НУЖИНА НАТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.43; 612.45; 591.147

ЦИРКАДНА ДИНАМІКА СТРУКТУРНИХ ЗМІН ГІПОТАЛАМО-ГІПОФІЗАРНО-ГОНАДНОЇ СИСТЕМИ ТА ЕПІФІЗА ПТАХІВ ПІСЛЯ ВВЕДЕННЯ МЕЛАТОНІНУ ТА БЛОКАТОРІВ ДОФАМІНОВИХ РЕЦЕПТОРІВ

03.00.11.– цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор ДЗЕРЖИНСЬКИЙ Микола Едуардович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри цитології, гістології та біології розвитку

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

КВІТНИЦЬКА-РИЖОВА Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії морфології і цитології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

БОНДАРЕНКО Людмила Олександрівна, Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, завідувач лабораторії хроноендокринології

Провідна установа: Національний аграрний університет КМ України, м. Київ, кафедра гістології, цитології та ембріології

Захист дисертації відбудеться “16” лютого 2005 р. о 17 00 год. На засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26.001.38 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, Спецрада

Д 26.001.38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 14.01.2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О.В. Цимбалюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема вивчення механізмів регуляції репродуктивної системи, незважаючи на довготривале дослідження, залишається дуже актуальною. Відомо, що репродуктивна функція у птахів реалізується завдяки скоординованій роботі гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу. Разом із тим, гонадотропна функція гіпоталамуса перебуває під модулюючим впливом моноамінергічних систем та позагіпоталамічних структур головного мозку [Weesner G.D., 1992, Leret M.L., 1990]. Зокрема, узгодження активності репродуктивної системи з добовими й сезонними змінами пов’язують з гормоном епіфіза мелатоніном [Арушанян, 1992]. Проте, на даний час з’ясовані не всі аспекти дії цього гормону на структурно-функціональний стан гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи. У більшості випадків введення мелатоніну пригнічує репродуктивну систему піддослідних тварин [Olcese, 1995, Glass J.D., 1987]. Однак, в літературі зустрічаються і протилежні дані [Пустовалов, 2003]. І зовсім мало відомостей про те, яким чином здійснюється цей вплив.

Разом з тим, відомо, що певну роль в реалізації ефектів мелатоніну на репродуктивну систему відіграє дофамін (ДА). Слід зауважити, що в літературі є суперечливі та неоднозначні відомості стосовно регуляції гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу птахів дофамінергічною системою мозку. Одні дослідники відводять ДА активуючу роль [Е.В.Науменко з соавт., 1975], а інші – гальмівну [Tortonese DJ, 1995, Lacau-Mengido I.M., 1993]. Відомо також, що ефекти ДА на репродуктивну систему опосередковуються різними типами рецепторів; причому активація кожного з цих рецепторів часто веде до різних наслідків [Bertrand F, 1999, Youngren, 1998]. Результати ж досліджень, присвячені з’ясуванню ролі кожного з типів рецепторів, часто суперечливі.

Необхідність проведення комплексного дослідження регуляції мелатоніном функціональної активності гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу птахів полягає ще і в тому, що переважна більшість наявних робіт стосується ссавців. Тоді як кількість досліджень на птахах значно менша.

Зв’язок із науковими програмами. Робота виконана на кафедрі цитології, гістології та біології розвитку в рамках комплексної наукової програми Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Здоров’я людини”. Назва науково-дослідної теми: “Вивчення ролі моноамінергічних систем головного мозку в гіпоталамічному контролі стресорних реакцій у наднирниковій та щитовидній залозах та епіфізарної регуляції гонад в онтогенезі” (№ теми 01БФ033-02, № держреєстрації 0102 U 001161).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити циркадну динаміку структурних змін гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи та епіфіза птахів при введенні мелатоніну та блокаторів дофамінових рецепторів.

У зв’язку з цим поставлені наступні завдання:

З’ясувати морфо-функціональний стан гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи самців японських перепелів (Coturnix coturnix japonica) після введення мелатоніну в різні години доби.

Проаналізувати роль D1-, D2-дофамінових рецепторів в реалізації впливу мелатоніну на гіпоталамо-гіпофізарно-гонадну систему протягом доби.

Провести морфометричний аналіз добових змін структури супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та епіфіза птахів на фоні модуляції активності репродуктивної системи мелатоніном.

Дослідити роль дофамінергічної системи у функціонуванні епіфіза та супрахіазматичного ядра гіпоталамуса.

Об’єкт дослідження: нейроендокринна регуляція статевого дозрівання птахів.

Предмет дослідження: гістофізіологічна характеристика гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи та епіфіза птахів в нормі та під дією мелатоніну та блокаторів дофамінових рецепторів.

Методи дослідження: в роботі застосовано такі методи дослідження: гістологічні (світлова та електронна мікроскопія) та морфометричні (для кількісної оцінки морфологічних параметрів досліджуваних структур).

Наукова новизна одержаних даних. Вперше було зроблено порівняльну характеристику впливу одноразового введення мелатоніну на репродуктивну систему птахів вранці, вдень, ввечері та вночі. При цьому було встановлено, що введення мелатоніну вранці, ввечері та вночі викликає пригнічення гонад, а введення його вдень – стимуляцію гонад. Підтверджено, що мелатонін опосередковує свій вплив на репродуктивну систему птахів через дофамінергічну систему, однак вперше встановлено, що цей вплив відрізняється в різний час доби. Встановлено, що вранці та вдень мелатонін може опосередковувати свою дію як через D1-, так і через D2 дофамінові рецептори. Тоді як, ввечері в реалізації гальмівного впливу екзогенного мелатоніну на гонади беруть участь тільки D1 дофамінові рецептори. Також вперше виявлено, що зменшення сім’яних канальців вночі після введення мелатоніну не опосередковано дофаміновими рецепторами. Вперше був проведений морфометричний аналіз добових змін супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та епіфіза птахів та показано, що активуючий вплив екзогенного мелатоніну на епіфіз ввечері опосередкований переважно D1 дофаміновими рецепторами, а вночі – D2-рецепторами.

Практичне значення отриманих даних. Отримані результати насамперед поглиблюють розуміння механізмів нейроендокринної регуляції репродуктивної системи з боку дофамінергічної системи головного мозку та мелатоніну. Це може слугувати теоретичною передумовою для розробки оптимальніших режимів розмноження та регуляції статевого дозрівання сільськогосподарських птахів. Результати дослідження можуть бути використані у порівняльних дослідженнях взаємодії епіфіза та репродуктивної системи в різних класах хребетних тварин.

Матеріали даної дисертації впроваджені у спецкурси “Гістофізіологія нейроендокринної системи” та “Біологія постембріонального розвитку”, що читаються на кафедрі цитології, гістології та біології розвитку біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проаналізована спеціальна література по темі дисертації, проведена гістологічна та морфометрична обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних, а також написання роботи. Методика введення блокатора D1 дофамінових рецепторів в третій шлуночок мозку розроблялась спільно із асистентом кафедри цитології, гістології та біології розвитку к.б.н. Варенюком І.М. Планування експерименту, інтерпретація наукових положень і висновків проведено спільно з науковим керівником. У проведенні хронічного експерименту брали участь співробітники кафедри цитології, гістології та біології розвитку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, доповідались на XLI Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених "Студент і науково-технічний прогрес" (м. Новосибірськ, 2003), на конференції професорсько-викладацького складу біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, 2003), на міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів і молодих вчених "Шевченківська весна. Сучасний стан науки: досягнення, проблеми і перспективи розвитку" (м. Київ, 2003), на конференції професорсько-викладацького складу біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, 2004), на міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів і молодих вчених "Шевченківська весна. Сучасний стан науки: досягнення, проблеми і перспективи розвитку" (м. Київ, 2004), на VI Міжнародній науково-практичній конференції морфологів України (м. Львів, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт, із них: 4 статті у наукових фахових часописах та збірках наукових праць і 4 тези доповідей до наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, переліку умовних скорочень, 4 розділів (з яких 1 розділ присвячений огляду літератури, 1 – викладу матеріалів та методів досліджень і 2 – опису результатів дослідження та їх обговоренню), висновків та списку літератури. Робота викладена на 163 сторінках; вона ілюстрована 76 рисунками, серед яких є діаграми, схеми, мікрофотографії. Список літератури включає 331 джерело, серед яких 38 – з України та країн СНД і 293 – з інших зарубіжних країн. Дисертація містить 2 додатки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Відповідно до мети та завдань дослідження експеримент було проведено на 160-ти 5-тижневих самцях японських перепелів (Coturnix coturnix japonica). Птахів утримували в умовах одного віварію на стандартному раціоні. Світловий режим: 14 годин – світло (з 7 до 21 години), 10 годин – темрява (з 21 до 7 години).

У ході експерименту було створено 28 піддослідних груп, у кожній з яких було по 4-6 птахів. Птахам одноразово вводили в той або інший час доби мелатонін (вранці – о 7оо, вдень – о 13оо, ввечері – о 19оо або вночі – о 1оо) після того чи іншого препарату. В кожен з чотирьох періодів доби птахи були поділені на 7 груп залежно від препарату, який вводився:

1) Фізіологічний розчин (доза – 30 мкг/100 г маси тіла) (контроль). 2) Мелатонін (доза – 10 мкг/100 г маси тіла). 3) R(+)-SCH-23390 гідрохлорид (блокатор D1 дофамінових рецепторів (доза – 0,8 мкг/100 г маси тіла)). 4) R(+)-SCH-23390 гідрохлорид та мелатонін (в тих самих дозах). 5) Галоперидол (блокатор D2 дофамінових рецепторів (доза – 30 мкг/ 100 г маси тіла)). 6) Галоперидол та мелатонін (в тих самих дозах). 7) R(+)-SCH-23390 гідрохлорид потім галоперидол, а потім мелатонін (в тих самих дозах).

Мелатонін вводився перорально. Галоперидол вводили внутрішньом’язово, тоді як R(+)-SCH-23390 гідрохлорид вводили в порожнину третього шлуночка мозку за допомогою стереотаксичного прилада СЭЖ-3. Для чистоти досліду птахам 1, 2, 3 і 4 груп внутрішньом’язово вводили фізіологічний розчин (в дозі 30 мкг/100 г маси тіла), а також птахам 1, 2, 5 і 6 груп фізіологічний розчин вводили в порожнину третього шлуночка мозку (в дозі 0,002 мл/ на птаха).

Через 2 години після введення мелатоніну птахів декапітували.

Для ультраструктурних досліджень додатково був проведений дослід на 24 самцях 5-тижневих японських перепелів, яких утримували за аналогічних умов, що були описані вище. В ході експерименту було створено 8 піддослідних груп, в кожній з яких було по 3 тварини. Птахам одноразово вводили вдень – о 13оо або ввечері – о 19оо мелатонін після того чи іншого препарату. В кожен з двох періодів доби птахи були поділені на 1-4 групи описані вище.

Після декапітації птахів гіпоталамічну область мозку, аденогіпофіз, епіфіз та гонади фіксували для подальшої гістологічної обробки. Фіксація матеріалу здійснювалась у рідині Буена (гіпоталамічна область мозку, епіфіз та сім’яники), та в 10%-ному формаліні (аденогіпофіз). Після чого його заливали за стандартною методикою в парафін і виготовляли на санному мікротомі фронатальні серійні зрізи гіпоталамічної області мозку та зрізи сім’яників завтовшки 5 – 6 мкм, а аденогіпофіза та епіфіза – завтовшки 3 – 4 мкм.

Зрізи гіпоталамуса фарбували крезиловим фіолетовим по Нісслю. Активність нейроцитів дрібноклітинних ядер визначали за величиною клітинних ядер, кількістю та розмірами гранул нейросекрету у цитоплазмі. Зрізи аденогіпофіза фарбували альціановим синім, реактивом Шиффа та оранжем “G” за Herlant. Зрізи сім’яників та епіфіза фарбували гематоксиліном Бемера та еозином. На зрізах гіпоталамуса вимірювали діаметр ядер нейросекреторних клітин АЯ та СХЯ, на зрізах аденогіпофіза – площу перетину ядер гонадотропоцитів, на зрізах епіфіза – площу перетину ядер пінеалоцитів, на зрізах сім’яників вимірювали діаметр сім’яних канальців, та оцінювали активність сперматогенного епітелію.

Гістологічні препарати аналізували на світлооптичному мікроскопі за допомогою окуляр-мікрометра МОВ-1-15х, та пакета програм для морфометрії Promorph-Paradise (НВК "Єва", Київ). Мікрофотографії досліджених тканин робили за допомогою цифрової відеокамери Olympus та мікроскопа B41 Olympus.

Для електронномікроскопічного аналізу брали епіфіз, який обробляли по Уіклі. Фіксовані та зневоднені шматочки тканини заключали в суміш епону-812, аралдиту та DDSA. Потім з цих блоків прицільно виготовляли ультратонкі зрізи, які контрастувалися водним розчином уранілацетату та нітрату свинцю по Рейнольдсу. Відконтрастовані зрізи досліджувалися за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-125 К.

Статистичну обробку здійснювали методами варіаційної статистики за допомогою програмного забезпечення STATISTICA 5,0 for Windows. Порівнювали контрольні групи з піддослідними групами. Групи, яким вводили мелатонін разом з блокаторами дофамінових рецепторів, ми також порівнювали з групами, яким вводили лише мелатонін у відповідний період доби. Вірогідність різниці між такими групами оцінювали за t-критерієм Ст’юдента. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними серіями досліду при Р<0,05. Таким же чином порівнювались між собою групи з введенням одного препарату в різні години доби.

Результати дослідження та їх обговорення

Результати морфометричних досліджень показали, що введення мелатоніну вранці викликає різкий пригнічуючий вплив на сім’яники у Coturnix coturnix japonica. Також блокада D1-рецепторів окремо, як і в сукупності із введенням мелатоніну, викликає зниження функціональної активності на інших рівнях гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи відносно контрольної групи, про це свідчить зменшення значення середнього діаметра ядер нейронів АЯ гіпоталамуса та середньої площі перетину ядер гонадотропоцитів аденогіпофіза, а також зменшення показника середнього діаметра сім’яних канальців при введенні даних препаратів. Оскільки при введенні лише R(+)-SCH-23390 гідрохлориду, блокатора D1-рецепторів, спостерігається зниження активності гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу (табл. 1), то можна зробити висновок, що ДА вранці стимулює діяльність репродуктивного комплексу саме через D1 дофамінові рецептори. При цьому стимуляція відбувається починаючи з гіпоталамічного рівня. Разом з цим, при введенні R(+)-SCH-23390 гідрохлориду та мелатоніну спостерігається збільшення діаметрів сім’яних канальців порівняно з групою птахів, яким вводили мелатонін. Тобто гальмівна дія мелатоніну здійснюється за допомогою стимуляції ДА, який зв’язується з D1-рецепторами гіпофіза.

В той же час блокада D2-рецепторів галоперидолом не змінює морфологічну картину гонад, гонадотропоцитів гіпофіза та нейронів АЯ гіпоталамуса. Імовірно цю реакцію можна пояснити зниженням концентрації ендогенного мелатоніну у відповідний час доби. Оскільки блокада D2-рецепторів галоперидолом перед введенням мелатоніну викликає збільшення клітинних ядер нейроцитів АЯ гіпоталамуса та сім’яних канальців порівняно з такими у групі, якій вводили мелатонін, то можна припустити, що гальмівна дія мелатоніну на репродуктивну систему вранці опосередкована його стимулюючим ефектом на виділення ДА, який в подальшому пригнічує нейрони АЯ гіпоталамуса через D2-рецептори. При цьому сумісний вплив таких препаратів на гіпоталамо-гіпофізарно-гонадну систему є сильніший за дію мелатоніну та R(+)-SCH-23390 гідрохлориду, тобто можна зробити висновок, що мелатонін пригнічує репродуктивну систему переважно за допомогою D2-рецепторів. Збільшення діаметрів сім’яних канальців відбувається також при блокаді обох видів дофамінових рецепторів на тлі введення мелатоніну, однак менш інтенсивне.

Таким чином, очевидно, що частина ефектів мелатоніну на гіпоталамо-гіпофізарно-гонадну систему в ранкові години доби опосередкована його впливом на дофамінергічну систему головного мозку; причому дія ендогенного ДА, що виділився під впливом екзогенного мелатоніну, у цей період доби опосередкована як D1- так і D2-рецепторами. Негативна дія ДА через D1- рецептори на гонадотропоцити, можливо здійснюється через пролактин, оскільки відомо, що ДА через D1-рецептори стимулює виділення пролактину лактотропними клітинами гіпофіза, який у свою чергу має антигонадотропний вплив на гонадотропоцити.

З іншого боку, результати дослідження показали, що вранці введення мелатоніну або галоперидолу має активуючий вплив на СХЯ гіпоталамуса, про це свідчить збільшення діаметрів клітинних ядер нейроцитів СХЯ. Збільшення діаметрів ядер нейронів СХЯ гіпоталамуса після введення блокатора D1 дофамінових рецепторів разом з мелатоніном ймовірно викликано дією самого мелатоніну. Оскільки після введення таких препаратів не відбувається ніяких змін відносно групи з введенням лише мелатоніну. Разом з цим структура епіфіза в різних дослідних групах вранці залишалась незмінною. Отже ДА має гальмівний вплив через D2 дофамінові рецептори лише на гіпоталамічному рівні, а зв’язки СХЯ – епіфіз та епіфіз – репродуктивна система мабуть є неактивними в даний час доби.

Введення мелатоніну вдень має стимулюючий вплив на гіпофіз та сім’яники (рис. 1,б), а зменшення діаметра клітинних ядер нейроцитів АЯ гіпоталамуса (рис. 1,в) імовірно відбувається під впливом негативних зворотних зв’язків. Однак при блокаді D1 або D2 дофамінових рецепторів в нашому досліді спостерігається зменшення площі перетину ядер гонадотропоцитів аденогіпофіза, що свідчить про можливість ДА стимулюючим чином діяти на гіпофіз як через D1, так і через D2 рецептори. Оскільки в цей час доби кількість власного мелатоніну в організмі є малою, то його дія на гонади дуже незначна, і тому при блокаді дофамінових рецепторів без введення цього гормону були отримані результати, подібні до таких у контрольній групі. Тоді як, при введенні галоперидолу або R(+)-SCH-23390 гідрохлориду разом з мелатоніном відбувається зменшення діаметрів сім’яних канальців, сперматогенний епітелій яких складається переважно з сперматогоній, та спостерігається зниження активності аденогіпофіза порівняно з групою, якій вводили мелатонін. Останні результати ще раз підкреслюють дані, отримані після введення дофамінових блокаторів окремо. Пригнічення ж сім’яників вказує на можливість екзогенного мелатоніну активувати гонади опосередковано D1 дофаміновими рецепторами на гіпоталамічному рівні, та D2 дофаміновими рецепторами на гіпофізарному рівні.

Вплив ендогенного мелатоніну в цей час незначний, що пов’язано з його малою концентрацією, та низькою активністю епіфіза. Разом з цим, при блокаді обох дофамінових рецепторів та введенні мелатоніну взагалі не спостерігається змін на усіх рівнях регуляції репродуктивної функції відносно контролю. На нашу думку, це також вказує на те, що вдень мелатонін здатний діяти лише через дофамінергічну систему. Однак, щодо групи з введенням мелатоніну спостерігається пригнічення репродуктивної системи, що відповідає отриманим даним після введення мелатоніну з дофаміновими блокаторами поодинці.

Вдень ефекти після введення блокатора D1-рецепторів або мелатоніну, або введення цих препаратів разом на рівні епіфіза мають односпрямований характер з такими на рівні СХЯ гіпоталамуса. Разом з цим, введення галоперидолу окремо або разом з мелатоніном приводить до збільшення ядер нейронів СХЯ гіпоталамуса і не має ніякого впливу на структуру пінеалоцитів, що свідчить про стимуляцію екзогенним мелатоніном синтезу ДА, який пригнічує через D2-рецептори СХЯ незалежно від епіфіза.

Екзогенний мелатонін стимулює як активність нейроцитів СХЯ, так і активність пінеалоцитів епіфіза. Помірна стимуляція епіфіза також підтверджується дослідженнями на ультраструктурному рівні. Так, після введення мелатоніну вдень частіше виявлялися, порівняно з відповідною контрольною групою, пінеалоцити зі світлими ядрами, в яких виявлялось ядерце. Також у пінеалоцитах зросла кількість мітохондрій середнього розміру, рибосом та секреторних гранул великих розмірів (рис. 2,а). Однак, у цитоплазмі переважна кількість рибосом знаходилася у вільному стані, що є свідченням посилення синтезу речовин для власних потреб, а не на експорт. Такі дані можуть свідчити про активацію мелатоніном епіфіза вдень.

Разом з цим при введенні вдень мелатоніну на фоні блокади D1 дофамінових рецепторів ми теж отримали підвищення активності пінеалоцитів епіфіза, але проявляється воно по-іншому. Так, з одного боку виявлялися ядра у стані високої активності, а з іншого – помірна кількість мітохондрій, значно розширені порожнини перинуклеарного простору та цистерн ЕПР, що свідчить про накопичення в них секреторного матеріалу і низьку активність процесів виділення. Таким чином, стимуляція епіфіза в даній групі відбувається переважно на рівні синтезу та накопичення секрету, поряд з пригніченням процесів виділення синтезованих речовин. Подібну картину в ЕПР ми спостерігаємо також у контрольній денній групі. Оскільки морфометричні дані отримані при введенні мелатоніну на фоні блокади D1 дофамінових рецепторів не відрізняються від таких у групі з введенням самого мелатоніну, то можна зробити висновок, що дані ефекти спричинені самим мелатоніном, а D1 дофамінові рецептори при цьому не задіяні.

Зовсім протилежний ефект викликає введення лише R(+)-SCH-23390 гідрохлориду. При такому впливі спостерігається пригнічення не лише нейроцитів СХЯ гіпоталамуса, а і піне-алоцитів епіфіза, при чому останній ефект також підтверджується на ультраструктурному рівні. Оскільки у цитоплазмі пінеалоцитів поряд з помірно розвинутими органелами виявлялися також мітохондрії з спіралеподібно закрученими структурами та лізованими кристами, що вказує на дегенеративні зміни в епіфізі після введення блокатора D1 дофамінових рецепторів в цей час доби.

Отже можна вважати, що ДА активує епіфіз та СХЯ вдень при малій кількості ендогенного мелатоніну, здійснюючи свій вплив через D1 дофамінові рецептори. Тоді як в ефектах екзогенного мелатоніну D1 дофамінові рецептори не задіяні, а незначна гальмівна дія опосередкована D2 рецепторами. Оскільки в активуючій дії мелатоніну ДА не бере участі, то ми припускаємо, що мелатонін безпосередньо активує СХЯ та епіфіз.

Вечірнє введення мелатоніну здійснювало гальмівний ефект на активність гонад (табл. 2). Введення мелатоніну на тлі блокади D2-рецепторів галоперидолом або самого галоперидолу викликало зниження активності гонадотропоцитів у вечірні години порівняно з контролем, відповідно в гонадах у цей період доби зменшується діаметр сім’яних канальців. Таку реакцію з боку гіпофізарно-гонадного комплексу на введення мелатоніну на тлі блокади D2-рецепторів можна пояснити як ефект самого ДА, оскільки ці результати не є достовірними відносно групи птахів, яким вводили мелатонін. Також реакція цих органів на введення лише галоперидолу, або лише R(+)-SCH-23390 гідрохлориду імовірно є наслідком гальмівної дії ДА на гонадну систему не лише через D2-рецептори, а і через D1-рецептори. В АЯ гіпоталамуса при цьому зростає активність нейросекреторних клітин, що можна пояснити дією механізму зворотних зв’язків.

Таблиця 1. Морфометричні параметри гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи, нейронів супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та епіфіза японських перепелів у різних серіях експерименту

умови експерименту площа перетину ядер пінеалоци-тів епіфіза, мкм2 діаметр ядер нейронів СХЯ гіпотала-муса, мкм діаметр ядер нейронів АЯ гіпоталамуса, мкм площа перетину ядер гонадотропо-цитів аденогіпофіза, мкм2 діаметр сім’яних канальців, мкм

ранкове введення препаратів

фізіологічний розчин 19,8±0,7 7,2±0,2 7,7±0,1 10,2±0,3 84±3

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид 18,8±0,4 7,0±0,1 6,7±0,1* 8,1±0,2* 76±2*

галоперидол 19,0±0,6 9,2±0,1* 7,8±0,1 8,6±0,2 79±2

мелатонін 19,1±0,2 8,0±0,1* 7,9±0,2 9,1±0,4 53±1*

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + мелатонін 19,4±0,6 8,2±0,1* 7,2±0,1*^ 8,3±0,1*^ 76±2*^

галоперидол + мелатонін 19,2±0,5 8,2±0,1* 9,1±0,1*^ 8,0±0,2*^ 107±4*^

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + галоперидол + мелатонін 18,2±0,5 7,0±0,1^ 6,6±0,1^ 8,5±0,2*^ 95±3*^

денне введення препаратів

фізіологічний розчин 18,8±0,3 7,7±0,1 7,9±0,1 9,1±0,3 96±2

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид 17,6±0,4* 7,3±0,1* 7,1±0,1* 7,9±0,2* 88±3

галоперидол 19,5±0,5 9,0±0,1* 7,7±0,1 7,6±0,1* 102±2

мелатонін 20,3±0,4* 8,6±0,1* 7,4±0,1* 10,7±0,1* 130±7*

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + мелатонін 21,5±0,5* 8,6±0,1* 7,4±0,1* 8,8±0,1^ 77±2*^

галоперидол + мелатонін 19,7±0,4 9,4±0,1*^ 9,8±0,2*^ 8,9±0,3^ 64±2*^

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + галоперидол + мелатонін 19,8±0,3* 8,3±0,1* 6,9±0,1^ 8,8±0,3^ 93±3^

* – Р<0,05 (порівняно з відповідним параметром у контрольній групі в той же час доби).

^ – Р<0,05 (порівняно з відповідним параметром у групі, якій вводили лише мелатонін в той же час доби).

Таблиця 2. Морфометричні параметри гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи, нейронів супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та епіфіза у японських перепелах в різних серіях експерименту

умови експерименту площа перетину ядер пінеалоцитів епіфіза, мкм2 діаметр ядер нейронів СХЯ гіпота-ламуса, мкм діаметр ядер нейронів АЯ гіпоталамуса, мкм площа перетину ядер гонадотропо-цитів аденогіпофіза, мкм2 діаметр сім’яних канальців, мкм

вечірнє введення препаратів

фізіологічний розчин 20,3±0,4 8,7±0,1 7,8±0,1 9,3±0,2 109±5

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид 19,3±0,3* 7,4±0,1* 7,6±0,1 8,8±0,2* 82±2*

галоперидол 19,1±0,5 9,6±0,1* 8,2±0,1* 7,9±0,2* 97±2*

мелатонін 23,6±0,4* 9,5±0,1* 8,8±0,1* 9,5±0,3 85±4*

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + мелатонін 16,5±0,4*^ 7,2±0,1*^ 7,0±0,1*^ 9,4±0,1 160±4*^

галоперидол + мелатонін 19,1±0,5^ 8,3±0,1*^ 9,1±0,2* 8,7±0,2* 92±3*

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + галоперидол + мелатонін 20,9±0,3^ 7,3±0,1*^ 6,9±0,1^ 9,1±0,1 114±3^

нічне введення препаратів

фізіологічний розчин 18,7±0,4 8,5±0,1 7,2±0,1 9,4±0,3 108±2

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид 18,9±0,4 7,3±0,1* 7,1±0,1 9,1±0,1 77±1*

галоперидол 20,3±0,4* 8,9±0,1* 8,6±0,2* 8,2±0,2* 88±3*

мелатонін 23,2±0,4* 8,5±0,2 7,6±0,1* 10,2±0,3* 97±4*

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + мелатонін 22,1±0,6* 8,8±0,1 7,4±0,1 8,1±0,1*^ 87±2*^

галоперидол + мелатонін 19,2±0,5^ 8,8±0,1* 9,2±0,1*^ 8,8±0,3^ 84±5*^

R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + галоперидол + мелатонін 19,8±0,6^ 7,8±0,1*^ 6,9±0,1^ 7,9±0,2*^ 131±4*^

* – Р<0,05 (порівняно з відповідним параметром у контрольній групі в той же час доби).

^ – Р<0,05 (порівняно з відповідним параметром у групі, якій вводили лише мелатонін в той же час доби).

З іншого боку, при введенні мелатоніну ввечері, збільшуються діаметр ядер нейронів СХЯ гіпоталамуса та площа перетину ядер пінеалоцитів, а активність сім’яників – зменшується, що дає змогу припустити існування негативного зв’язку між цими структурами. Дослідження ультраструктури пінеалоцитів епіфіза після введення мелатоніну також свідчило про активацію цього органа, максимальну порівняно з іншими групами. Так, у пінеалоцитах виявляли поряд з надзвичайно розвинутим гранулярним ЕПР, та великою кількістю вільних рибосом, також агранулярний ЕПР та багато мітохондрій зі світлим матриксом (рис. 2,б).

Як свідчать результати вимірів площі перетину ядер пінеалоцитів епіфіза у контрольній групі, цей параметр є найвищим увечері, що, напевно, свідчить про активізацію синтетичних процесів у клітинах епіфіза у цей період доби. Таке припущення повністю підтверджується електронно-мікроскопічними дослідженнями. Так, порівняно з денною контрольною групою, виявляли краще розвинутий ЕПР, ядра містили більше еухроматину, біля ядра у багатьох пінеалоцитах виявлялися велетенські мітохондрії з світлим матриксом та великою кількістю крист. Отже, підсумовуючи результати, отримані за допомогою електронної мікроскопії, можна вважати, що епіфіз птахів у вечірні години є набагато активнішим, порівняно з таким вдень.

Після введення R(+)-SCH-23390 гідрохлориду окремо або разом з мелатоніном, спостерігається зменшення площі перетину ядер пінеалоцитів та діаметрів ядер нейронів СХЯ, що свідчить про стимулюючий вплив мелатоніну на досліджувані структури саме шляхом виділення ДА, який далі спрямовує свою активуючу дію через D1 дофамінові рецептори. Однак, на електронограмах виявлялися дуже розвинуті гранулярний ЕПР (особливо у темних пінеалоцитах) та агранулярний ЕПР, апарат Гольджі, величезна кількість вільних рибосом та мітохондрій. Такий стан пінеалоцитів можна вважати активним всупереч низьким показникам площі перетину ядер пінеалоцитів.

Ультраструктура пінеалоцитів птахів, які отримували лише R(+)-SCH-23390 гідрохлорид, повністю підтверджує наявність гальмівного ефекту цього блокатора на епіфіз. Такий висновок можна зробити зважаючи на наявність у цитоплазмі пінеалоцитів великої кількості мітохондрій з деструктивними змінами, слабо розвинутий гранулярний та агранулярний ЕПР, багато осміофільних тілець переважно великих розмірів.

Введення галоперидолу ввечері супроводжується збільшенням середнього діаметра ядер нейронів СХЯ, що можна пояснити гальмівною дією ДА на дану гіпоталамічну область, що здійснюється за допомогою D2 дофамінових рецепторів. Тоді як, введення мелатоніну на тлі блокади D2-рецепторів приводить до протилежного результату, що вказує на стимулюючий вплив екзогенного мелатоніну, опосередковано ДА та D2 дофаміновими рецепторами.

Пригнічення сім’яників мелатоніном зберігається і в нічний час доби (рис. 1,а). Зменшення активності гонад не зникає і при блокаді D1-рецепторів окремо та при введенні блокатора разом з мелатоніном. Тоді як площа перетину гонадотропоцитів зменшується лише при впливі мелатоніну на фоні блокади D1 –рецепторів (табл. 2).

Пригнічення гонад та гіпофіза при впливі галоперидолу та галоперидолу з мелатоніном можливо пояснюється наявністю активуючої дії мелатоніну опосередковано D2 дофаміновими рецепторами лише як додатковий або один із шляхів дії. Також це може свідчити про те, що стимулюючий вплив на гіпофізарно-гонадний комплекс ДА здійснює через D2 рецептори. У нічні як і у вечірні години доби як блокада D2-рецепторів галоперидолом, так і введення екзогенного мелатоніну мають стимулюючий ефект на нейросекреторні клітини АЯ гіпоталамуса (рис. 1,г); причому при введенні мелатоніну на фоні блокади галоперидолом D2-рецепторів стимулюючий ефект посилюється. Очевидно, що тут ми маємо справу зі звичайною сумацією ефектів двох чинників. Тобто, можливо дія екзогенного мелатоніну може здійснюватись незалежно від ДА, оскільки після введення мелатоніну ми отримали негативну реакцію гонад. Можливо це викликано прямим негативним впливом мелатоніну на гонади.

Вночі ДА має активуючу дію на СХЯ гіпоталамуса через D1-рецептори, і цей вплив ймовірно відбувається незалежно від епіфіза. Тоді як гальмівний ефект ДА через D2-рецептори спостерігається і на рівні епіфіза, і на рівні СХЯ. Збільшення площі перетину ядер пінеалоцитів епіфіза відносно контролю при введенні мелатоніну разом з R(+)-SCH-23390 гідрохлоридом можна пояснити дією самого мелатоніну. Тоді як пригнічення пінеалоцитів при введенні мелатоніну з галоперидолом та мелатоніну з обома рецепторами вказує, що стимуляція епіфіза мелатоніном опосередкована саме D2 дофаміновими рецепторами. Отже, ми підтвердили, що дані циркадні пейсмекери у птахів можуть бути автономними, або підпорядкованими один одному, що залежить від часу доби. В регулюванні діяльності даних пейсмекерів задіяні як мелатонін так і дофамінергічна система. При цьому через D2 дофамінові рецептори здійснюється гальмуючий вплив ДА, а через D1 дофамінові рецептори стимулююча дія ДА на епіфіз та СХЯ гіпоталамуса.

ВИСНОВКИ:

Екзогенний мелатонін у дозі 10 мкг/ 100 г маси тіла справляє неоднаковий вплив на гіпоталамо-гіпофізарно-гонадну систему птахів в різний час доби. Введення мелатоніну вранці, ввечері та вночі викликає пригнічення гонад, а введення його вдень – стимуляцію гонад.

Гальмівна дія екзогенного мелатоніну на репродуктивну систему вранці опосередкована його стимулюючим ефектом на виділення дофаміну, який в подальшому діє як через D1-, так і через D2-рецептори.

Виявлено можливість екзогенного мелатоніну збільшувати площу перетину ядер гонадотропоцитів аденогіпофіза та діаметр сім’яних канальців вдень опосередковано як D1-, так і D2 дофаміновими рецепторами.

Встановлено, що ввечері в реалізації гальмівного впливу екзогенного мелатоніну на гонади беруть участь D1 дофамінові рецептори.

Виявлено, що введення мелатоніну вночі приводить до не опосередкованого дофаміновими рецепторами зменшення сім’яних канальців.

Введення мелатоніну приводить до збільшення ядер нейронів СХЯ гіпоталамуса вранці, вдень та ввечері, а до збільшення ядер пінеалоцитів епіфіза птахів вдень, ввечері та вночі.

Активуючий вплив екзогенного мелатоніну на морфологічний стан епіфіза ввечері опосередкований переважно D1 дофаміновими рецепторами, а вночі – D2-рецепторами. Блокада D1 дофамінових рецепторів R(+)-SCH-23390 гідрохлоридом призводить до зниження активності пінеалоцитів і розвитку деструктивних змін.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Фурса Н.В., Варенюк І.М., Дзержинський М.Е. Морфологічні особливості добових змін епіфіза та супрахіазматичного ядра гіпоталамуса птахів після введення мелатоніну // Науковий вісник Національного аграрного університету.– 2004.– вип. .– С. –40. (Особистий внесок: участь у розробці ідеї дослідження, усі результати експерименту та написання чорнового варіанту статті; Варенюк І.М., Дзержинський М.Е.: розробка ідеї дослідження та загальне редагування).

Дзержинський М.Е., Варенюк І.М., Фурса Н.В. Мелатонін в різний час доби по-різному впливає на морфо-функціональний стан гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу японських перепелів // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького.– 2004.– Том , № , Частина .– С. –167. (Особистий внесок: усі результати експерименту та участь у написанні чорнового варіанту статті; Дзержинський М.Е., Варенюк І.М.: ідея дослідження, участь у написанні чорнового варіанту статті).

Фурса Н.В., Варенюк І.М., Пазюк Л.М., Бузинська Н.О., Дзержинський М.Е. Добова динаміка структурних змін гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи птахів за участі мелатоніну // Вісник морфології (Reports of morphology).– 2004.– № 10 (1).– С. 132–134. (Особистий внесок: статистична обробка та інтерпритація результатів експерименту, участь у написанні чорнового варіанту статті; Варенюк І.М.: участь у експерименті та написанні чорнового варіанту статті; Пазюк Л.М., Бузинська Н.О.: участь в експерименті; Дзержинський М.Е.: ідея дослідження).

Фурса Н.В., Пазюк Л.М., Дзержинський М.Е. Ультраструктурні зміни пінеалоцитів епіфіза птахів після введення мелатоніна та R(+)-SCH-23390 гідрохлориду вдень та ввечері // Вісник проблем біології і медицини. – 2004.- №2.-С.20-25. (Особистий внесок: проведення експерименту та аналіз результатів, підготовка матеріалу до друку; Пазюк Л.М., Дзержинський М.Е.: ідея дослідження, загальне редагування).

Фурса Н.В. Влияние на репродуктивную систему самцов Japanese Quail однократного введения мелатонина в разное время суток при блокаде дофаминовых Д2 рецепторов // Материалы XLI Международной научной студ. конференции “Студент и научно-технический прогресс”, Новосибирск.- 2003.-С. 197.

Фурса Н.В. Добова динаміка структурних змін епіфіза та супрахіазматичного ядра гіпоталамуса птахів після введення мелатоніну та блокаторів дофамінових рецепторів // Матеріали IV всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”, (Київ, 24-25 квітня).- 2004.-С. 56-58.

Фурса Н.В. Морфофізіологічна характеристика гонад самців японських перепелів після введення мелатоніну в різний час доби при блокаді дофамінових Д1 рецепторів // Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна. Сучасний стан науки, досягнення, проблеми та перспективи розвитку”, (Київ, 15 травня).-2003.-С. 93-95.

Фурса Н.В. Гістофізіологічна характеристика гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи птахів вранці після введення мелатоніну та антагоністів дофамінових рецепторів // Матеріали міжнародної науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна”, (Київ, 15 травня).-2004.-С. 15-16.

АНОТАЦІЇ

НУЖИНА Н.В. Циркадна динаміка структурних змін гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи та епіфіза птахів при введенні мелатоніну та блокаторів дофамінових рецепторів.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.11.-цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.

У дослідженні на 5-тижневих самцях Coturnix coturnix japonica показано, що введення мелатоніну справляє неоднаковий вплив на структурно-функціональний стан гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи птахів в різний час доби. Введення мелатоніну вдень стимулює гонадотропоцити гіпофіза та гонади, при чому в цьому задіяні як D1-, так і D2 дофамінові рецептори. Тоді як, вранці, ввечері та вночі мелатонін пригнічує гонади, і це відбувається різними шляхами. Так, гальмівна дія екзогенного мелатоніну на репродуктивну систему вранці опосередкована його стимулюючим ефектом на виділення дофаміну, який в подальшому діє як через D1-, так і через D2-рецептори; ввечері – через D1 дофамінові рецептори; а вночі в гальмівній дії мелатоніну дофамінергічна система не задіяна.

Введення мелатоніну приводить до збільшення ядер нейроцитів СХЯ гіпоталамуса вранці, вдень та ввечері, а до збільшення ядер пінеалоцитів епіфіза птахів вдень, ввечері та вночі. При чому ввечері активуючий вплив мелатоніну на морфологічний стан епіфіза опосередкований переважно D1 дофаміновими рецепторами, а вночі – D2-рецепторами.

Ключові слова: птахи, мелатонін, гіпоталамо-гонадна система, епіфіз, дофамінові рецептори, циркадна динаміка.

НУЖИНА Н.В. Циркадная динамика структурных изменений гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы и эпифиза птиц при введении мелатонина и блокаторов дофаминовых рецепторов.

Дисертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11.-цитология, клеточная биология, гистология.– Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка, Киев, 2004.

В исследовании на пятинедельних самцах Coturnix coturnix japonica показано, что введение мелатонина вызывает неодинаковое влияние на структурно-функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы птиц в разное время суток. Введение мелатонина днем стимулирует гонадотропоциты гипофиза и гонады, при этом в этом задействованы как D1-, так и D2 дофаминовые рецепторы. В то время как, утром, вечером и ночью введение мелатонина вызывает уменьшение диаметра семенных канальцев, и подавление активности сперматогенного эпителия семенников разными путями. Так, подавляющее действие экзогенного мелатонина на репродуктивную систему утром опосредовано его стимулирующим эффектом на выделение дофамина, который далее действует как через D1-, так и через D2-рецепторы; вечером – через D1-рецепторы; а ночью в подавляющем влиянии мелатонина дофаминергическая система вовсе не задействована.

Введение мелатонина приводит к увеличению ядер нейронов СХЯ гипоталамуса утром, днем и вечером, а к увеличению ядер пинеалоцитов эпифиза птиц – днем, вечером и ночью. При этом вечером активация мелатонином эпифиза опосредована преимущественно D1- дофаминовыми рецепторами. Ультраструктура пинеалоцитов птиц, которые получали только R(+)-SCH-23390 гидрохлорид, подтверждает наличие подавляющего эффекта этого блокатора на эпифиз. Такой вывод можно сделать на основание наличия в цитоплазме большого количества митохондрий с деструктивными изминениями. После введения мелатонина вечером наблюдалась максимальная активация пинеалоцитов сравнительно с другими исследованными группами. А именно, в ядрах пинеалоцитов данных групп преобладал эухроматин, наблюдались очень развитые гранулярный и агранулярный ЕПР, аппарат Гольджи, много митохондрий со светлым матриксом и свободных рибосом. Активация мелатонином эпифиза ночью опосредована D2-рецепторами.

Ключевые слова: птицы, мелатонин, гипоталамо-гонадная система, эпифиз, дофаминовые рецепторы, циркадная динамика.

Nuzhyna N.V. Circadian dynamics of structural changes of hypothalamic-hypophyseal-gonadal system and pineal gland of birds at conducting after melatonin treatment and simultaneous blokade of differents dopamine receptors.

Dissertation for candidate degree in biology by speciality 03.00.11.-cytology, cellular biology, histology. Kiev Taras Shevchenko National University, Kiev, 2004.

It was shown, that melatonin treatment caused to different effects on activity of reproduction system of five-week male Coturnix coturnix japonica during day. Introduction of melatonin in the afternoon stimulates gonadotropocity of hypophysis and gonads, thus in it are involved both D1-, and D2 dopamine receptors. While, in the morning, in the evening and at night introduction of melatonin causes reduction of diameter seed canals differently. So, in the morning in overwhelming action of melatonin on reproductive system occurs through its stimulating effect on dopamin allocation which further operates both through D1-, and through D2-receptors; in the evening – through D1-receptors; and at night dopamine system is not involved in overwhelming influence of melatonin at all. Introduction of melatonin results in increase in nucleus neurocells SHN of hypothalamus in the morning, in the afternoon and in the evening, and to increase in nucleus pinealcells of birds – in the afternoon, in the evening and