ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Пілунська Ольга Анатоліївна

УДК 631.589: 633.811

ФІЗІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ КЛОНАЛЬНОГО

МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ТРОЯНДИ ЕФІРООЛІЙНОЇ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті ефіроолійних і лікарських рослин Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

Бугара Олександр Михайлович,

Інститут ефіроолійних і лікарських рослин УААН,

завідувач лабораторії клітинної біології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Сарнацька Вереса Василівна,

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу фізіології

росту та розвитку рослин

кандидат біологічних наук

Колесніченко Олена Валеріївна,

Інститут садівництва УААН, завідувач лабораторії

біотехнології та оздоровлення садівного матеріалу.

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка

НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться " 20 " травня 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розіслано " 19 " квітня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради Труханов В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Троянда - одна з основних ефіроолійних культур, які вирощуються в Україні. З квіток троянди одержують ефірну олію, трояндовий конкрет, трояндову абсолютну олію, а також трояндову воду, які знаходять широке застосування в парфюмерно-косметичній, медичній та харчовій промисловості.

Крим є традиційним регіоном вирощування троянди ефіроолійної в Україні. За останні десятиріччя тут були створені сорти троянди ефіроолійної Лань і Аура, які відрізняються від раніше створених сортів високим врожаєм квіток та збором ефірної олії, а також перевершують їх за більшістю інших господарсько-корисних ознак.

Сьогодні селекція троянди ефіроолійної спрямована на виведення високоврожайних та високоолійних сортів з підвищеним вмістом в ефірній олії терпенових спиртів, зимостійких та стійких до захворювань. Складність вирішення завдань визначає використання для цих цілей поряд з традиційними селекційними прийомами нових підходів, які дозволяють збагатити селекцію ефективними допоміжними методами. Такі підходи можуть базуватися на вивченні фізіологічних особливостей морфогенезу та використанні комплексу методів культури ізольованих клітин, тканин і органів рослин in vitro (Бутенко, 1964; Калінін та ін., 1980).

Перші дослідження з культури тканин троянди ефіроолійної було розпочато близько 15 років тому (Семенова, 1986; Мещерякова, 1981). Проте об'єктами цих досліджень були раніше створені сорти. Нові сорти, а також перспективні селекційні зразки, створені останніми роками, зовсім не залучалися до таких досліджень, а застосування до них раніше розроблених експериментальних підходів малоефективне, тому що процеси, які відбуваються in vitro, значною мірою детерміновані генотипом. У зв'язку з цим є актуальним дослідження фізіологічних основ регуляції морфогенезу в культурі ізольованих тканин і органів нових перспективних сортів та селекційних зразків троянди ефіроолійної з метою розробки на цій основі ефективних методів мікророзмноження. Розроблені методи можуть бути реалізовані для масового розмноження унікальних селекційних зразків, а також перспективних сортів з метою їх прискореного впровадження у виробництво.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження були складовою частиною державної програми “Ефіроолійні культури” та виконувалися відповідно до тематичного плану Інституту ефіроолійних і лікарських рослин за темою 01.20 “Розробити методи клонального мікророзмноження для одержання посадкового матеріалу перспективних ефіроолійних і лікарських рослин” (№ державної реєстрації 0194U023836).

Мета і завдання дослідження. Мета досліджень - вивчити фізіологічні особливості регуляції морфогенезу в культурі ізольованих тканин та органів троянди ефіроолійної і розробити методики мікророзмноження перспективних сортів та селекційних зразків на основі техніки in vitro. Відповідно до поставленої мети вирішувалися такі основні завдання:

- вивчити особливості регуляції морфогенезу в культурі тканин і органів, встановити залежність цього процесу від генотипу, типу експланту, складу живильних середовищ та умов культивування;

- підібрати типи та концентрації фітогормонів для розвитку мікропагонів та індукції множинного пагоноутворення в культурі ізольованих меристем;

- визначити оптимальні умови коренеутворення меристемних мікропагонів;

- вивчити можливість мікророзмноження на основі поєднання ембріокультури з множинним пагоноутворенням in vitro;

- оптимізувати режим адаптації рослин-регенерантів до звичайних умов вирощування;

- дослідити особливості калюсогенезу в культурі соматичних тканин in vitro і встановити залежність цього процесу від генотипу, типу експланту та складу живильного середовища;

Об'єкт дослідження - процеси морфогенезу в умовах контрольованого експерименту in vitro.

Предмет дослідження – фактори, що детермінують клональне мікророзмноження троянди ефіроолійної.

Методи дослідження. В основу виконання роботи були покладені методи культури ізольованих тканин і органів рослин (Бутенко, 1964; Калінін та ін., 1980). При проведенні цитологічних досліджень використовували загальноприйняті методи, викладені в спеціальних посібниках (Паушева, 1980). Для оцінки достовірності отриманих результатів проводилася статистична обробка даних з використанням пакету програм Microsoft Office.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено порівняльне вивчення особливостей морфогенезу в культурі ізольованих тканин та органів перспективних сортів Лань та Аура і селекційних зразків (№ 782, № 2030, № 2160, № 7806) троянди ефіроолійної. Отримані результати розширюють наявні на сьогоднішній день уявлення про гормональну регуляцію морфогенезу видів роду Rosa в умовах in vitro.

Досліджено фізіологічні особливості клонального мікророзмноження троянди ефіроолійної. Вперше для конкретних генотипів (сорт Аура, селекційні зразки № 782, № 2030, № 2160, № 7806) встановлено залежність процесу морфогенезу в культурі ізольованих меристем від сезонності, місцезнаходження меристем у межах пагону, розміру експланту та типу і концентрації фітогормонів у живильних середовищах. На широкому спектрі генотипів експериментально доведено, що присутність у живильному середовищі бензиламінопурину (0,5- 3,0 мг/л) є головним чинником, що визначає розвиток ізольованих меристем на початковому етапі культивування та індукцію множинного пагоноутворення. На етапі укорінення меристемних мікропагонів виявлено перевагу індолілмасляної кислоти (25 і 50 мг/л) порівняно до інших ауксинів.

Вперше для троянди ефіроолійної показано можливість мікророзмноження на основі поєднання ембріокультури з адвентивним пагоноутворенням in vitro. Оптимізовано умови одержання калюсних культур з листкових та стеблових сегментів, подано їхню цитологічну характеристику.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено методику клонального мікророзмноження перспективних генотипів троянди ефіроолійної на основі культури ізольованих меристем in vitro. Методика може служити експериментальною основою при створенні технології клонального мікророзмноження і бути використаною для клонування унікальних генотипів у селекції, а також як ефективний допоміжний засіб для одержання посадкового матеріалу нового сорту Аура. На основі розробленої методики отримано рослини-регенеранти троянди ефіроолійної, які передано у селекційній процес для подальшого вивчення. Окремі положення дисертаційної роботи використовуються при читанні спецкурсу "Клональне мікророзмноження рослин" у Таврійському національному університеті ім. В.І. Вернадського (м. Сімферополь).

Особистий внесок здобувача полягав у самостійній розробці та виконанні науково-дослідної програми, аналізі наукової літератури, отриманні та обробці експериментальних даних, підготовці наукових статей та оформленні дисертаційної роботи. Разом з науковим керівником визначено об'єкти досліджень, проведено освоєння методик та розробку структури дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на міжнародній конференції "Современные проблемы беспочвенного культивирования растений" (Ереван, 1999), на ХII Міжнародній науковій конференції "Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанiчних закладах i дендропарках Євразiї" (Полтава, 2000), 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology (Budapest, 2000), на міжнародній науковій конференції "Проблеми квітництва та декоративного садівництва” (Ялта, 2000), на VIII Міжнародній конференції "Сучасні наукові дослідження в садівництві" (Ялта, 2000), на I Республіканській конференції молодих вчених Криму "Актуальні питання сучасної біології" (Сімферополь, 2000), на Всеукраїнській конференції молодих вчених "Актуальні питання сучасного природознавства" (Сімферополь, 2001), на засіданнях лабораторії клітинної біології та вченої ради Інституту ефіроолійних і лікарських рослин (1997-2001).

Публікації з теми дисертації. Матеріали дисертації відображено в 11 наукових публікаціях, з них 3 - статті в провідних фахових виданнях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зi вступу, 5 розділів, висновків та рекомендацій з практичного використання результатів досліджень. Роботу викладено на 162 сторінках, вона містить 15 таблиць і 30 малюнків. Список літератури включає 219 джерел, з них 136 - вітчизняних авторів і
83 - зарубіжних дослідників.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ МОРФОГЕНЕЗ ТА КЛОНАЛЬНЕ МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ВИДІВ РОДУ ROSA

Проведено аналіз опублікованих у вітчизняній і зарубіжній літературі даних з біології та традиційних методів розмноження троянди ефіроолійної. Особливу увагу приділено питанням фізіології клонального мікророзмноження видів роду Rosa на основі техніки in vitro (Семенова, 1986; Мещерякова, 1981). Розглянуто літературні дані, що стосуються особливостей калюсогенезу в культурі ізольованих тканин ефіроолійних та декоративних сортів троянди, а також можливості отримання рослин-регенерантів з калюсних культур. На основі узагальнення та критичного аналізу даних літератури розроблено програму досліджень з теми дисертації.

ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом для проведення досліджень служили сорти та перспективні селекційні зразки троянди ефіроолійної: Лань (сорт, рекомендований до районування в Криму, використовуваний у якості контролю), Аура, № 782, № 2030, № 2160, № 7806. Рослини вирощували в польових умовах на колекційній ділянці Інституту ефіроолійних і лікарських рослин. Як експланти для введення в ізольовану культуру використовували меристеми, вегетативні бруньки, зародки, а також листкові та стеблові сегменти молодих паростків.

Стерилізацію рослинного матеріалу і введення експлантів в ізольовану культуру проводили в ламінарному боксі КПГ-1. Підготовка лабораторного посуду, інструментів та приготування живильних середовищ для роботи в стерильних умовах виконували за методиками, загальноприйнятими у дослідженнях з культури ізольованих клітин, тканин та органів рослин (Бутенко, 1964; Калінін та ін., 1980). Для культивування експлантів використовували хімічні пробірки 1,5 х 16 см з об’ємом живильного середовища 10 мл і колби Єрленмейєра об’ємом 100 мл, що містять 20 - 25 мл живильного середовища.

Експланти культивували на модифікованих живильних середовищах Мурасіге і Скуга (МС), Рандольфа - Кокса і Уайта, доповнених тіаміном, піридоксином, нікотиновою кислотою, аскорбіновою кислотою, мезоінозитом та цукрозою. В якості регуляторів росту використовували бензиламінопурин (БАП), кінетин, зеатин, індолілоцтову кислоту (ІОК), нафтілоцтову кислоту (НОК), індолілмасляну кислоту (ІМК), гіберелову кислоту (ГК). Залежно від конкретних завдань дослідження культивування проводили на агаризованих та рідких живильних середовищах. Культуральний посуд з експлантами утримували в умовах термостатованого приміщення з температурою 25 - 27оС, освітленістю 2000 - 3000 лк, 16-годинним фотоперіодом та відносною вологістю повітря 60 - 70 %.

Для цитологічних досліджень калюсні культури фіксували в суміші Карнуа (Паушева, 1980), а також використовували живий матеріал. Для приготування тимчасових препаратів фрагменти калюсу занурювали в 10-процентний розчин пектинази і витримували при температурі 27оС протягом 6 - 12 годин. Після проведення мацерації калюсні тканини роздавлювали на предметному склі і фарбували 0,1-процентним розчином метиленового синього протягом 10 хвилин. Поряд з цим дослідження морфології калюсних клітин проводили на нефарбованих препаратах методом інтерференційного контрасту (Бродський, 1966). Для виявлення ліпідів у калюсних клітинах використовували фарбування суданом III (Пірс, 1962). Для виявлення крохмальних зерен препарати досліджували в поляризованому світлі, при цьому крохмальні зерна виявлялися за подвійною променезаломлюваністю. Цитологічні дослідження проводили на мікроскопі "Люмам І-2" і МРI-5. Препарати фотографували на фотоплівку "Konica - 200" за допомогою мікрофотонасадки МФНЕ-1. Обробку фотоматеріалів проводили за стандартною процедурою.

Статистичну обробку результатів експериментальних досліджень виконували за допомогою пакету прикладних програм Microsoft Office для Windows.

КЛОНАЛЬНЕ МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ТРОЯНДИ ЕФІРООЛІЙНОЇ
НА ОСНОВІ КУЛЬТУРИ ІЗОЛЬОВАНИХ МЕРИСТЕМ
IN VITRO

Стерилізація рослинного матеріалу і одержання асептичної культури

З метою оптимізації умов одержання асептичних культур троянди ефіроолійної використовували поверхневу обробку рослинного матеріалу розчинами діациду, сулеми, брадофену та етанолу. Кращі результати були отримані при використанні ступінчастої стерилізації, за якої на першому етапі рослинний матеріал обробляли 50-процентним розчином препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім 70-процентним етанолом протягом 10 хвилин.

Такий спосіб стерилізації забезпечував найбільшу життєздатність експлантів та найменший відсоток інфікованості (табл. 1). Кількість інфікованих експлантів складала від 11 % (сорт Аура) до 15 % (зразок № 7806), а життєздатність від 70 % (зразок № 782) до 80 % (сорт Аура). Керуючись отриманими експериментальними даними, подальша робота по введенню експлантів троянди ефіроолійної в ізольовану культуру базувалася на використанні ступінчастої стерилізації рослинного матеріалу.

Таблиця 1

Інфікованість та життєздатність експлантів троянди ефіроолійної при використанні різних способів стерилізації

Сорти

і зразки | Діацид

(0,1 %)

5 хв. | Сулема

(0,1 %)

5 хв. | Брадофен

(50 %)

15 хв. | Брадофен (50%)

+ етанол (70%)

5 +10 хв.

інфі-

кова-

ність,

% | життє-здат-ність,

% | інфі-

кова-

ність,

% | життє-здат-ність,

% | інфі-

кова-

ність,

% | життє-здат-ність,

% | інфі-

кова-

ність,

% | життє-здат-ність,

%

Аура | 27,0±1,3 | 40,5±2,3 | 31,0±3,1 | 40,0±1,5 | 17,0±2,8 | 50,1±2,6 | 11,0±1,4 | 80,0±2,7

Лань | 25,0±3,2 | 40,0±1,5 | 39,7±0,7 | 41,9±1,8 | 21,0±3,1 | 58,2±2,9 | 14,2±2,2 | 75,0±3,5

№ 782 | 21,0±1,6 | 39,0±3,7 | 39,0±2,1 | 38,0±1,1 | 18,0±1,9 | 51,0±2,3 | 12,0±1,0 | 70,0±1,2

№ 7806 | 23,0±2,2 | 37,0±2,4 | 34,0±2,3 | 36,5±1,4 | 19,0±2,2 | 52,3±2,7 | 15,1±1,9 | 74,0±1,4

№ 2030 | 24,0±2,5 | 38,0±1,9 | 37,0±1,9 | 39,0±2,7 | 18,5±2,4 | 53,0±1,8 | 14,0±1,7 | 71,0±2,8

№ 2160 | 21,0±1,8 | 36,0±2,1 | 31,0±2,4 | 38,2±2,6 | 20,0±3,7 | 54,0±1,5 | 13,4±3,2 | 77,0±1,6

Вплив сезонності, місцеположення та розміру експланту на розвиток ізольованих меристем

Дослідження показали, що на етапі введення в культуру життєздатність експлантів і розвиток меристем всіх сортів та зразків троянди ефіроолійної значною мірою залежали від строку взяття вихідного матеріалу. Кращий розвиток мікропагонів спостерігався при ізоляції та експлантації меристем на живильне середовище в другій половині липня - на початку серпня і складав у сорта Лань - 80 %, Аура - 75 %, у зразка № 782 - 70 %, у № 7806 -74 %, а у зразків № 2160 і № 2030 - 78 і 69 % відповідно. Більш високою життєздатністю і кращим розвитком відрізнялися меристеми, ізольовані з вегетативних бруньок верхньої та середньої зон паростків, порівняно до меристем, взятих з бруньок нижньої зони. У зв'язку з цим вся подальша робота по культурі ізольованих меристем троянди ефіроолійної проводилася з урахуванням виявленої закономірності.

Особливості розвитку ізольованих меристем in vitro

Дослідження гормональної регуляції морфогенезу у культурі ізольованих меристем показало, що найбільш ефективним для розвитку експлантів на початковому етапі культивування виявився БАП. На модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, що містять 0,1-3,0 мг/л цього цитокінину, ізольовані меристеми збільшувалися в розмірах і починалася регенерація мікропагонів. Для більшості зразків (№ 782, № 2030, № 2160) та сорту Лань оптимальна концентрація БАП на першому етапі культивування складала 1,0 мг/л. Проте для сорту Аура і зразка № 7806 оптимальною виявилася більш низька концентрація БАП - 0,5 мг/л. Дослідження показали, що культивування ізольованих меристем на модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, доповнених ГК у концентрації 1,0 мг/л, призводило до стимулювання розвитку мікропагонів. Через один місяць культивування на цьому живильному середовищі у всіх сортів та зразків висота мікропагонів збільшувалася в середньому в 4,2 - 4,8 раза, при цьому вони зберігали нормальну морфологію.

Спеціального вивчення вимагало питання про вплив ауксинів на ріст та розвиток меристем різних сортів та зразків троянди ефіроолійної. Було встановлено, що внесення в живильне середовище НОК у концентраціях від 0,1 до 2,0 мг/л на фоні постійного вмісту БАП (0,5 - 1,0 мг/л) викликало уповільнення росту мікропагонів у всіх сортів та зразків залежно від збільшення концентрації ауксину. У процесі виконання цієї роботи було встановлено, що необхідним компонентом живильних середовищ для регенерації меристем троянди ефіроолійної є інозит. Кращий розвиток мікропагонів відзначався на модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, що містять інозит у концентраціях 100,0 і 200,0 мг/л (залежно від генотипу).

Власне мікророзмноження in vitro

Процес мікророзмноження сортів та зразків троянди ефіроолійної значною мірою залежав від складу використовуваного живильного середовища. У кожному конкретному випадку були виявлені розходження в інтенсивності росту мікропагонів та в особливостях утворення додаткових паростків залежно від типу та концентрації екзогенних фітогормонів. Як основний засіб розмноження троянди на етапах субкультивування застосовували зняття апікального домінування та індукцію розвитку пазушних меристем під впливом екзогенного цитокінину. Вивчався вплив БАП у концентраціях 0,1; 0,5; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мг/л на індукцію додаткових мікропагонів. Індукція множинного пагоноутворення у всіх сортів та зразків троянди ефіроолійної спостерігалася на 3-му субкультивуванні. Утворення додаткових паростків та початок мікророзмноження було відзначене на 4-му субкультивуванні при концентрації БАП у живильному середовищі 0,8; 1,0 і 3,0 мг/л. Найбільший коефіцієнт розмноження (КР) у сортів та зразків троянди ефіроолійної спостерігався на живильних середовищах, які містять БАП 1,0 і 3,0 мг/л на 5-му субкультивуванні. У сорта Аура коефіцієнт розмноження склав 10,8 при концентрації БАП 1,0 мг/л, у зразка № 782 - 6,3 при концентрації БАП З,0 мг. У зразків № 7806, № 2030 і № 2160 коефіцієнт розмноження складав 9,6; 5,0; 4,5 при концентрації БАП у живильному середовищі 1,0 мг/л і 3,0 мг/л. Проте у сорта Лань максимального коефіцієнту розмноження 5,9 було досягнуто на 4-му субкультивуванні на середовищі, що містить БАП у концентрації 1,0 мг/л. (табл. 2). При подальшому субкультивуванні мікропагонів сортів та зразків троянди ефіроолійної та використанні тих же концентрацій БАП у середовищі, здатність до розмноження знижувалася. Таким чином, в результаті досліджень було підібрано умови індукції множинного пагоноутворення сортів та зразків троянди ефіроолійної і виявлено деякі особливості цього процесу залежно від генотипу та концентрації БАП у живильному середовищі.

Укорінення мікропагонів троянди ефіроолійної

Укорінення мікропагонів є одним з найбільш складних етапів при клональному мікророзмноженні троянди ефіроолійної. В цій роботі для індукції коренеутворення використовували різні прийоми: внесення препаратів групи ауксинів до складу живильних середовищ, обробку базальних ділянок мікропагонів ауксинами з подальшим культивуванням на живильних середовищах, що не містять регуляторів росту, замочування та обробку базальних зон мікропагонів препаратом гумісол.

Вивчено вплив різних ауксинів (ІМК, ІОК, НОК) у концентраціях від 0,2 до 2,0 мг/л на процес коренеутворення у всіх сортів та зразків троянди ефіроолійної. Кращі результати було отримано при перенесенні мікропагонів на модифіковані живильні середовища Мурасіге-Скуга, доповнені ІМК у концентрації від 0,2 до 2,0 мг/л. Водночас для ряду сортів та зразків вдалося підвищити частоту укорінення мікропагонів за рахунок обробки їхніх базальних частин розчином ІМК з подальшим культивуванням на живильному середовищі без ауксинів.

Таблица 2Таблиця 2

Коефіцієнт розмноження сортів та зразків троянди ефіроолійної залежно від концентрації БАП в поживному середовищі та кількості субкультивувань

Сорти, зразки | Кількість субкультивувань | 3 | 4 | 5 | 6 | концен-трація БАП,

мг/л | КР | довжина

мікро-пагону,

мм | концен-трація БАП,

мг/л | КР | довжина

мікро-пагону,

мм | концен-трація БАП,

мг/л | КР | довжина

мікро-пагону,

мм | концен-трація БАП,

мг/л | КР | довжина

мікро-пагону,

мм | Аура | 0,5 | 1,2 | 28,0 | 0,8 | 5,6 | 28,7 | 0,8 | 8,3 | 28,8 | 0,8 | 3,3 | 28,9 | 1,0 | 5,8 | 28,9 | 1,0 | 10,8 | 29,0 | 1,0 | 3,8 | 29,2 | 3,0 | 5,2 | 28,5 | 3,0 | 6,9 | 28,9 | 3,0 | 4,0 | 28,9 | Лань |

1,0 | - | 29,5 | 0,8 | 4,3 | 29,2 | 0,8 | 4,5 | 29,5 | 0,8 | 2,9 | 29,4 | 1,0 | 5,9 | 29,7 | 1,0 | 5,0 | 29,8 | 1,0 | 3,0 | 29,9 | 3,0 | 4,9 | 29,5 | 3,0 | 5,3 | 29,7 | 3,0 | 3,2 | 29,7 | № 782 | 0,5 | 1,3 | 24,5 | 0,8 | 4,8 | 24,6 | 0,8 | 5,4 | 24,9 | 0,8 | 2,1 | 24,9 | 1,0 | 5,0 | 24,8 | 1,0 | 5,9 | 25,8 | 1,0 | 2,8 | 25,3 | 3,0 | 5,2 | 25,0 | 3,0 | 6,3 | 25,5 | 3,0 | 2,5 | 25,7 | № 7806 | 1,0 | - | 27,3 | 0,8 | 3,7 | 27,7 | 0,8 | 6,1 | 27,9 | 0,8 | 2,4 | 27,9 | 1,0 | 4,0 | 27,8 | 1,0 | 9,6 | 28,0 | 1,0 | 2,0 | 28,3 | 3,0 | 4,5 | 28,0 | 3,0 | 7,0 | 28,2 | 3,0 | 2,2 | 28,7 | № 2030 | 1,0 | - | 26,9 | 0,8 | 3,5 | 26,9 | 0,8 | 4,5 | 27,0 | 0,8 | 1,5 | 27,1 | 1,0 | 4,0 | 27,0 | 1,0 | 5,0 | 27,3 | 1,0 | 2,3 | 27,4 | 3,0 | 4,1 | 27,1 | 3,0 | 4,2 | 27,5 | 3,0 | 2,0 | 27,7 | № 2160 | 1,0 | - | 27,8 | 0,8 | 3,0 | 28,0 | 0,8 | 3,8 | 28,3 | 0,8 | 2,7 | 28,5 | 1,0 | 3,7 | 28,1 | 1,0 | 4,0 | 28,4 | 1,0 | 2,5 | 28,7 | 3,0 | 4,0 | 28,3 | 3,0 | 4,5 | 28,6 | 3,0 | 1,7 | 28,8 |

Підсумовуючи результати досліджень з індукції коренеутворення, слід зазначити, що сорти та зразки троянди ефіроолійної за здатністю до укорінення можна поділити на дві групи. До першої групи ввійшли сорти Аура і Лань, а також зразок № 7806, що характеризувалися підвищеною здатністю до укорінення порівняно до інших зразків. Укорінення мікропагонів сортів Аура і Лань було найкращим при замочуванні їхніх базальних частин у розчині ІМК (25 і 50 мг/л) протягом 4 годин. Застосування такого підходу сприяло максимальному укоріненню мікропагонів, що досягало у названих вище сортів 88 і 75 % відповідно. Водночас зразок № 7806 характеризувався найбільшою здатністю до укорінення (до 90 %) при пересаджуванні мікропагонів на живильне середовище, що містить 1,0 мг/л ІМК, без попередньої обробки в розчині ауксину.

Другу групу склали зразки № 782 № 2160 і № 2030, здатність до ризогенезу в яких була виражена меншою мірою. Оптимальне укорінення мікропагонів цих зразків троянди ефіроолійної було досягнуто також за допомогою методу замочування базальних частин мікропагонів у розчині ІМК (25 і 50 мг/л) протягом 4 годин з подальшим культивуванням на середовищі без ауксинів. При цьому для зразків № 2030 і № 782 найбільш високого рівня укорінення
(72 і 35%) було досягнуто при культивуванні мікропагонів на рідкому живильному середовищі. Максимальний відсоток укорінення мікропагонів у зразка № 2160 (68 %) спостерігався при використанні агаризованого живильного середовища.

Таким чином, проведені дослідження дозволили підібрати умови для укорінення меристемних паростків різних сортів та зразків троянди ефіроолійної іn vitro. При цьому ефективним експериментальним підходом було замочування базальних частин мікропагонів в розчинах ІМК (25 і 50 мг/л) протягом 4 годин з подальшим культивуванням на модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга без ауксинів.

Інший експериментальний підхід полягав у використанні для замочування базальних зон мікропагонів препарату гумісол. На підставі отриманих експериментальних даних було зроблено висновок, що гумісол впливав на характер розвитку кореневої системи, збільшував довжину та кількість коренів, а також сприяв, в остаточному підсумку, кращій адаптації рослин до нестерильних умов. Проте за частотою укорінення мікропагонів цей препарат поступався дії ІМК.

У процесі виконання роботи проводився аналіз впливу на процес коренеутворення саліцилової кислоти (5,0; 10,0; 15,0 мг/л). Дослідження показали, що введення до складу живильного середовища саліцилової кислоти разом з ІМК (1,0 мг/л) сприяло підвищенню частоти коренеутворення у зразків № 782, № 2030 і № 2160. Збільшення частоти укорінення на 4,6 - 5,5 % було досягнуто у цих зразків при концентрації саліцилової кислоти 5,0 мг/л. Особливо слід зазначити, що введення до живильного середовища саліцилової кислоти сприяло не лише певному підвищенню частоти коренеутворення, але й стимуляції росту кореневої системи.

Адаптація рослин-регенерантів до звичайних умов вирощування

Заключним етапом клонального мікророзмноження є адаптація рослин до звичайних умов вирощування. У наших дослідженнях було вивчено вплив різних субстратів на приживлюваність рослин, розвиток кореневої системи, ріст та подальший розвиток надземної частини. Як субстрати при переведенні рослин у нестерильні умови були використані такі суміші: торф: керамзит (1:1), торф: керамзит: пісок (1:1:1), керамзит: пісок: листова земля (1:1:2). Для більшості сортів та зразків оптимальним виявився субстрат, що складається з торфу, керамзиту і піску. При використанні цього субстрату приживлюваність рослин складала 95 - 100 %, вони відрізнялися добрим розвитком надземної частини і кореневої системи. У процесі адаптації отриманих in vitro рослин до звичайних умов вирощування використовували загальноприйняті методичні підходи. В перші дні адаптації рослини утримували в термостатованому приміщенні при температурі 25 - 27оС в умовах підвищеної вологості, а через 10-14 днів переводили на звичайний режим вирощування в закритому грунті.

ЕМБРІОКУЛЬТУРА ТРОЯНДИ ЕФІРООЛІЙНОЇ

Вплив генотипу та складу живильного середовища на розвиток проростків
у культурі ізольованих зародків

Для виконання експериментальної роботи використовували зародки на торпедоподібній стадії, отримані від вільного запилення сортів Аура і Лань, а також зразків № 782, № 7806, № 2030, № 2160. Культивування зародків на агаризованих живильних середовищах Уайта, Рандольфа-Кокса і Мурасіге-Скуга показало, що максимальний вихід проростків спостерігався при використанні живильного середовища Рандольфа-Кокса. Таким чином, результати наших досліджень погоджуються з даними, отриманими раніше О.Ф. Семеновою (1986), які показали перевагу вирощування ізольованих зародків від різних комбінацій схрещування на безгормональному живильному середовищі. У нашій роботі при використанні живильного середовища Рандольфа-Кокса у всіх сортів і зразків троянди ефіроолійної були отримані нормально розвинуті проростки. Найбільший вихід проростків спостерігався при культивуванні зародків, отриманих від вільного запилення зразка № 7806 і складав 67 %. У інших сортів і селекційних зразків вихід проростків знаходився в межах від 30 до 57 % залежно від генотипу.

Індукція множинного пагоноутворення

Один з головних етапів нашої роботи полягав у підборі умов для індукції множинного пагоноутворення на початкових етапах проростання ізольованих зародків і ювенільних стадій розвитку проростків різних сортів та зразків троянди ефіроолійної. В результаті підбору живильних середовищ, співвідношення фітогормонів та оптимальних умов культивування було розроблено експериментальний підхід до індукції множинного пагоноутворення in vitro. Цей підхід грунтувався на культивуванні зародків на живильниму середовищі Рандольфа-Кокса з подальшим перенесенням утворюваних мікропагонів на модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, доповнене БАП у концентрації 1,0 мг/л. При використанні цього експериментального підходу у всіх сортів та зразків спостерігалося закладення адвентивних бруньок, які потім розвивалися в додаткові мікропагони, кількість яких складала від 1,5 у зразку № 782 до 4,0 у зразку № 7806.

При використанні ембріокультури у поєднанні з адвентивним пагоноутворенням значно легше вирішувалося завдання укорінення утворених мікропагонів, ніж з меристемною культурою. Дослідження показали, що висока частота укорінення мікропагонів, отриманих в культурі ізольованих зародків, спостерігалася при перенесенні їх на модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, що містило ІМК у концентрації 1,0 мг/л і досягала від 71 % до 95 % залежно від генотипу. Отримані в умовах in vitro рослини адаптували до звичайних умов за тією ж схемою, що й рослини, отримані в культурі ізольованих меристем.

ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ ОДЕРЖАННЯ КАЛЮСНИХ КУЛЬТУР ТРОЯНДИ ЕФІРООЛІЙНОЇ

Вплив типу експланту та складу живильного середовища на індукцію калюсогенезу і характер росту калюсних культур

Проведені дослідження показали, що частота та інтенсивність процесу калюсоутворення в культурі тканин троянди ефіроолійної залежали від генотипу, типу експланту, а також від співвідношення типів та концентрації фітогормонів у живильному середовищі. В ході попередніх досліджень з культури соматичних тканин троянди ефіроолійної були використані різні типи експлантів: сегменти стебла, листка та листкового черешка, вегетативні бруньки. Ці дослідження дозволили встановити, що оптимальними експлантами для одержання калюсних культур були стеблові і листкові сегменти (табл. 3).

Аналіз експериментальних даних показав, що у стеблових сегментів здатність до калюсогенезу проявлялася більш активно, ніж у листкових сегментів. Культивування in vitro сегментів з базальної, медіальної та дистальної зон листка показало, що найбільш активний калюсогенез спостерігався у експлантів з базальної зони. Сегменти медіальної зони листка мали слабку здатність до калюсоутворення, а сегменти дистальної зони практично не утворювали калюс.

Здатність до калюсоутворення у всіх генотипів троянди ефіроолійної сильно варіювала протягом сезону. Відбір та введення в культуру in vitro первинних експлантів у листопаді-березні позитивних результатів не дали. При введенні експлантів у культуру у квітні - травні, вересні - жовтні частота калюсоутворення знаходилася на низькому рівні - до 13 %. Проте у експлантів, введених в ізольовану культуру у липні - серпні, частота калюсоутворення була максимальною і сягала залежно від генотипу
66 - 87 %.

Таблиця 3*

Частота калюсогенезу в культурі соматичних тканин троянди ефіроолійної залежно від генотипу, типу експланту та складу живильного середовища

Сорти

і зразки | Живильне середовище | Тип експланту | Частота калюсоутворення, %

Аура

Лань

№ 782

№ 7806

№ 2030

№ 2160 | МС 25

МС 27

МС 22

МС 29

МС 30

МС 26 | Сегменти листка | 70,5 ± 2,0

79,2 ± 1,7

77,8 ± 0,9

68,1 ± 1,5

78,9 ± 0,7

69,7 ± 0,8

Аура

Лань

№ 782

№ 7806

№ 2030

№ 2160 | МС 23

МС 25

МС 28

МС 24

МС 22

МС 21 | Сегменти стебла | 74,3 ± 0,5

84,9 ± 0,7

80,5 ± 0,6

70,1 ± 1,3

82,4 ± 0,4

73,4 ± 1,6

Аура

Лань

№ 782

№ 7806

№ 2030

№ 2160 | МС 29

МС 30

МС 28

МС 26

МС 25

МС 30 | Сегменти черешка | 45,0 ± 1,2

40,1 ± 0,9

38,8 ± 0,2

41,5 ± 0,4

33,2 ± 0,3

37,3 ± 1,1

Аура

Лань

№ 782

№ 7806

№ 2030

№ 2160 |

МС 29

МС 27

МС 23

МС 22

МС 21

МС 25 | Вегетативні бруньки | 66,5 ± 0,7

68,9 ± 1,5

70,1 ± 1,3

69,3 ± 0,8

56,2 ± 0,9

59,7 ± 1,2

* Дані наведено при культивуванні експлантів на оптимальних для кожного сорту та зразка модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга.

У процесі виконання роботи проводився аналіз впливу різних типів і концентрацій фітогормонів (кінетину, БАП, НОК, 2,4-Д) в модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга на частоту калюсоутворення в культурі листкових та стеблових сегментів. Максимальна частота калюсогенезу спостерігалася на живильних середовищах, що містять як ауксини, так і цитокінини. При використанні середовищ, що містять тільки ауксини або тільки цитокінини, калюсоутворення або взагалі не спостерігалося, або його частота знаходилася на дуже низькому рівні.

Таким чином, дослідження показали, що процес калюсогенезу в культурі тканин троянди ефіроолійної визначається наявністю в живильному середовищі як ауксинів, так і цитокінинів. При оптимальному співвідношенні зазначених регуляторів росту (БАП - 3,0 мг/л, 2,4-Д - 2,0 мг/л; БАП - 2,0 мг/л, НОК -
0,2 мг/л; кінетин - 1,0 мг/л, 2,4-Д - 1,0 мг/л; кінетин - 1,0 мг/л, НОК - 0,5 мг /л) у досліджуваних сортів та зразків троянди ефіроолійної спостерігалася максимальна частота калюсоутворення, а також максимальний приріст маси калюсу в I-II пасажах.

Цитологічні особливості калюсних культур троянди ефіроолійної

Калюсні культури сортів та зразків троянди ефіроолійної характеризувалися гетерогенністю за клітинним складом. В первинному та пасованому калюсах виявлялися клітини меристемного типу, паренхімні клітини різної форми та розмірів, запасальні клітини, а також елементи провідної системи.

Клітини меристемного типу відрізнялися від інших клітин калюсу малими розмірами, мали велике ядро, щільну цитоплазму та відносно слабко розвинуту систему вакуолів. При цьому цитоплазма рівномірно заповнювала весь клітинний об`єм, а ядро займало центральне положення. Клітини меристемного типу звичайно розташовувалися значними локальними скупченнями і часто були приурочені до елементів судинної системи. Осередки клітин меристемного типу були найчисельнішими в калюсних культурах I-III пасажів.

Основну масу калюсу складали клітини паренхімного типу, що помітно варіювали за розмірами - від відносно невеликих до гігантських і частіше мали округлу або овальну форму. Для них було характерним ексцентричне положення ядер та незначна кількість цитоплазми з добре розвинутою системою вакуолів.

Особливо слід зазначити наявність в калюсних культурах різних запасальних клітин. Ці клітини містили крохмальні зерна або ліпідні краплі. Запааючі клітини завжди виявлялися в калюсних культурах різних пасажів, що може служити непрямим доказом невисокої інтенсивності мобілізації запасних речовин на метаболічні та морфогенетичні процеси (Thorpe, Meier, 1972; Patel, Berlyn, 1983). В калюсних культурах троянди ефіроолійної досить добре розвинута провідна система. Доказом цього була наявність великої кількості трахеїд, які розташовувалися значними скупченнями, що складалися з декількох десятків клітин.

Зі збільшенням пасажу в калюсних культурах проявлялася, як правило, тенденція до зниження рівня цитологічної гетерогенності. Звичайно, це проявлялося у переважанні у дещо пізніших пасажах значних паренхімних клітин і зменшенні кількості клітин меристемного типу. Ймовірно, зі збільшенням тривалості культивування знижувалася здатність до повторної диференціації, що є однією з основних причин, яка призводить до гетерогенності калюсних культур за клітинним складом.

ВИСНОВКИ

1. Вивчено фізіологічні особливості морфогенезу в культурі ізольованих меристем та зародків різних сортів і перспективних селекційних зразків троянди ефіроолійної (Лань, Аура, № 7806, № 782, № 2160, № 2030). Встановлено, що спрямованість морфогенезу в умовах in vitro детерміновано генотипом, сезонністю та місцезнаходженням експланту, а також типом та концентрацією фітогормонів у живильному середовищі.

2. Встановлено, що розвиток ізольованих меристем та індукція множинного пагоноутворення in vitro у більшості досліджуваних генотипів залежить від присутності в живильному середовищі БАП у концентраціях (0,5-3,0 мг/л). При цьому максимальний коефіцієнт розмноження досягав від 1:4,5 у зразка № 2160 до 1:10,8 у сорта Аура за один цикл вирощування.

3. Дослідження показали, що найкраще укорінення мікропагонів сортів та селекційних зразків троянди ефіроолійної (35 – 90 %) було досягнуто при замочуванні їхніх базальних частин у водному розчині ІМК 25 та 50 мг/л протягом 4 годин з подальшим культивуванням на живильному середовищі без регуляторів росту.

4. Розроблено повний цикл клонального мікророзмноження троянди ефіроолійної (сорта Аура та перспективних селекційних зразків № 782, № 2030, № 2160, № 7806), починаючи від введення меристем в ізольовану культуру до одержання укорінених рослин, адаптованих до умов in vivo.

5.

6.

7. Максимальна частота калюсоутворення сортів та селекційних зразків троянди ефіроолійної (до 70 - 80 %) спостерігалася при культивуванні стеблових та листкових сегментів на модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, доповнених ауксинами та цитокінинами, причому концентрація цитокінину повинна бути однаковою або ж перевищувати концентрацію ауксину.

8. Калюсні культури, отримані зі стеблових та листкових сегментів, характеризувалися високим рівнем цитологічної гетерогенності та складалися з клітин меристемного типу, паренхімних клітин, елементів судинної системи, а також різних типів запасальних клітин, що містять крохмальні зерна та ліпіди.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Для розмноження нових перспективних генотипів троянди ефіроолійної (сорт Аура, селекційни зразки № 782, № 2030, № 2160, № 7806) рекомендується використовувати методику клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем in vitro як додатковий прийом до традиційних методів розмноження. Роботи по експлантації меристем на живильні середовища доцільно починати в другій половині липня - на початку серпня, виділяючи їх з верхньої та середньої частин паростка. Для розвитку ізольованих меристем та індукції множинного пагоноутворення рекомендується використовувати модифіковані живильні середовища Мурасіге-Скуга, доповнені БАП (0,5-3,0 мг/л), а для укорінення мікропагонів замочування їхніх базальних частин у розчині ІМК (25 і 50 мг/л) протягом 4 годин з подальшим культивуванням на безгормональному живильному середовищі. Для адаптації меристемних рослин до звичайних умов рекомендується використовувати субстрат, що складається з суміші торфу, керамзиту і піску (1:1:1), і вирощування протягом перших двох тижнів при