УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

Білушко Віктор Валерійович

УДК 619:616.98:579.873.21

РОЗРОБКА БІКОМПОНЕНТНОГО АЛЕРГЕНУ З АТИПОВИХ МІКОБАКТЕРІЙ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії вивчення туберкульозу Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини

Української академії аграрних наук.

Науковий керівник

доктор ветеринарних наук Завгородній Андрій Іванович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії вивчення туберкульозу.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Геннадій Андрійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії пато-

морфології;

кандидат ветеринарних наук Сосницький Олександр Іванович, Луганський національний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, доцент кафедри мікробіології та фармакології.

Провідна установа

Одеський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, кафедра мікробіології та вірусології, м. Одеса.

Захист відбудеться " 23 " квітня 2003 р. о

13-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.359.01

в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий " 20 " березня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук ____________БАБКІН А. Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Епідеміологічне благополуччя будь-якої країни неможливе без постійного ветеринарного контролю щодо антропозоонозів. Одним з небезпечних антропозоонозів, що завдають значних економічних втрат тваринництву, а також шкоди здоров'ю людини є туберкульоз.

Боротьба з туберкульозом тварин, як в Україні, так і за її межами, базується на проведенні комплексу організаційно-господарських та ветеринарно-санітарних заходів. Прижиттєвий контроль благополуччя великої рогатої худоби щодо туберкульозу проводять шляхом систематичних алергічних досліджень за допомогою внутрішньошкірної туберкулінової проби (ВТП) із застосуванням туберкуліну [Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., 1998; Ткаченко О.О., 1999; Кассіч Ю.Я., Завгородній А.І., 1999; Бусол В.О., 2002]. В останні роки у благополучних щодо туберкульозу господарствах виявляють тварин з неспецифічними реакціями на внутрішньошкірне введення туберкуліну. Основною причиною виникнення цих реакцій є поширення у природі атипових мікобактерій, які сенсибілізують організм тварин до туберкуліну. Це ускладнює визначення епізоотичної ситуації з туберкульозу в господарствах [Мартма О.В., 1989; Кассіч Ю.Я., Завгородній А.І., 1996, 2000].

Контроль благополуччя щодо туберкульозу здійснюють не лише за допомогою ВТП, але й за результатами післязабійного огляду туш великої рогатої худоби [Кочмарский В.А., 1978; Kouba V., 1984; Miciora R., 1996]. Але на практиці мають місце випадки, коли у реагуючих на туберкулін тварин при діагностичному забої в органах і тканинах відсутні патологоанатомічні зміни, що властиві туберкульозу.

У зв'язку з цим виникає проблема диференціації специфічних та неспецифічних реакцій на туберкулін у великої рогатої худоби [Мартма О.В., 1982; Шаров О.М., 1989; Кассіч Ю.Я., Завгородній А.І., 1996].

Одним з методів встановлення діагнозу на туберкульоз в Україні, що наведені в "Методичних рекомендаціях з визначення природи реакцій на туберкулін у великої рогатої худоби господарств, благополучних щодо туберкульозу, і встановлення видової належності культур мікобактерій" (1997), є симультанна алергічна проба з використанням туберкуліну (ППД) для ссавців та комплексного алергену з атипових мікобактерій (КАМ). Симультанну алергічну пробу з використанням КАМ рекомендують застосовувати, як один із засобів диференціації неспецифічних реакцій на туберкулін науковці інших країн [Шаров А.Н., 1989; Кузнецов Н.О., 2000; Писарев А.И., 2000]. В Україні біологічні підприємства такий препарат не виготовляють. Препарат КАМ сьогодні виготовляють лише в Росії, на Курській біофабриці.

З метою забезпечення ветеринарної медицини України препаратом для диференціації специфічних і неспецифічних реакцій на туберкулін у великої рогатої худоби необхідно розробити вітчизняний алерген з атипових мікобактерій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за темою: "Розробити систему заходів боротьби з туберкульозом сільськогосподарських тварин в умовах реформування тваринництва" (номери державної реєстрації 0197U000755; 0101U001615).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - визначити протеїногенні культури атипових мікобактерій та розробити алерген з атипових мікобактерій для диференціації специфічних та неспецифічних реакцій на туберкулін у великої рогатої худоби при з'ясуванні епізоотичної ситуації з туберкульозу.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- вивчити епізоотичну ситуацію щодо туберкульозу великої рогатої худоби, та частоту виділення культур мікобактерій у господарствах України;

- розробити синтетичні живильні середовища для отримання матричного розплоду та виробничого культивування мікобактерій;

- вивчити культуральні та протеїногенні властивості атипових мікобактерій, з метою відбору культур, придатних для виробництва алергену;

- виготовити моноалергени з протеїногенних культур атипових мікобактерій і вивчити їх властивості на лабораторних та сільськогосподарських тваринах;

- відпрацювати технологію виготовлення бікомпонентного алергену з атипових мікобактерій.

Об'єкт дослідження: епізоотологія та діагностика туберкульозу, виготовлення алергенів із атипових мікобактерій.

Предмет дослідження: культурально-морфологічні та протеїногенні властивості атипових мікобактерій, живильні середовища для їх культивування, виготовлення моноалергенів та біалергену з атипових мікобактерій, а також вивчення їх діагностичної ефективності в дослідах на лабораторних та сільськогосподарських тваринах.

Методи дослідження. При виконанні роботи використовували метод ретроспективного епізоотологічного аналізу, а також культуральні, біологічні, біохімічні, бактеріологічні і статистичні методи. Виготовлення моноалергенів і вивчення їх властивостей здійснювали згідно з Інструкцією по виготовленню й контролю туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині, а також ТУУ 46.15.142-96.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні:

- вивчено протеїногенні властивості, найбільш поширених на території України, атипових мікобактерій;

- розроблено синтетичне живильне середовище з вітчизняної сировини для виробничого культивування мікобактерій;

- вивчено елективні властивості розроблених збагачених синтетичних живильних середовищ з рістстимулюючим компонентом для культивування мікобактерій;

- виготовлено моноалергени із протеїногенних культур атипових мікобактерій, вивчено активність, реактогенність та сенсибілізуючі властивості цих препаратів у дослідах на лабораторних та сільськогосподарських тваринах;

- розроблено технологію отримання алергену з атипових мікобактерій.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень використані при розробці нормативної документації на алерген із атипових мікобактерій (ААМ), яка розглянута та схвалена методичною комісією ІЕКВМ УААН з інфекційної патології (протокол № 9 від 12 листопада 2002 року).

Визначено протеїногенні штами нефотохромогенних та скотохромогенних культур атипових мікобактерій видів M. intracellularae та M. scrofulaceum для виготовлення моноалергенів ААМ, що підтверджено патентами України №№ 40847А і 40848А від 15.08.01, а також розроблено рідкі живильні середовища для їх культивування.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальних досліджень, аналіз отриманих результатів, їх статистичну обробку та узагальнення виконано дисертантом особисто. Визначення загального білка у алергенах проводилося спільно з завідувачем сектору біохімії ІЕКВМ УААН, кандидатом біологічних наук С. А. Михайловою, дослідження з виготовлення й контролю ААМ виконували спільно з провідним науковим співробітником ІЕКВМ, кандидатом ветеринарних наук В.Ю. Кассічем.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладено та обговорено на звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН (м. Харків, 1999-2002 рр.) і науково-практичних конференціях: " Інфекційна патологія молодняка сільськогосподарських тварин і птиці " (м. Суми, Сумський державний аграрний університет, 1999 р.); " Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки " (м. Харків, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, 1999 р.); "ІЕКВМ - 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки " (м. Харків, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, 2002 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 6 наукових праць у фахових виданнях.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 144-х сторінках комп'ютерного друку і складається з вступу; огляду літератури; матеріалів та методів; власних досліджень; обговорення отриманих результатів; висновків; списку використаних джерел і додатків. Роботу ілюстровано 21 таблицею та 2 рисунками. Список використаної літератури складає 218 джерел, у тому числі 171 - закордонних авторів.

Матеріали та методи досліджень

Робота виконана в період з 1998 по 2002 рік у лабораторії вивчення туберкульозу Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук, а також у тваринницьких господарствах "Нива" та ‹‹Гонтарівське›› Вовчанського району Харківської області.

У дослідженнях з вивчення культуральних і протеїногенних властивостей, а також з відбору виробничих культур атипових мікобактерій було використано 12 (4 референтних та 8 польових, виділених від реагуючої на туберкулін великої рогатої худоби) культур 4-х видів атипових мікобактерій, найбільш розповсюджених у гуртах великої рогатої худоби в господарствах України: M. gordonae № 106, M. gordonae № 109, M. gordonae № 114, M. scrofulaceum № 63, M. scrofulaceum № 62, M. scrofulaceum № 31/82, M. scrofulaceum № 12 "Одеса", M. intracellularae Wilson, M. intracellularae № 78/98, M. intracellularae № 609, M. intracellularae № 4937 і M. fortuitum № 54.

Для проведення сенсибілізації лабораторних і сільськогосподарських тварин використовували штам BCG у вигляді суспензії. Культури мікобактерій для виконання роботи були отримані з колекції лабораторії вивчення туберкульозу ІЕКВМ УААН.

Із живильних середовищ для досліджень були застосовані:

1) гліцеринове середовище Павловського;

2) сухе живильне середовище для культивування мікобактерій;

3) середовище Сотона;

4) синтетичне живильне середовище Б-1-ІЕКВМ

5) синтетичне живильне середовище Моделя;

6) картопляний відвар.

Тінкторіальні властивості у мікобактерій вивчали в мазках, пофарбованих за методом Циль-Нільсена, а морфологічні властивості - після висіву культур мікобактерій на щільне яєчне живильне середовище для культивування мікобактерій.

Протеїн у культуральному фільтраті осаджували 50% водним розчином трихлороцтової кислоти (ТХО). Для повного осадження протеїну в бутлі, де знаходився культуральний фільтрат, цівкою додавали 50% водний розчин ТХО до кінцевого вмісту її у культуральному фільтраті 4-6%. У виготовлених напівфабрикатах моноалергенів визначали вміст загального білка за методом К'єльдаля (1960) .

У роботі також були використані: ,,Туберкулін очищений (ППД) для ссавців у стандартному розчині" (серія-12, контроль-12, виготовлений 26.05.99 р.); ,,Сухий очищений комплексний алерген з атипових мікобактерій" (серія-14, контроль-14, виготовлений 25.05.98 р.); ,,Розчинник мікобактеріальних алергенів" (серія-14, контроль-14, виготовлений 25.05.98 р.) виробництва Курської біофабрики (Росія), а також експериментальні серії моноалергенів, виготовлених з атипових мікобактерій видів M.gordonae, M.fortuitum, M. scrofulaceum, M. intracellularae і ААМ.

При виконанні роботи було виготовлено по 8 серій моноалергенів кожного виду в кількості по 200 см3 . З цих моноалергенів виготовлено 8 серій ААМ у кількості 400 см3 кожної серії препарату. Вивчення властивостей ААМ проводили на 3-х серіях препарату.

Визначення реактогенності, біологічної активності, специфічності та сенсибілізуючих властивостей у моноалергенів і ААМ проводили в дослідах на 260-ти здорових, не реагуючих на туберкулін і КАМ, морських свинках-альбіносах з живою масою 450-500 г, а також на 90 телятах симентальської та чорно-рябої порід віком до 1 року. Сенсибілізуючі властивості моноалергенів і ААМ вивчали після триразового внутрішньошкірного введення в дозі 0,1 см3/гол. з інтервалом 5 діб. На дослідження кожного препарату було використано по 3 дослідні морські свинки, а також по 3 контрольні свинки. Дослідні препарати вводили з правого боку, а туберкулін і КАМ - з лівого. Облік реакцій проводили через 24 години після введення алергенів. Вивчення реактогенності алергенів проводили шляхом обліку величини папули на місці їх внутрішньошкірного введення морським свинкам через 24 години.

З метою вивчення специфічності моноалергенів і ААМ, через 30 діб після сенсибілізації гомологічними культурами мікобактерій, морським свинкам внутрішньошкірно вводили: першій групі - з лівого боку туберкулін очищений (ППД) для ссавців, з правого - КАМ; другій групі - з лівого боку моноалерген, виготовлений із культури М. intracellularae № 78/98, з правого - КАМ; третій групі - з лівого боку моноалерген, виготовлений із культури М. scrofulaceum № 31/82, з правого - КАМ. Кожний алерген вводили в дозі 0,1 см3, облік реакцій проводили через 24 години після введення.

Визначення біологічної активності моноалергенів проводили за методикою Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВОЗ), що враховує пряму залежність між десятинним логарифмом введеної дози туберкуліну та інтенсивністю алергічних реакцій у морських свинок, сенсибілізованих культурою мікобактерій вакцинного штаму BCG. Потім моноалергени змішували в рівних частинах за біологічною активністю, а отриманий препарат ліофілізували. Для цього алерген спочатку заморожували у флаконах в апараті Н3-12:50 із етиловим спиртом , охолодженим до t = -30-40оС протягом 15-20 хвилин. Потім сушили при t = - 60оС у апараті ЛЗ-45:27 впродовж 4-х годин при t конденсору - 45-50оС і вакуумі 10-12 Па. Після цього продовжували висушування від 4 до 24 годин в режимі: t = - 60-65оС і вакуумі 1-2 Па. Активність дослідних серій ААМ порівнювали з контрольною серією КАМ.

Вивчення активності та специфічності моноалергенів M. scrofulaceum № 31/82 і M. intracellularae № 78/98 на великій рогатій худобі проводили на базі ВАТ "Нива" Вовчанського району Харківської області, яке є благополучним щодо туберкульозу великої рогатої худоби. Для проведення досліду було використано 25 голів клінічно здорових бичків, що не реагували на туберкулін, віком до 1 року симентальської та чорно-рябої порід живою вагою 180-200 кг, із яких 5 голів тварин були контрольними. За 30 діб до початку досліду бичків сенсибілізували зависсю живих культур M. scrofulaceum № 31/82 (5 голів), M. intracellularae № 78/98 (5 голів) і BCG (10 голів). Завись перелічених культур дослідним тваринам вводили підшкірно в області підгрудка у дозі 1 мг/см3 стерильного фізіологічного розчину. Сенсибілізованим мікобактеріями бичкам, через 30 діб після щеплення, вводили алергени в дозі 0,1 см3/гол. Алергени вводили внутрішньошкірно в області середньої третини шиї за допомогою безголкового ін'єктору БІ-7. Місце введення попередньо вистригали та обробляли етиловим спиртом. Облік реакцій проводили через 72 години шляхом порівняння товщини шкіри в місці введення алергену та біля місця введення.

Для визначення стерильності ААМ готували живильні середовища: МПА, МПБ, МППБ під вазеліновим маслом (середовище Кітт-Тароци) і середовище Сабуро. МПБ і МППБ розливали по 100 см3 у флакони; МПА та середовище Сабуро - по 5-6 см3 у пробірки. Після цього живильні середовища стерилізували в автоклаві при 1 атм. протягом 30 хвилин. Висів проводили по 1-5 см3 розчину ААМ у три флакони (пробірки) з кожним середовищем. Для дослідження використовували суміш із 3-х флаконів ААМ.

У дисертаційній роботі використані звітні дані Державного департаменту ветеринарної медицини та Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини України за період з 1985 по 2001 роки. Визначення епізоотичної ситуації з туберкульозу великої рогатої худоби в Україні проводили шляхом аналізу матеріалів державної звітності.

Експериментальні дані піддавали статистичній обробці за методом Ст'юдента-Фішера на персональному комп'ютері РС\АТ з використанням статистичної програми ,,Exel", а також за допомогою методу критерію знаків [Ашмарін І.П., Воробьов О.О., 1962].

Результати досліджень

Вивчення епізоотичної ситуації з туберкульозу великої рогатої худоби в Україні. Найбільша кількість неблагополучних пунктів: 57 господарств у Київській, 14 - у Запорізькій, 13 - у Луганській, 21 - у Харківській та 11 - у Черкаській областях.

Спорадичні випадки захворювання (від 1 до 6 пунктів) мали місце в Донецькій, Житомирській, Львівській, Херсонській і Чернігівській областях.

За період з 1988 по 2000 рік туберкульоз встановлено у 2379-ти господарствах 23-х областей України. За допомогою алергічної проби в них виділено 12396 голів хворої на туберкульоз худоби. Якщо проаналізувати стан захворюваності великої рогатої худоби на туберкульоз по регіонах, то найбільшу кількість неблагополучних пунктів за останні 13 років зареєстровано у Київській області - 317, Одеській - 308, Черкаській - 204, Луганській - 196, Дніпропетровській - 151, Миколаївській - 142. За 13 років (1988-2000 рр.) інфікування великої рогатої худоби збудником туберкульозом бичачого виду виявлено лише в двох господарствах Тернопільської та Чернівецької областей, в 4-х господарствах Донецької та Івано-Франківської областей, а також у 10-ти господарствах Львівської області.

У Криму поголів'я великої рогатої худоби більше 30 років є благополучним щодо туберкульозу, а в Рівненській області інфікування тварин збудниками туберкульозу не реєструється з 1982 року. У решті областей за цей же час було виявлено від 26 до 129 неблагополучних господарств.

Слід відзначити, що у неблагополучних господарствах з 1988 по 1991 роки піддавали забою всіх хворих тварин, тоді, як за останні шість років у гуртах перетримувались 6622 голів, реагуючих на туберкулін тварин.

За період з 1985 по 2000 рр. лабораторіями ветеринарної медицини Україні з патматеріалу було виділено 22480 культур мікобактерій. З них до збудників туберкульозу бичачого виду віднесено 7107 культур, людського виду - 39 культур, пташиного виду - 425 культур. 14909 культур віднесено до атипових мікобактерій ІІ, ІІІ та ІV груп за Раньоном. У 2000 році в Україні виділено 70 неблагополучних щодо туберкульозу великої рогатої худоби господарств, одночасно у 2511 благополучних по цьому захворюванню господарствах установлена сенсибілізація великої рогатої худоби атиповими мікобактеріями до ППД-туберкуліну для ссавців. Найбільш поширеними в Україні є атипові мікобактерії видів M. fortuitum, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. intracellularae та інші. Культури цих видів мікобактерій були відібрані для виготовлення моноалергенів.

Селекція культур атипових мікобактерій. Із вирощеної на середовищі Павловського бактеріальної маси культур мікобактерій готували завись із розрахунку 1 мг у 1 см3 фізіологічного розчину, після чого з зависі виготовляли 6 розведень (від 10-1 до 10-6 ), які висівали на щільне яєчне живильне середовище для культивування мікобактерій.

Швидкоростуча культура мікобактерій виду M. fortuitum № 54 на живильному середовищі при всіх розведеннях виростала на 7 добу після висіву у вигляді поодиноких колоній світло-сірого кольору. Первинний ріст культур виду M. gordonae спостерігався на 12-14 добу у всіх розведеннях у вигляді колоній світло-жовтого кольору маслянистої консистенції з гладенькою і блискучою поверхнею. Частина колоній (від 10 до 20) виростала на поверхні живильного середовища тільки в п'ятому та шостому розведенні. Інтенсивно виростали культури виду M. intracellularae №№ 78/98, 609 та Wilson у розведеннях 10-1-10-4 у вигляді сухих зі зморшкуватою поверхнею колоній світло-сірого кольору, а на 30 добу культивування вони мали кремовий колір. Окремі колонії цих культур виростали в розведеннях 10-5 та 10-6. Культура M. intracellularae № 4937 виростала у всіх розведеннях у вигляді вологих, блискучих, маслянистої консистенції колоній світло-сірого кольору. Всі культури виду M. scrofulaceum виростали на живильному середовищі через 12-14 діб після висіву у вигляді гладеньких, блискучих, маслянистої консистенції колоній оранжевого кольору. Окремі їх колонії виростали в розведенні 10-6.

Результати проведеної роботи показали, що не всі культури задовільно росли в однакових умовах. Тому було доцільним провести порівняльне культивування дослідних штамів мікобактерій на синтетичних середовищах, що використовують для виготовлення алергенів.

Розробка живильних середовищ для культивування мікобактерій. Розроблене синтетичне живильне середовище Б-1-ІЕКВМ за виходом бактеріальної маси вірогідно перевищило відоме синтетичне живильне середовище Моделя При додаванні картопляного відвару до синтетичних живильних середовищ найбільш оптимальним виявилось співвідношення відповідно 1:4. Живильні середовища з картопляним відваром забезпечують кращий ріст мікобактерій ніж звичайні синтетичні середовища (р=0,15-0,05). Середні показники виходу бакмаси і загального білка культури M. intracellularae 78/98 з середовища Сотона (чистого та з картопляним відваром) становлять, відповідно, 0,48±0,02 % і 1,13±0,125 %; 0,73±0,033 мг/см3 і 1,15±0,069 мг/см3. При культивуванні M. intracellularae 78/98 на середовищі Б-1-ІЕКВМ були отримані такі результати: вихід бакмаси на чистому середовищі 0,57±0,022 %, на середовищі з відваром 1,47±0,166 %; вихід загального білка, відповідно, 0,79±0,038 мг/см3 і 1,26±0,108 мг/см3. Показники виходу бакмаси і загального білка іншої тест-культури, M.scrofulaceum 31/82, відповідно, становлять: з середовища Сотона - 0,44±0,028 % і 1,23±0,02 %; 0,86±0,041 мг/см3 і 1,08±0,13 мг/см3. При вирощуванні культури M.scrofulaceum 31/82 на середовищі Б-1-ІЕКВМ отримані наступні результати: вихід бакмаси - 0,55±0,026 % і 1,59±0,177 %; а вихід загального білка - 0,56±0,068 мг/см3 і 1,31±0,154 мг/см3.

При культивуванні тест-культур на картопляному відварі отримані такі результати: у M.scrofulaceum 31/82 вихід бакмаси становив 0,64±0,043 %, а вихід загального білка - 1,04±0,056 мг/см3 ; у M. intracellularae 78/98, відповідно, - 0,77±0,043 % та 1,004±0,047 мг/см3.

Результати порівняльного випробування елективних властивостей живильного середовища Б-1-ІЕКВМ свідчать про можливість його використання для виробничого культивування мікобактерій, а додавання картопляного відвару до синтетичних живильних середовищ дозволяє швидше отримати якісний матричний розплід культур мікобактерій.

Вивчення протеїногенних властивостей культур атипових мікобактерій. З урахуванням результатів вивчення культуральних і протеїногенних властивостей атипових мікобактерій при культивуванні їх на синтетичному живильному середовищі для виготовлення моноалергенів ААМ відібрані перспективні культури: M. intracellularae 78/98 i 609; M. scrofulaceum 31/82 i 12-,,O" (табл.1).

Інші культури мікобактерій гірше адаптувались і росли на синтетичному живильному середовищі (табл.1). Культура M. intracellularae Wilson мала слабкий і повільний ріст, проте при малому накопиченні бакмаси (0,27±0,021 % - 3 пасаж) давала відносно високий вихід білка (2,8±0,22 мг/см3). Культури виду M. gordonae повільно росли і мали у третьому пасажі найменші показники виходу бакмаси (0,26±0,02 - 0,31±0,026 %) і загального білка (0,7±0,052 - 1,72±0,13 мг/см3).

Слід відзначити, що всі культури мікобактерій при першому пасажі гірше росли ніж при другому та третьому пасажах. Відібрані перспективні культури мікобактерій M. intracellularae 78/98 i 609; M. scrofulaceum 31/82 i 12-,,O", у порівнянні з іншими культурами, мали кращі показники з виходу бакмаси, загального білка та інтенсивності росту на синтетичному середовищі у першому, другому і третьому пасажах. На відібрані для виробництва культури мікобактерій отримані державні патенти (№№ 40847 і 40848А).

Визначення біологічної активності моноалергенів, виготовлених із атипових мікобактерій видів M. scrofulaceum i M. intracellularae в дослідах на морських свинках. При вивченні залежності інтенсивності алергічних реакцій у морських свинок, сенсибілізованих гомологічними культурами мікобактерій, від десятинного логарифму дози (lg D) моноалергенів, виготовлених із атипових мікобактерій, виявили існування прямої залежності між цими показниками в межах lg D ? 10 000 від 0,69 до 3,69 (табл. 2). Така залежність існує і для ППД- туберкуліну для ссавців.

Таблиця 2

Розведення мікобактеріальних моноалергенів із атипових мікобактерій

за вмістом загального протеїну

№ розведенняКількість загального протеїну, мг/см3lgD?10 00010,53,6920,052,6930,0051,6940,00050,69Відомо, що 1 МО (міжнародна одиниця) ППД-туберкуліну для ссавців містить 0,000028 мкг білка. Це відповідає інтенсивності внутрішньошкірних алергічних реакцій, у сенсибілізованих культурою BCG морських свинок, розміром 6 мм. При порівнянні 1 МО туберкуліну з 1 ОА (одиницею активності) кожного з виготовлених моноалергенів, встановлено, що 1 ОА для моноалергену, виготовленого з M. scrofulaceum 31/82 становить 0,000014 мкг білка, а 1 ОА для моноалергену, виготовленого з M. intracellularae 78/98 - 0,000028 мкг, отже біологічна активність моноалергену з M. intracellularae 78/98 дорівнює активності туберкуліну очищеному (ППД) для ссавців і в 2 рази менша від активності моноалергену з M. scrofulaceum 31/82 (рис.1).

Виготовлення алергену з атипових мікобактерій (ААМ) і вивчення його властивостей у дослідах на лабораторних та сільськогосподарських тваринах.

ААМ виготовляли з культурального фільтрату, отриманого після 60-ти добового культивування виробничих штамів мікобактерій, шляхом хімічного осадження та переосадження білка, а також діалізу залишків сульфату амонію в напівфабрикатах моноалергенів. У подальшому моноалергени змішували в рівних частинах згідно з їх біологічною активністю.

Біологічну активність препарату ААМ визначали в дослідах на морських свинках, сенсибілізованих сумішшю скотохромогенних та нефотохромогенних культур атипових мікобактерій видів М.scrofulaceum № 31/82 i M. intracellularae № 78/98, у порівнянні з КАМ. Через 30 діб після інокуляції мікобактерій морським свинкам вводили внутрішньошкірно розведення КАМ та 3-х дослідних серій ААМ. Результати інтенсивності алергічних реакцій на введення ААМ та КАМ наведені в таблиці 3.

Таблиця 3

Інтенсивність реакцій на введення розведень КАМ і ААМ

№ ппКАМ (контроль), ммААМ (дослідна серія), ммРозведення 1 - 0,5 мг/cм3 білкаРозведення 2- 0,05 мг/см3Розведення 1- 0,5 мг/cм3Розведення 2- 0,05 мг/см3Контроль 1 серіїКонтроль2 серіїКонтроль3 серіїКонтроль1 серіїКонтроль2 серіїКонтроль3 серії1 серія2 серія3 серія1 серія2 серія3 серія113,51011,51213101413,51213,51211,52141314,5877,51210,511543,53151413,514,513129,5109141312,54131212,55,5457,5895,568512,513147,56910,51110109116131111,56,57611,5121111,511127109115,555,511,5121298,59812,512,59910106,579,51013999,51011,5988,55,5675,565,510997,56,56810987812,511789,56,5799,51099,578,512141213131213,59,5128,591112,5?143133,5139103,598104116,5121116109,5108,5115,5

Із таблиці 3 видно, що сума показників інтенсивності реакцій на перше і друге розведення першої контрольної серії КАМ (В) складає 246,5 (143 + 103,5) мм, а сума показників інтенсивності реакцій на перше і друге розведення першої дослідної серії ААМ (С) складає 226 (116,5 + 109,5) мм.

Розрахунок біологічної активності (А) алергену, виготовленого з атипових мікобактерій проводили за формулою (1):

А = (С : В) ? 6750 (1), де

А - біологічна активність дослідної серії ААМ, ОД/см3;

В - сума показників інтенсивності реакцій на 1 і 2 розведення контрольної серії КАМ, мм;

С - сума показників інтенсивності реакцій на 3 і 4 розведення першої дослідної серії ААМ, мм;

6750 - біологічна активність контрольної серії КАМ, ОД/см3.

Розрахунок активності ААМ:

А = ( 226 :246,5 ) ? 6750 ? 6189 ОД/см3, де 6750 - активність (ОД) контрольної серії КАМ.

Таким чином біологічна активність ААМ становить: 1 серія - 6189 ОД в 1 см3 препарату; 2 серія - 6692 ОД/см3; 3 серія - 6430 ОД/см3.

При вивченні стерильності, реактогенності і сенсибілізуючих властивостей ААМ встановлено, що препарат є стерильним, нереактогенним і не викликає у здорових тварин сенсибілізації до алергенів. У досліді на лабораторних та сільськогосподарських тваринах доведена специфічність ААМ (табл.4).

Таблиця 4

Вивчення специфічності ААМ у дослідах на лабораторних і сільськогосподарських тваринах

Вид тваринКількість тварин, гол.Щеплені мікобактеріямиПереважно реагувало на алергени, гол.ППДААМКАММорські

свинки60Атиповими

(M. scrofulaceum i M. intracellularae-3030BCG30--Велика рогата худоба90Атиповими

(M. scrofulaceum i M. intracellularae-4545BCG45--Морські свинки, сенсибілізовані атиповими мікобактеріями видів M.scrofulaceum i M.intracellularae, більш інтенсивно реагували на введення специфічних алергенів - ААМ і КАМ. Контрольні морські свинки, сенсибілізовані культурою вакцинного штаму BCG, інтенсивніше реагували на ППД-туберкулін для ссавців. Досліди на бичках показали, що тварини, сенсибілізовані скотохромогенними і нефотохромогенними атиповими мікобактеріями, також з вірогідно більшою інтенсивністю реагували на алергени, виготовлені з атипових мікобактерій (ААМ і КАМ).

Висновки

1. Проаналізовано епізоотичну ситуацію з туберкульозу великої рогатої худоби в господарствах Україні за період з 1988 по 2000 рік. Серед культур атипових мікобактерій визначено перспективні штами для виготовлення моноалергенів; розроблено синтетичне живильне середовище для культивування мікобактерій з вітчизняних компонентів; а також технологію виготовлення моноалергенів і бікомпонентного алергену з атипових мікобактерій (ААМ) для диференціації специфічних і неспецифічних реакцій на туберкулін у тварин і вивчено властивості цих препаратів.

2. Із патологічного матеріалу, відібраного від великої рогатої худоби, збудника туберкульозу бичачого виду виділяли у 31,6% випадків від загальної кількості виділених культур, збудника туберкульозу людського виду - у 0,2%, а збудника туберкульозу пташиного виду - у 1,9% . Разом з тим культури атипових мікобактерій виділяли у 66,3% випадків.

3. З 12-ти досліджених культур 4-х видів атипових мікобактерій, за культуральними та протеїногенними властивостями, визначено придатними для виготовлення моноалергенів штами M. scrofulaceum № 31/82 і M. intracellularae № 78/98. Вміст загального білка у моноалергенах, виготовлених з цих культур, становить, відповідно 4,4±0,4 і 3,8±0,3; мг/см3, а вихід бактеріальної маси з культурального фільтрату - 0,49±0,04 і 0,6±0,05%.

4. Виготовлені з культур атипових мікобактерій видів М. scrofulaceum № 31/82 i M. intracellularae № 78/98 моноалергени є нереактогенними, специфічними та не мають сенсибілізуючих властивостей; одна одиниця активності моноалергенів містить, відповідно 0,000014 і 0,000028 мкг білка.

5. Інтенсивність алергічних реакції на внутрішньошкірне введення моноалергенів з атипових мікобактерій у морських свинок, сенсибілізованих гомологічними культурами мікобактерій, в дозах від 0,0005 до 0,5 мг/см3 білка, має пряму залежність від десятинного логарифму введеної дози.

6. За елективними властивостями синтетичне живильне середовище Б-1-ІЕКВМ не поступається живильному середовищу Сотона та вірогідно перевищує середовище Моделя.

7. Синтетичні живильні середовища з додаванням картопляного відвару у співвідношенні, відповідно 4:1 дозволяють за 7-14 діб отримати якісний матричний розплід і адаптувати культури мікобактерій до виробничих живильних середовищ, а також забезпечують кращий ріст мікобактерій. Вихід бакмаси при вирощуванні культури М.intracellularae № 78/98 на чистих і збагачених середовищах Б-1-ІЕКВМ і Сотона становить, відповідно 0,57±0,02% і 1,47±0,17% ; 0,48±0,02% і 1,13±0,13%.

8. Моноалергени та бікомпонентний алерген із атипових мікобактерій (ААМ) є нереактогенними, специфічними, активними, стерильними і не мають сенсибілізуючого впливу на організм тварин. Біологічна активність ААМ становить 6189±1350 ОД/см3.

Перелік наукових робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Білушко В. В. До проблеми диференціації специфічних та параалергічних реакцій на туберкулін у великої рогатої худоби // Вет. медицина : Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 1999. - Вип. 76. - С. 5 - 8.

2. Білушко В.В. Випробування елективних властивостей синтетичних живильних середовищ для вирощування мікобактерій / Пробл. зооінженерії та вет. медицини : Зб. наук. праць Харківського зооветеринарного інституту - Х., 1999. - Вип. 5 (ч. 2). - С. 104-107.

3. Щодо вирішення проблеми атипових мікобактерій у скотарстві країни // Ю. Я. Кассіч, А. І. Завгородній, С. С. Негіпа, В. В. Білушко, П. І. Вербицький, В. М. Горжеєв, М. С. Павленко, С. П. Долецький, В. В. Льоля, М. П. Часник / Вет. медицина України. - 1999, № 11. - С. 14-16.

Дисертантом проведено збір та узагальнення фактичного матеріалу, підбір та аналіз літературних джерел.

4. Білушко В. В. Вивчення протеїногенних властивостей культур атипових мікобактерій // Вет. медицина : Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2000. - Вип. 77. - С. 33-36.

1. Білушко В. В. Розробка моноалергенів для виготовлення алергену з атипових мікобактерій // Вет. медицина : Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2001. - Т. 1, Вип. 79. - С. 24 - 30.

2. Кассіч Ю.Я., Завгородній А.І., Шаров О.М., Білушко В.В. ,,Штам протеїногенний нефотохромогенний M.intracellularae № 78/98 для виготовлення моноалергену" Деклараційний патент України № 40847 від 15.08.2001 р..

Дисертантом проведено вивчення культуральних і протеїногенних властивостей 12-ти культур атипових мікобактерій 4-х видів.

3. Кассіч Ю.Я., Завгородній А.І., Шаров О.М., Білушко В.В. ,,Штам протеїногенний скотохромогенний M.scrofulaceum № 31/82 для виготовлення моноалергену" Деклараційний патент України № 40848 А від 15.08.2001 р..

Дисертантом проведено вивчення культуральних і протеїногенних властивостей 12-ти культур атипових мікобактерій 4-х видів

4. Селекція культур атипових мікобактерій / Ю.Я. Кассіч, А.І. Завгородній, В.В. Білушко // Вет. медицина : Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2002. - Вип. 80. - С. 285-287.

Дисертант особисто виконав експериментальну роботу з культивування атипових мікобактерій на щільному живильному середовищі, підбір і аналіз літератури та написання статті.

Білушко В.В. Розробка бікомпонентного алергену з атипових мікобактерій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2003.

У роботі проаналізовано епізоотичну ситуацію з туберкульозу великої рогатої худоби в господарствах України. Розроблено синтетичне живильне середовище для виробничого культивування мікобактерій, а також спосіб адаптації культур мікобактерій до синтетичних середовищ. Серед культур атипових мікобактерій, що найбільш поширені в Україні, на підставі вивчення їх культурально-протеїногенних властивостей, визначені перспективні штами для виготовлення моноалергенів - складових частин бікомпонентного алергену з атипових мікобактерій (ААМ).

Розроблено технологію виготовлення ААМ і вивчено його властивості (стерильність, реактогенність, активність, специфічність, сенсибілізуючий вплив) у дослідах на лабораторних і сільськогосподарських тваринах.

Ключові слова: алергени, атипові мікобактерії, велика рогата худоба, біологічна активність, неспецифічні реакції, сенсибілізація.

Белушко В.В. Разработка бикомпонентного аллергена из атипичных микобактерий. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 2003.

В работе проведен анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота и выделяемости культур микобактерий различных видов в хозяйствах Украины за период с 1988 по 2000 год по данным государственной ветеринарной отчётности. Разработана элективная синтетическая питательная среда для производственного культивирования микобактерий Б-1-ИЭКВМ с гликоколом, а также способ адаптации культур микобактерий к синтетическим средам путём добавления к этим средам картофельного отвара в соотношении 4:1 соответственно. Это позволяет за короткий срок (3-5 суток) получить качественный и жизнеспособный матричный расплод культуры микобактерий, подготовленной к производственному пересеву на чистую синтетическую питательную среду. Среди культур атипичных микобактерий, наиболее распространённых в хозяйствах Украины, путём изучения их культуральных и протеиногенных свойств, определены и запатентованы перспективные штаммы скотохромогенных и нефотохромогенных микобактерий для приготовления моноаллергенов - составных частей комплексного бикомпонентного алергена из атипичных микобактерий (ААМ).

Разработана технология изготовления препарата ААМ, который рекомендуется применять для проведения симультанной пробы при дифференциации специфических и неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, принадлежащего благополучным по туберкулёзу хозяйствам. Изучены в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных такие свойства ААМ, как стерильность, реактогенность, биологическая активность, специфичность, сенсибилизирующее влияние на макроорганизм.

Ключевые слова: аллергены, атипичные микобактерии, крупный рогатый скот, биологическая активность, неспецифические реакции, сенсибилизация.

Belushko V.V. The manufacture of bicomponent allergen from atypical mycobacteriums. - Manuscript.

The dissertation thesis for the scientific degree of candidate of veterinary sciences by the subject 16.00.03 - veterinary microbiology and virusology. Institute of experimental and clinical veterinary medicine UAAS. Kharkov, 2003.

Epizootological situation of bovine tuberculosis and atypical mycobacterium spreading at the enterprises in Ukraine have been analyzed in the work. A synthetic medium for production cultivation of mycobacterium and method of mycobacterium adaptation to synthetic mediums have been elaborated. Proteinogenic strains for atypical mycobacterium allergen (AAM) manufacturing were selected among the strains the most distributed in Ukraine.

Technology of AAM production has been elaborated. Such AAM properties as sterility, reactogenity, activity, specificity, sensible effect were studied on laboratory and production animals.

Key words : allergens, atypical mycobacteriums, cattle, biology activity, nonspecific reaction, sensibility.

Підписано до друку 10.02.2003 р. Формат 60х90/16.

Друк офсет. Папір офсет. Гарнітура Times NR Cyr.

Умовн. друк. арк. 0,9. Тираж 100 прим.

Надруковано в АТЗТ "САММІТ-Харків"

Св-во ДК № 133 від 01.08.2000 р.

61023, м. Харків, вул. Мироносицька, 86. Тел.: 142-620

PAGE