, 2002).

Повнота опублікування основних положень дисертації. За матеріалами дисертації опубліковано 34 роботи, які в повній мірі відображають її зміст, із них 30 статей, в тому числі 7 одноосібних, 3 патенти України та Російської Федерації, методичні рекомендації.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 314 сторінках друкарського тексту, містить 78 таблиць та 14 рисунків, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, п'яти розділів власних досліджень, обговорення одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури, який містить 469 джерел (326 кирилицею та 143 латиницею).

Основний зміст роботи

Матеріали i методи дослідження. Дослідження виконувалися у два етапи: досліди in vitro i в умовах цілісного організму. У роботі використовувалися три групи методів оцінки антиоксидантної активності (АОА) in vitro, які відрізняються по механізму ініціювання вільнорадикального окислювання (ВРО):

·

·

·

Ферментативне моделювання ВРО проводили шляхом додавання надлишку НАДФН+ у гомогенат тканини мозку білих щурів (D.І. Al-Timimi, T. І. Dormandy, 1977, Ю.І. Губський та співавт., 2001).

Неферментативне ініціювання ВРО моделювали у суспензії яєчних ліпопротеідів шляхом додавання FeSО4 (Г.И. Клебанов і співавт, 1988; Ю.І. Губський і співавт., 2001). AOA в даних методах оцінювали по гальмуванню утворення кінцевого продукту ВРО – малонового діальдегіду (МДА).

Індукцію супероксидрадикалу моделювали при аутоокисненні адреналіну в адренохром у лужному середовищі (Hara P. Misra, 1972; І. Fridovich, 1987; Ю.І. Губський і співавт., 2001). AOA оцінювали по ступеню гальмування утворення адренохрому. Досліджувані речовини додавали в системи до ініціювання ВРО в кількості кратних до їх молекулярних масам.

Друга частина дослідження виконана на 1815 білих щурах лінії Вістар масою 220-260 грамів, 500 білих мишах масою 15-20 грамів, 50 безпородних собаках масою 10-20 кг та 12 кролях масою 2,0 кг. Тварини обох статей утримувались на стандартному раціоні харчування.

Експериментальні дослідження проводилися з використанням загальноприйнятих моделей експериментального порушення мозкового кровообігу: одно - та двобічної перев'язки загальної сонної артерії i введення аутокрові, взятої із хвостової вени щурів, до ділянки внутрішньої капсули згідно координатам стереотаксичного атласу [Б.А. Насибулин, 1982; И.В. Буров и соавт., 1987; Б.Б. Иринханов и соавт., 1989]. Операції проводилися під нембуталовим наркозом 40 мг/кг для щурів i 4,0 мг/кг для собак.

3 метою вивчення механізмів біохімічної дезадаптації тканин головного мозку моделювалися стани, які провокували його ішемічне пошкодження (фактори ризику):

·

·

·

Тварини виводились з експерименту в ранковий час під нембуталовим наркозом (40 мг/кг для щурів, 30,0 мг/кг для собак). Після досягнення глибокого наркозу розтиналась передня стінка живота і черевна порожнина, і після введення голки в район біфуркації аорти проводився забір крові. У тварин з експериментальною ішемію головного мозку швидко розкривалась черепна коробка, після чого видаляли ішемізовану півкулю і заморожували в рідкому азоті.

Для біохімічних досліджень тканини гемогенізувалися в сольовому ізотонічному розчині (0,15 М KCl) при охолодженні (до +4С) за допомогою скляного гемогенізатора в співвідношенні 1:40. Після виділення ядер i незруйнованих клітин (1000g), методом диференційного центрофугування (15000g), виділялася цитозольна фракція [М.И. Прохорова, 1982].

Екстракцію ліпідів проводили методом Кейтса [Р. Кейтс, 1974]. Безбілковий екстракт одержували додаванням точної наважки гомогенату тканини в хлорну кислоту (0,6 М), з наступною нейтралізацією 5,0 М К2СО3 [М.И. Прохорова, 1982].

Інтенсивність вільнорадикального окислювання оцінювалася по накопиченню в тканинах початкових, проміжних i кінцевих продуктів цього процесу: дієнових кон'югатів (ДК) неетерифікованих аліфатичних кислот [В.С. Коган, 1986], триєнкетонів (ТК) [М.В. Биленко, 1989], малонового діальдегіда (МДА) [Л.И. Андреева и соавт., 1988].

Стан антиоксидантної системи організму оцінювався по активності супероксиддисмутази (СОД) [С. Чевари, 1986], каталази [М.А. Королюк и соавт., 1988], глутатіонредуктази (ГПР) [М.И. Прохорова, 1982], глутатіонпероксидази (ГР) [А.Р. Гаврилова и соавт., 1986], а також по рівню -токоферолу [J. Elmadfa, 1989].

Стан вуглеводньо-енергетичного обміну i циклу Кребса визначався по рівню глюкози [R. Keilin, G. Hartree у модиф. Э.М. Тупиковой, 1982], аденілових нуклеотидів [Н.Б. Захарова, Н.В. Рубин, 1980], лактату [H.Y. Hohorst, 1970], пірувату [R. Yor, W. Danprecht, 1970], малату [H.Y. Hohorst, 1970].

У якості біохімічного критерію ішемічного пошкодження тканин головного мозку використовувався рівень цереброспецифічного ізоензиму креатинфосфокінази (ВВ-КФК), який виділяли з сироватки крові методом колоночної хроматографії на ДЕАЕ-сефадексі A-50 [Г.А. Яровая и соавт., 1982].

Отримані результати досліджень оброблялись статистичним методом досліджень з використанням t-критерію Ст'юдента. Всі розрахунки проводили за спеціально розробленими програмами на ПЕОМ.

Дослідження кислотно-лужного стану крові проводилося на мікроаналізаторі ОР 210/3 (Угорщина), в основі якого покладено мікрометод Аступа з використанням принципу Зіггард-Андерсена [Ю.К. Агапов, 1978].

Амінокислотний аналіз спиртових екстрактів з замороженої в рідкому азоті тканини головного мозку (вільні амінокислоти) i її гідролізату здійснювався на аналізаторі типу ААА 991 (Чехія) у біохімічній лабораторії ЦНДІМЄЖ – (м.3апоріжжя).

Для визначення кількості мікроелементів точну наважку тканини обробляли за методом Стаса-Отто i визначали мікроелементи на атомно-емісіоному спектрометрі IV 38 Plus (Франція) у лабораторії заводу “Весна” (м. Зaпоpiжжя).

Для визначення пульсового кровонаповнення щурам вживляли електроди в зони досліджуваних ділянок згідно з загальноприйнятою методикою за допомогою стереотаксичного приладу. Реєстрація реограми відбувалась на 4-х канальному електроенцефалографі ЕГП-4-02. Про пульсове кровонаповнення в дослідній ділянці головного мозку робили висновок по співвідношенню величини реографічної (Pi) хвилі до величини калібровочного сигналу [М.М. Ковальов, 1979].

Морфологічні дослідження проводили на зрізах головного мозку, які забирали в області сенсомоторної кори лівої півкулі. Зрізи робили тотально через усю півкулю для дослідження стану базальних ядер, бічних шлуночків і судинного сплетіння. Зрізи фарбували гематоксилін-еозином і проглядали на мікроскопі "Zetopan" [О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий, 1982].

Для оцінки антиамнестичної дії використовували методику умовної реакції пасивного уникання (УРПУ) з застосуванням електрошоку або скополаміну в якості амнезуючого фактору [J. Bures, O. Buresova, 1967]. Вплив препаратів на орієнтовно-дослідницьку поведінку і рухову активність досліджували у відкритому полі [Д. Дьюсбери, 1981].

Для оцінки ноотропної дії препаратів використовувалися навчання в радіальному лабіринті з позитивним (харчовим) підкріпленням по наступним показникам: кількість повторних помилкових заходів у підкріплювані рукава (короткочасна пам'ять) і кількість послідовних заходів у підкріплювані рукава (довготривала пам'ять) [Д. Дьюсбери, 1981].

Вивчення фармакокінетики і біодоступності визначали відповідно до загальноприйнятих методів [В.Н. Соловьев, А.А. Фирсов, В.А. Филов, 1980].

Результати та їх обговорення.

1. Дослідження активації вільнорадикально-перекисного окислення ліпідів при гострому порушенні мозкового кровообігу

Моделювання експериментального гострого порушення мозкового кровообігу (ГПМК), викликаного однобічною перев'язкою загальної coнної артерії i введенням аутокрові в ділянку внутрішньої капсули, викликало істотні зміни гемодинаміки i кисневого режиму мозкової тканини. Дані реоенцефалографії свідчили про те, що при обох видах патології кровонаповнення у досліджуваних відділах головного мозку, має тенденцію до зниження. Найбільш достовірно цi зміни спостерігалися на 1-5 дні досліду в руховому центрі кори мозку. Зменшення пульсового кровонаповнення супроводжується вираженим заниженням показників напруження кисню, швидкості насичення й утилізації його тканинами головного мозку [М.М. Боголепов, 1983].

Зниження надходження кисню супроводжується значними змінами метаболізму тканин головного мозку при обох видах патології. Так, на 4 добу активізувалися реакції анаеробного гліколізу, що призводило до накопичення недоокислених продуктів, зниження депонованих у клітинах енергетичних субстратів (глюкоза, глікоген).

Збільшення рівня лактату, зниження кількості пірувату i малату свідчило про порушення ланцюга дихання на початковій НАД-залежній ділянці i роз'єднання окислювального фосфорилювання, що в кінцевому результаті супроводжувалося зменшенням утворення АТФ.

Виявлений енергодефіцит є причиною виникаючого в організмі метаболічного ацидозу. Так, на 4 добу екперименту було виявлено достовірне зниження рН i дефіцит сумарної буферної ємності крові у щурів з експериментальним ГПМК. Подібні зміни призводять до активації фосфоліпаз, інгібування антиоксидантних ферментів та утворення активних форм кисню (АФК) в реакціях Фентона i Габера-Вейса [І. Frіdovich, 1982; М.В.Биленко, 1988; R. McCord, 1989; В.В. Зинчук, 1999].

Проведені дослідження показали переважну однонаправленість у динаміці змін антиоксидантних ферментів як при однобічній перев'язці загальної сонної артерії, так i при введенні аутокрові в ділянку внутрішньої капсули.

Так, одержані дані свідчать про те, що ішемія тканин головного мозку супроводжується зниженням активності антиоксидантних ферментів, причому, насамперед падає активність СОД i каталази, потім – ГПР i ГР. Ці спостереження дозволяють висунути припущення про те, що зниження активності АО-ферментів, особливо СОД, є основною причиною активації ВРО в умовах О2-дефіциту.

Активність таких ферментів як ГПР і ГР, прямо залежить від концентрації глутатіону. Зменшення активності цих ферментів на 4 добу експерименту пов'язане зі зниженням рівня глутатіону i загального пула тіолів, що підтверджується мінімальним рівнем тіовмістних вільних амінокислот (цистеїн, метионін) у тканинах головного мозку на 4 добу експерименту. Зниження в ішемізованій тканині головного мозку ?-токоферолу, очевидно, пов'язане з двома причинами: зменшенням доставки внаслідок порушення кровотоку та "витратою" у реакціях ВРО [J. Raloff, 1992].

Таким чином, перев'язка загальної coннoї aртерії i введення аутокрові викликають адекватне ішемічним пошкодженням пригнічення функціональних антиоксидантних систем з максимальним проявленням на 1-4 добу експерименту.

Активне протікання в головному мозку процесів ВРО, очевидно, обумовлене високим вмістом у ньому фосфоліпідів, олеїнової кислоти i плазміногенів, високим співвідношенням ліпіди/білки, малою кількістю -токоферолу [J. Echart, 1987; J. Naglich, 1989].

Максимальне накопичення продуктів ВРО (ДК, ТК i МДА) в тканинах головного мозку спостерігалося на 4 добу експерименту при відтворенні на двох моделях ГПМК. Нормалізація цих показників реєструвалася на 7 добу, i, головним чином, на 15 добу.

Причиною активації ВРО при експериментальному ГПМК є не тільки порушення основних ланок метаболізму i пригнічення функціональних систем антиоксидантного захисту, але і дисбаланс металів змінної валентності в тканинах головного мозку. Так, на 4 добу експерименту спостерігалося збільшення рівня Fe, Си та Мn, які є прооксидантами i беруть участь у всіх системах утворення АФК в реакціях Фентона i Габера-Вейса [М.В.Биленко, 1989].

Вивчення активації ВРО при моделюванні короткочасної (30 хв.) ішемії-реперфузії головного мозку показало, що ця патологія викликає ініціювання вільно-радикальних процесів та підвищує у тканинах мозку рівень ДК, ТК і МДА.

Ведучим проявом тяжких реперфузійних порушень у тканинах головного мозку є феномен невідновлення кровотоку (no-reflow) [В.Н.Клименко, 1992]. Продукти ВРО проявляють біотоксичну дію, що обумовлює їх взаємодію з аміногрупами білків, фосфоліпідів, ДНК, РНК з утворенням міжліпідних, міжбілкових i ліпід-білкових “поперечних зшивок” [А.И. Арчаков, 1972; Л.А. Тиунов, 1995; R. Zwiker, 1998].

Поява в ліпофільній частині ліпідного шару клітинних мембран гідрофільних перекисних груп розрихлює їx i робить наявні там білкові компоненти доступними для протеолітичних ферментів [F. Block, A. Tondar, W. Schmidt, 1997]. Порушення цілісності клітинних мембран призводило до збільшення активності ВВ-КФК, що фіксувалося в сироватці крові експериментальних тварин.

Порушення загальної гістоструктури головного мозку на 3-5 добу ГПМК характеризувалося різко вираженим периваскулярним, перицелюлярним, апікально-дендритним набряком, значним кровонаповненням судин мозку, накопиченням крові під м'якою мозковою оболонкою та зменшенням об'єму i деформації пірамідних нейронів, що свідчило про виражену ішемічну патологію тканин головного мозку [Б.А. Насибулин, 1982].

Таким чином, oднобічна перев'язка загальної сонної артерії або введення аутокрові у внутрішню капсулу відтворює активацію ВРО адекватно клінічним проявам ГПМК, що дозволяє використовувати дані моделі для оцінки антиоксидантної i протиішемічної активності сполук i вивчення механізму їх дії.

2. Пошук речовин з антиоксидантною активністю серед похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну

Дослідження похідних 1,2,4-тріазолу на двох моделях ініціювання ВРО i по інгібуванню супероксидрадикала показало, що незаміщений 1,2,4-триазол проявляв помірну АОА. Введення до 3 і 5 положення замісників приводить в більшості випадків до посилення АОА. Так, дослідження 21 похідного 3-метил-1,2,4-триазоліл-5--тіокарбонових кислот (1.1-1.20) на моделі ферментативного ініціювання ВРО показало наявність такої в 19 сполуках, причому 5 речовин за силою ефекту перевершували метіонін i унітіол. Виражену АОА 3-метил-1,2,4-триазоліл-5--тіокарбонові кислоти та їх похідні також проявляють при неферментативному ініціюванні ВРО (17 сполук перевищують активність дибунолу i -токоферолу). Зазначені похідні гальмують утворення супероксидрадикала при окисленні адреналіну, причому 8 із 21 сполуки за силою ефекту перевершують сечовину.

Необхідно відмітити, що антиоксидантний ефект залежить від характеру замісника в положенні 5, так найбільшої уваги заслуговують сполуки із залишком тіоетанової та тіобутанової кислот. Крім того, виявлено, що АОА посилюється в ряду: кислоти-солі-ефіри-гідразиди. У цьому ряду заслуговують на увагу сполуки 1.1, 1.2, 1.5-1.9, 1.11, 1.14, 1.15, 1.18.

Подовження алкільного ланцюга у положенні 3 (пропільний замість метильного) приводить до різкого зниження АОА (1.21-1.25). Заміна у положенні 5 карбоксалкільного замісника на алкільний (1.26-1.33) не призводить до посилення АОА. Так, 3-пропіл-1,2,4-триазоліл-5-тіоалкани (13 сполук) проявляють низьку активність, яка не перевищує еталонну, на вcix моделях ініціювання ВРО.

Введення замісника в положення 1 та 4, тобто одержання відповідних бромідів 1-алкіл-4-аміно-(іліденаміно)-1,2,4-триазолія (2.13-2.23) приводить до посилення АОА. Так, при ферментативному ініціюванні ВРО з 11 сполук 9 сполук проявляють високу АОА (8 сполук перевищують еталон порівняння). На моделі неферментального ініціювання ВРО 9 сполук також проявляють АОА, із них 6 сполук перевершують дію дибунолу i ?-токоферолу. При модельному ініціюванні супероксидрадикалу АОА виявлена в 9 сполук (6 сполук перевищують еталонну). АОА у цьому ряді похідних (2.13-2.23) залежить від довжини алкілького ланцюга, оптимальна їx кількість 7 або 9, а при зменшенні довжини спостерігається зниження АОА. Крім того, на силу антиоксидантного ефекту суттєво впливає замісник в положенні 4; найбільшу АОА проявляють сполуки, які мають п-метокси(диметиламіно)-бензиліденовий замісник.

Одержання галогенідів 1-карбоксалкіл-4-бензиліденаміно-1,2,4-триазолів (2.1-2.12) призводить до деякого зниження АОА при НАДФН-залежному ВРО. Так, з 14 сполук 5 перевищують активність унітіолу i метіоніну. Здатність гальмувати пероксидацію ліпопротеїдів характерно для 10 сполук, активність яких вища активності дібунолу i ?-токоферолу. З 14 сполук цього ряду 10 інгібують утворення супероксидрадикалу, перевищуючи за силою ефекту сечовину.

Відзначено, що АОА у цьому ряді сполук (2.1-2.12) залежить як від характеру замісника не тільки у положенні 4, а і у положенні 1. Так, найбільший ефект проявляють сполуки, які мають в положенні 4 п-метокси(диметил-аміно)-бензиліденовий, а в положенні 1 карбоксетильний або карбокспропільний замісники.

Про високу ефективність похідних галогенідів 1-алкіл(карбоксалкіл)-4-бензиліденаміно-1,2,4-триазолія (2.1-2.23) свідчить те, що вони гальмують процеси ВРО in vitro у концентраціях у 2 рази менших, ніж похідні 3-метил-1,2,4-триазолів-5-?-тіокарбонових кислот (1.1-1.20) i у 10 разів менших, ніж еталонні препарати. У цьому ряду сполук заслуговують на увагу речовини 2.2, 2.4, 2.5, 2.8, 2.12, 2.15, 2.16, 2.17, 2.19.

Дослідження АОА 19 сполук – похідних 3-метил-1,2,4-триазолія-4-аміно-(бензиліденаміно)-5-тіонів (тіоалканів) виявлено наявність її в 17 сполук при НАДФН – індукованому ВРО, причому 6 сполук по ефективності перевершують метіонін і унітіол. Високу АОА зазначені сполуки проявляють при неферментативному ініціюванні та інгібуванні супероксидрадикалу. Так, із 19 сполук цього ряду 15 перевищують ефект еталонних препаратів.

Встановлено, що сила атиоксидантної дії залежить від характеру замісника як у 4, так i у 5 положенні 1,2,4-триазолу. Так, введення в положення 4 n-диметиламінобензиліденового залишку, а в 5 положення тіогептильного або тіононільного замісника підсилює АОА активність досліджуваних сполук.

Дослідження АОА серед похідних 4(3Н)-хіназолону (3.1-3.17, 5.1-5.12) показало, що досліджувані сполуки проявляють активність на моделях ферментативного і неферментативного ініціювання ВРО, із них 20 сполук за силою ефекту перевершують дію еталонів порівняння (схема 2). Bci похідні 4(3Н)-хіназолону активні по відношенню до супероксидрадикала, причому 16 сполук перевищують антирадикальний ефект сечовини.

Необхідно відзначити, що введення нітрогрупи в положення 6 4(3Н)-хіназолону та модифікація замісника в положенні 3 посилює АОА. Так, найбільшу АОА проявляють сполуки, які мають у положенні 3 залишки оцтової, -, -пропіонових кислот та їх похідні.

Похідні N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонових кислот (4.1-4.8) проявляють АОА на моделях ферментативного і неферментативного ініціювання ВРО, інгібують утворення супероксидрадикалу. Характер та сила дії у цьому ряду залежить від розташування замісника у фенільній субстиненті. Так, переміщення карбоксильної групи з о- у м- та п–положення приводить до значного посилення АОА сполук 4.3, 4.4, активність яких вище активності еталонів порівняння. Серед похідних 4-гідразинохіназоліну (4.9-4.16) в дослідах in vitro найбільшу АОА проявляють сполука 4.9, яка має ацетилгідразинний замісник в положенні 4 i перевищує ефективність етанолів порівняння на всіх моделях.

У результаті досліджень похідних 1,2,4-триазолу i хіназоліну в дослідах in vitro було відібрано сполуки, що проявляють виражену АОА i представляють інтерес для подальшого фармакологічного вивчення.

3. Досліджування антиоксидантної та протиішемічної активності похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну при гострому порушенні мозкового кровообігу

Для оцінки антиоксидантних властивостей і вивчення ефективності похідних 1,2,4-триазолу i хіназоліну в умовах експериментального ГПМК було відібрано 29 сполук.

Похідні 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-?-тіокарбонових кислот, 1-алкіл-(карбоксалкіл)-4-бензиліденаміно-1,2,4-триазолія броміду i похідні хіназоліну відносяться до класу малотоксичних або практично нетоксичних сполук (ЛД50 100-3000 мг/кг) при їх внутрішньочеревинному введенні щурам [К.К. Сидоров, 1973].

Призначення щурам протягом 4-х діб після однобічної перев'язки загальної сонної артерії 10 сполук – похідних 1-алкіл(карбоксалкіл)-4-бензиліден-аміно-1,2,4-триазолія бромідів у дозах 1/50 від їх ЛД50 приводило до достовірного зниження продуктів ВРО (ДК, ТК, МДА) і активації АО-ферментів (СОД, каталаза, ГПР) в ішемізованих півкулях головного мозку. По силі АОА досліджувані сполуки перевищують або конкурують з референс-препаратами (дибунол, -токоферол). Величина АОА для цього ряду сполук залежить як від природи альдегідного залишку в 4 положенні триазолового циклу, так і від наявності в 1 положенні залишків алкілкарбонових кислот або алкілів. Так, найбільшу активність серед досліджених сполук проявляють сполуки 2.8, 2.12, 2.16, 2.17.

У механізмі антиоксидантного дії похідних 1-алкіл(карбоксалкіл)-4-бензиліденаміно-1,2,4-триазолія бромідів крім здатності активувати систему АО-ферментів, також лежить здатність інгібіювати деякі шляхи утворення АФК при ішемії. Можливим поясненням цього механізму може бути виявлена нами антиадренергічна активність сполук 2.5, 2.8, 2.12, 2.15, 2.16, 2.19. Більш поглибленими дослідженнями на ізольованій матці щурів була підтверджена висока антиадренергічна активність сполуки 2.16 (-фенетил-4-(п-диметиламінобензиліденаміно)-1,2,4-триазолія бромід), що достовірно перевищувала дію анаприліну. Подібний взаємозв'язок між антиадренегрічною, антиоксидантною і протиішемічною активністю був підтверджений і іншими авторами [Ф.З. Меерсон, 1983, М.В. Биленко, 1989; K. Ondrias, A. Stasko, D. Gerdel, 1998].

Крім цього, у механізмі антиоксидантної дії досліджуваних сполук лежить здатність знижувати утворення АФК за рахунок відновлення основної ланки біоенергетики (збільшення продукції АТФ, малату та пірувату, зниження лактату). Призначення тваринам з ГПМК цього ряду сполук приводило до зниження гіперферментемії ВВ-КФК, причому по силі протиішемічної дії сполуки 2.5, 2.8, 2.15, 2.16 достовірно перевершували пірацетам.

Призначення тваринам з експериментальним ГПМК 13 сполук – похідних 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислот у дозі 50 мг/кг приводило до гальмування реакцій ВРО і зниження продукції ДК, ТК і МДА, підвищення активності АО-ферментів (СОД, каталази, ГПР) у ішемізованих тканинах головного мозку. По силі антиоксидантної дії 10 сполук достовірно перевершують активність референс-препаратів. Сила антиоксидантної дії в цьому ряді сполук залежить від будови замісника в 5 положенні триазолового циклу і максимальна при наявності залишків етанової (1.1, 1.2) і -бутанової (1.14, 1.15) кислот. Механізм антиоксидатної дії 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислот пов'язаний з їхньою здатністю попереджати ініціювання АФК шляхом відновлення основних ланок енергетичного обміну (збільшення продукції АТФ, АДФ, інтенсифікація переважно аеробного шляху окислювання) і підвищувати активність АО-ферментів. Антиоксидантний ефект може також бути реалізований за рахунок комплексоутворюючих властивостей карбоксильної групи, яка здатна зв'язувати метали змінної валентності і попереджати ініціювання реакції Фентона і Габера-Вейса [М.В. Биленко, 1989; P. Racay et al, 1998].

Результатом подібного позитивного впливу досліджуваних сполук на антиоксидантний статус і процеси біоенергетики головного мозку було зниження ушкодження мембран нейроцитів, про що свідчило зменшення гіперферментемії ВВ-КФК. По силі протиішемічної дії 10 сполук похідних 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислот достовірно перевищують пірацетам.

Застосування в період ГПМК 6 похідних хіназоліну в дозі 1/50 від їх ЛД50 приводило до значної антиоксидантної дії (підвищення активності СОД, ГПР та каталази, збільшення фонду -токоферолу, зниження ДК, ТК і МДА в тканинах мозку), яка перевищувала ефективність референс-препаратів. Найбільшою АОА володіють похідні 6-нітро-4(3Н)-хіназолону (5.3, 5.4).

Так, нами зроблене припущення що основною ланкою у механізмі антиоксидантної дії похідних хіназоліну є їх власний антирадикальний ефект, який пов'язаний з донорно-акцепторними властивостями замісників (ацилгідразино, іліденгідразино, гідразиногрупи), а також із здатністю нітрогрупи інгібіювати супероксидрадикал [Р. Григлевски, 1998].

Досліджувані похідні хіназоліну проявляють протиішемічну активність, яка по силі перевищує ефект пірацетаму.

Отримані дані про АОА і механізм антиоксидантної дії досліджуваних сполук стали експериментальним обґрунтуванням для оцінки їх протиішемічної активності не тільки в умовах ішемії, а також і при реперфузійних пошкодженнях головного мозку. Так, була виявлена протиішемічна і антиоксидантна дія похідних 1,2,4-триазолу (1.2 - "Тіотриазолін", 2.16) і хіназоліну (4.39, 5.3) при інтракаротидному введенні собакам до моделювання та в період розвитку ішемії-реперфузії головного мозку. Важливим моментом у захисній дії досліджуваних сполук було гальмування реакцій ВРО, активація ферментів АО-захисту, відновлення основних ланок вуглеводно-енергетичного обміну, підвищення енергетичного статусу і зменшення кількості ішемічно змінених нейронів, як у період гострої ішемії-реперфузії (2.16, 4.39, 5.3), так і в більш (3 доби після операції) віддалені терміни ("Тіотриазолін"). По силі протиішемічної дії в умовах ішемії-реперфузії головного мозку досліджувані сполуки достовірно перевищували пірацетам.

4. Оцінка протиішемічної та антиоксидантної дії короткочасної інфузії розчинів похідних 1,2,4-триазолу і хіназоліну при ішемії головного мозку

З метою підвищення ефективності протиішемічної експериментальної терапії мозкових інсультів доцільним з'явилося інтракаротидне введення сполук 2.16, 4.39, 5.3 і тіотриазоліну в складі сольових розчинів. Інтракаротидна інфузія сольових розчинів собакам з експериментальним ГПМК виконувалася в спеціально розробленому об'ємно-швидкісному режимі [В.Н. Клименко, 1994].

Необхідно відзначити, що інфузійна терапія приводила до гальмування реакцій ВРО, підвищення активності ферментів АО захисту, підвищення енергетичного статусу нейроцитів, зниження явищ периваскулярного і перицелюлярного набряків, зменшення кількості змінених нейронів, активації гліального сателітозу. Оксигенування інфузійних розчинів підсилювало терапевтичну дію за рахунок інтенсифікації аеробної продукції АТФ і підвищення антиоксидантного статусу головного мозку. Найбільший терапевтичний ефект спостерігався при призначенні розчинів тіотриазоліну і сполуки 2.16, які перевищували за силою дії розчин пірацетаму.

Для підвищення ефективності експериментальної терапії ГПМК, виходячи з результатів власних досліджень і робіт ряду авторів [М.Н. Кондрашова, 1978; В.Д. Лукьянчук, Л.В. Савченкова, 2001], був обґрунтований склад і застосування інфузійного розчину комбінації тіотриазоліну, пірацетаму та сукцинату (робоча назва "МБ"). Інтракаротидне введення розчину "МБ" собакам з ГПМК сприяло відновленню енергообміну мозку, підвищенню його антиоксидантного статусу і зниженню продуктів ВРО.

5. Дослідження ноотропної та церебропротективної дії препарату “Ноотрил”

Базуючись на уявленнях про патофізіологічні і біохімічні механізми розвитку ішемічного і геморагічного інсультів, вважається, що одним з перспективних напрямків підвищення ефективності фармакотерапії церебральної гіпоксії є використання препаратів, які активують власні біоенергетичні процеси, гальмують основні шляхи утворення активних форм кисню, реактивують антиоксидантну систему та покращують когнітивні функції головного мозку [А. Ярош, 2002; Р.У. Островская, Т.А. Гудашева, Т.А. Воронина, 2002]. З цією метою широко використовуються препарати, які нормалізують мозковий кровообіг, мікроциркуляцію і метаболізм, серед яких особливе місце займає пірацетам [Р.У. Островская, 1982; Н.Н. Боголепов, Е.И. Гусев, Г.С. Бурд, 1983; И.В. Полевик, 1999; І.Ю. Бережна та співавт., 2002]. Також особливий інтерес у цьому плані представляє препарат "Тіотриазолін", який проявляє високу антиоксидантну та протиішемічну активність на різних моделях експериментальної ішемії органів [В.В. Дунаев та співавт., 1996; Е.Ю. Бибик, 1999; В.Д. Лукьянчук, 2000].

Нашими дослідженнями було встановлено,