МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДНІПРОПЕТРОВСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ

ДОРОХОВА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 616-006.18: 618.14]-036.1-078-091.8

ДІАГНОСТИЧНЕ ТА ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ

МАРКЕРІВ ПРИ ДИСПЛАСТИЧНИХ ТА НЕОПЛАСТИЧНИХ ПРОЦЕСАХ ШИЙКИ МАТКИ (ІМУНОМОРФОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ)

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Дніпропетровськ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України.

Науковий

доктор медичних наук, професор Шпонька Ігор Станіславович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії і судової медицини.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гасюк Анатолій Петрович, ВДНЗУ „Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії з секційним курсом;

доктор медичних наук, професор Загорулько Олександр Кімович, Кримський державний медичний університет ім. С.І.Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії з біопсійно-секцій-ним курсом.

Провідна установа:

Харківський державний медичний університет, кафедра патологічної анатомії, МОЗ України, м. Харків.

Захист відбудеться “10” травня 2007 року о _11_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 08.601.03 при Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України (49005, м. Дніпропетровськ, вул. Севастопольська, 17).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Дніпропетровської державної медичної академії (49044, м. Дніпропетровськ, вул. Дзержинського, 9).

Автореферат розісланий „ 8 ” квітня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, доцент Машталір М.А.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. В усіх країнах світу рак та передракові ушкодження шийки матки є однією з основних медичних, психологічних та соціальних проблем жінок. Починаючи з 1997 року в Україні спостерігається незначне, але постійне зростання рівня захворюваності на рак шийки матки, в той час як у розвинутих країнах відзначається зворотна тенденція (Гойда Н.Г., 2000). У більшості випадків виникненню раку шийки матки можна запобігти. Вважається, що канцерогенез в епітелії шийки матки є етапним процесом і може тривати від 2 до 10 років, однак відповідний лікувальний вплив на ранніх стадіях розвитку цервікальних інтраепітеліальних неоплазій дозволяє уникнути виникнення інвазивних форм раку (Бохман Я.В., 2002; Nicolas F.S., 2003). ЦІН є послідовними стадіями преінвазивних ушкоджень шийки матки (Вишневская Е.Е., 2002; Коханевич Е.В., 2004). Слід зазначити той дуже важливий факт, що на будь-якому етапі цей процес може перерватися завдяки активації імунітету, апоптозу чи спонтанній регресії. Незважаючи на існування численних гіпотез, біологічні властивості ЦІН, що безпосередньо визначають можливість неопластичних трансформацій на тлі диспластичних процесів, залишаються невідомими (Минкина Г.Н., 2001; Young T., 2005).

В даний час у практичній онкології великого значення набуває аналіз експресії імуногістохімічних маркерів, оскільки при цьому істотно підвищується якість інформації про пухлинну тканину і яку неможливо одержати при традиційному гістологічному дослідженні (Петров С.В., 2004., Dabbs D.J., 2006). Вивчення молекулярних біомаркерів для виявлення й інтерпретації диспластичних клітин дозволить значно зменшити вплив суб’єктивних обставин, які супроводжують стандартний морфологічний підхід. Завдяки використанню прогностич-них маркерів можна відбирати контингент хворих з підвищеним ризиком розвитку інвазивного раку, що значно знизить вартість подальших діагностичних та терапевтичних процедур (Фролова И.И., 2002; Козаченко А.В., 2006; Carrilho C., 2005).

Відомо, що в розвитку пухлинних процесів основними елементами є порушення клітинної проліферації й диференціювання, апоптозу та ангіогенезу (Загорулько А.К., 2002; Тsuda H., 2003; Branca M., 2006). Однак натепер серед науковців немає єдиної точки зору щодо співвідношення цих процесів при прогресії передпухлинних ушкоджень шийки матки та їх зв'язку з біологічною поведінкою інвазивних пухлин (., 2001; ., 2002). Не менш важливим є вивчення маркерів – індикаторів злоякісного перетворення клітин епітелію шийки матки, таких як p16ІNK4a, зв'язків між експресією маркерів біологічних властивостей тканин і детекцією вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику (Волгарева Г.М., 2002; Klaes R., 2001; Agoff S.N., 2003). Існує припущення, що розвиток ВПЛ інфекції та можливе виникнення та прогресія ЦІН в інвазивний рак залежить від рівня статевих гормонів (Хмельницкий О.К., 1999; Fonseca-Moutinho J.A., 2004). У літературі є велика кількість розбіжностей щодо експресії естрогенових та прогестеронових рецепторів у нормі та при патологічних змінах шийки матки (Coelho F.R., 2004; Ikuo K., 2006).

Таким чином, визначення експресії маркерів біологічних властивостей тканин при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки для удосконалення діагностики, прогнозу перебігу, передбачення відповіді на терапію й формування груп ризику пацієнток, що вимагають більш ретельного спостереження в зв'язку з можливістю подальшої прогресії ушкоджень шийки матки з розвитком інвазивного раку, є актуальним і перспективним науковим дослідженням.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Представлена робота є фрагментом науково-дослідної роботи кафедр патологічної анатомії і судової медицини та онкології і медичної радіології Дніпропетровської державної медичної академії „Індивідуалізація лікування злоякісних пухлин з урахуванням біологічних показників активності пухлинного процесу та маркерів хіміогормонорезистентності” (№ держреєстрації 0101U001002).

Мета і завдання дослідження. Удосконалити діагностичні та прогностичні критерії перебігу диспластичних та неопластичних процесів епітелію шийки матки на підставі вивчення показників експресії маркерів біологічних властивостей тканин.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі завдання:

1. Визначити частоту виявлення вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику в епітелії шийки матки та дослідити кореляцію з типом передпухлинних та пухлинних ушкоджень.

2. Вивчити рівень експресії онкопротеїну р16INK4A як показника онкогенної трансформації при передпухлинних та пухлинних процесах епітелію шийки матки.

3. Вивчити імуноморфологічні показники проліферації, апоптозу, диференціювання та неоваскулогенезу при передракових та ракових процесах шийки матки.

4. Визначити зв'язок рівня експресії естрогенових та прогестеронових рецепторів зі ступенем диспластичних та неопластичних ушкоджень.

5. Визначити чутливість, специфічність, негативне передбачувальне число та позитивне передбачувальне число для використання рівня експресії кожного маркера для встановлення ступеня диспластичних ушкоджень, рівня диференціювання інвазивних пухлин шийки матки та наявності генетичного матеріалу вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику.

Об’єкт дослідження: операційний та біопсійний матеріал шийки матки пацієнтів після гістеректомії, конізації шийки матки та кольпоскопії з приводу цервікальних інтраепітеліальних неоплазій, інвазивних раків шийки матки.

Предмет дослідження: експресія імуногістохімічних маркерів при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки, гістологічний ступінь диференціювання, критерії його оцінки.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети та вирішення завдань використано гістологічні, імуногістохімічні, морфометричні методи для встановлення морфологічних змін при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки; статистична обробка отриманих результатів дослідження уможливила деталізацію та об’єктивізацію базисної інформації.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вивчено частоту виявлення вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику в епітеліальній тканині шийки матки методом ПЛР та проведено кореляцію цих даних з варіантом дисплазій та неоплазій та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів. Вперше визначено взаємозв’язок між характером та ступенем виразності патологічного процесу в епітелії шийки матки та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів біологічних властивостей тканин. Досліджено корелятивний зв’язок між процесами апоптозу, проліферації, неоваскулогенезу та диференціювання клітин епітелію шийки матки в нормі та при диспластичних і неопластичних процесах.

У результаті комплексного дослідження розроблені категорії оцінки експресії імуногістохімічних маркерів. Визначені такі параметри як чутливість, специфічність, негативне передбачувальне число та позитивне передбачувальне число для використання рівня експресії кожного маркера для встановлення ступеня диспластичних ушкоджень, рівня диференціювання інвазивних пухлин шийки матки та наявності генетичного матеріалу вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику, описані можливості використання імуногістохімічного дослідження маркерів у клініці як скринінгових та підтверджуючих методів. Вперше на підставі вивчення варіантів експресії маркерів біологічних властивостей тканин та їх статистичної обробки обґрунтована концепція, яка визначає підходи до використання імуногістохімічного методу для поліпшення гістологічної діагностики диспластичних процесів та виділення груп ризику пацієнток з цервікальними неоплазіями.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені в роботі показники експресії маркерів апоптозу, проліферації, неоваскулогенезу та диференціювання при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки доповнюють та уточнюють уявлення про онкотрансформацію і фактори, від яких залежить біологічна поведінка передпухлинних процесів та злоякісних новоутворень. На основі визначення чутливості, специфічності, НПЧ і ППЧ для використання рівня експресії імуногістохімічних маркерів при передпухлинних та пухлинних процесах шийки матки розроблено концепцію можливого використання імуногістохімічного дослідження цих маркерів у клініці як скринінгових і підтверджуючих методів, що дозволяє підвищити якість ранньої діагностики цих процесів, прогнозувати подальший перебіг захворювання, а також рекомендувати виділення різних груп ризику в залежності від рівня та варіанту експресії цих маркерів. Одержані результати дозволяють обґрунтувати необхідність корекції подальшого ведення таких пацієнток з можливим призначенням необхідних діагностичних заходів та вибір адекватного методу терапії, що є безперечною передумовою успішного лікування хворих на передпухлинні та пухлинні процеси епітелію шийки матки.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені патентний та інформаційний пошук, збір, аналіз і обробка біопсійного та операційного матеріалу, виконано імуногістохімічне та загальноморфологічне дослідження біопсійного й операційного матеріалу 134 пацієнток, особисто розроблені критерії оцінки експресії імуногістохі-міч-них маркерів, проведено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, підібраний й оформлений ілюстративний матеріал. Дисертантом самостійно написані всі розділи дисертації, здійснена публікація результатів дослідження в журналах, представлені результати досліджень на наукових з’їздах та конференціях.

У роботах, виконаних у співавторстві, реалізовані наукові ідеї здобувача. Співавторами здійснювалась допомога в зборі матеріалу, надана консультація при проведені імуногістохімічних досліджень. Дисертантом не були використані результати й ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації та її фрагменти були представлені й обговорені на II і III Всеукраїнських наукових морфологічних конференціях “Карповські читання” (Дніпропетровськ, 2005; 2006), Українській школі-семінарі молодих вчених та фахівців патологоанатомів (Одеса, 2006), науково-практичній конференції асоціації акушерів-гінекологів (Дніпропетровськ, 2006), Російській науково-практичній конференції „Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике” (Москва, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 наукових праць, які повністю відображають зміст проведеного дослідження. Із них 3 статті видані у рекомендованих ВАК України наукових фахових журналах (у тому числі 1 самостійно), 1 стаття – оглядова, 2 деклараційні патенти, 3 тез матеріалів наукових конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертацію викладено державною мовою на 175 сторінках, з яких 140 сторінок залікового принтерного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку літературних джерел. Роботу ілюстровано 82 рисунками та 27 таблицями. Список цитованої літератури налічує 180 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. У відповідності до мети та завдань у дослідженні було використано клініко-анатомічний матеріал хворих, який отримано під час операцій і діагностичних біопсій з приводу ЦІН, РШМ та інших гінекологічних захворювань.

Весь клініко-анатомічний матеріал був розподілений на 3 групи: 1 група – 91 пацієнтка з ЦІН І (дисплазія легкого ступеня, Н-ПІУ); ЦІН ІІ (дисплазія помірного ступеня), ЦІН ІІІ (дисплазія тяжкого ступеня та рак in situ) (ЦІН ІІ та ЦІН ІІІ об’єднувались в В-ПІУ) у віці від 18 до 65 років. Розподіл матеріалу в залежності від ступеня диспластичних трансформацій був наступним: ЦІН І – 30 випадків, ЦІН ІІ – 29, ЦІН ІІІ – 32 спостереження. 2 група – 36 пацієнток з інвазивними раками шийки матки у віці від 30 до 70 років. Розподіл матеріалу в залежності від форми захворювання був таким: плоскоклітинні раки – 27 випадків (із них зроговілі – 18, незроговілі – 9), аденокарциноми – 9 спостережень (із них високодиференційовані – 6, низькодиференційовані – 3). 3 група – 7 пацієнток з патологією шийки матки, яка не була пов'язана з ЦІН або новоутвореннями шийки матки у віці від 25 до 60 років – як контроль.

Комісією з біоетики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол №3 від 13.02.06) встановлено, що проведені наукові дослідження тканин людини відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2000 року.

Для проведення морфологічного дослідження операційний і біопсійний матеріал хворих фіксувався в 10% розчині нейтрального забуференого формаліну на протязі 12 годин. Після фіксації і проводки по стандартній методиці матеріал заливався у парафін. Парафінові зрізи після забарвлення гематоксиліном і еозином піддавалися загальноморфологічному дослідженню.

Для імуногістохімічного дослідження зрізи завтовшки 4-5 мкм наносилися на предметне скло, попередньо оброблене адгезивною рідиною, вслід за чим депарафінізувалися відповідно до прийнятих стандартів. Ми використовували нагрівання на водяній бані в цитратному буфері з рН=6,0 (протягом 30 хвилин після досягнення температури 980) і автоклавування (5 хвилин при температурі +1210 С). Як первинні використовувалися моноклональні антитіла до р53-онкопротеїну (клон DO-7, DakoCytomation), Ki-67 (клон MIB-1, DakoCytomation), p16INK4a (kit для гістологічних препаратів, №K5334, DakoCytomation), VEGF (клон VG1, DakoCytomation), естрогенових (клон 6F11, Novocastra) та прогестеронових рецепторів (клон 1A6, Novocastra), CD34 (клон QBEnd 10, DakoCytomation), p63 (клон 4А4, DakoCytomation). Для контролю специфічності імуногістохімічного забарвлення для кожного маркера виконували контрольні реакції. Подальшу обробку проводили з використанням системи візуалізації LSAB2 та EnVision (DakoCytomation) протягом 10 хвилин з кожним реагентом з проміжним промиванням у ТРИС-буферному розчині. Після цього проводили реакцію з хромогеном (DAB (DakoCytomation)), оцінюючи якість взаємодії під контролем мікроскопу протягом від 20 секунд до 3 хвилин. Для диференціювання структур тканин зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майєра протягом 3 хвилин. Дегідратація і заключення у бальзам здійснювалися згідно розповсюдженим принципам (Петров С.В., 2004., Dabbs D.J., 2006).

Клітини, позитивні у відношенні експресії маркерів, вивчали на 4-6 випадково обраних полях зору мікроскопа. Після підрахунку 300 гістологічно ідентифікованих клітин обчислювали показники експресії за результатами всіх вивчених ділянок, враховуючи реакції у нормальних, а також диспластично і неопластично змінених клітинах епітеліального шару. Експресія рецепторів стероїдних гормонів, VEGF та CD34 оцінювалась також у стромальному компоненті.

При оцінці імуногістохімічного забарвлення позитивна імуногістохімічна реакція з антитілами до Кі-67, р53, р63, естрогенових та прогестеронових рецепторів виявлялася коричневим забарвленням ядер клітин різного ступеня інтенсивності. Найбільш розповсюдженою формою позитивної реакції на p16INK4A та VEGF було коричневе одночасне забарвлення ядер і цитоплазми – так звана змішана позитивна реакція (Dabbs D.J., 2006).

Для оцінки p16INK4A експресії використовували наступну шкалу: негативна реакція – до 5% позитивно забарвлених клітин; фокальна - до 80% клітин з позитивним забарвленням; дифузна – більше 80% клітин з імуногістохімічною міткою (Takaaki S., 1998). Для оцінки експресії стероїдних рецепторів використовували наступні діапазони: негативна реакція –0-10% позитивно забарвлених клітин; позитивна реакція - більше 10% клітин з імуногістохімічною міткою. Індекси проліферації (ІП), р53 та р63 експресії обчисляли як відсоток клітин з інтрануклеарною реакцією, незалежно від інтенсивності забарвлення, до загальної кількості клітин в середньому за результатами всіх вивчених ділянок. При оцінці імуногістохімічного забарвлення з VEGF використовувався напівкількісний метод з 4 категоріями: 0 - негативна реакція (еквівалентно нормальному епітелію), 1 - слабке забарвлення (позитивно забарвлені окремі розкидані клітини, чи розповсюджена на весь епітелій, але слабка реакція), 2 - помірно виражене забарвлення (більша кількість позитивно забарвлених клітин) і 3 - інтенсивне забарвлення (практично всі клітини епітелію були позитивними) (Branca M., 2006).

Матеріал пацієнток був підданий ПЛР дослідженню на предмет виявлення ВПЛ різних типів.

Дані морфометричного та імуногістохімічного досліджень піддавалися статистичній обробці, з використанням варіаційних статистичних методів. Визначення достовірності відмінностей ознак проводили за допомогою параметричних методів (t критерій Стьюдента). Зв’язок між ознаками визначали за допомогою коефіцієнта кореляції. У випадку, коли розподілення не відповідало нормальному закону, оцінку відмінностей між вибірками оцінювали за допомогою непараметричних критеріїв: Х-критерію Ван-дер-Вардена і U-критерію Уілкоксона (Манна-Уітні). В дослідженні були також підраховані чутливість, специфічність, НПЧ і ППЧ для р16ІNK4a; р53; Кі-67; VEGF; ER; PGR; р63 забарвлення, як маркерів ступеня диспластичних трансформацій, наявності ВПЛВКР та ступеня диференціювання інвазивних пухлин (Лакин Г.Ф., 1990).

Отже, представлені в даному розділі матеріал і методи дослідження є послідовними кроками на шляху вирішення поставлених задач, які дозволяють здійснити комплексний підхід до вивчення експресії маркерів біологічних властивостей тканин при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки.

Результати дослідження та їх обговорення.

У нашому дослідженні при аналізі інфікованості ВПЛ визначено, що в контрольній групі кількість випадків, в яких не було виявлено ВПЛ, достовірно перевищувала число спостережень з визначеними ВПЛ НКР та ВПЛ ВКР. З іншого боку, в групі ЦІН та РШМ кількість випадків з ВПЛ ВКР була значно більше, ніж число ВПЛ НКР-позитивних та ВПЛ-негативних спостережень. Такий розподіл інфікованості ВПЛ ВКР та НКР серед досліджуваних пацієнток свідчить про безумовне превалювання ВПЛ ВКР у пацієнток з пухлинними та передпухлинними процесами. Проте, з урахуванням можливого виявлення матеріалу ВПЛ у пацієнток з Н-ПІУ та відсутності ВПЛ ВКР у деяких В-ПІУ та інвазивних раках, визначення ДНК ВПЛ методом ПЛР не є достатнім для віднесення жінки з позитивним результатом до групи з високим ризиком прогресії ушкодження ЕШМ, що узгоджується з даними літератури (Meijer C.J. та ін., 1992; Nicolas F. Schlecht та ін., 2003).

У результаті проведеного імуногістохімічного дослідження експресії онкопротеїну р16INK4A визначено, що рівень експресії цього маркеру при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки суттєво відрізняється від контрольної групи (табл.1).

Таблиця 1

Експресія p16INK4A у залежності від ступеня

ушкоджень епітелію шийки матки

Діагноз | n | Експресія p16INK4A

Негативна | Фокальна | дифузна

Норма | 7 | 7 (100%) | 0 | 0

ЦІН І | 30 | 22 (73,3%) | 8 (26,7%) | 0

ЦІН ІІ | 29 | 4 (13,8%) | 11 (37,9%) | 14 (48,3%)

ЦІН ІІІ | 32 | 1 (3,2%) | 5 (15,6%) | 26 (81,2%)

Раки | 36 | 1 (2,8%) | 4 (11,1%) | 31 (86,1%)

Всього | 134 | 35 (26,1%) | 28 (20,9%) | 71 (53,0%)

У зв’язку з тим, що субклітинна локалізація барвника при визначенні онкопротеїну p16ІNK4a значно змінюється, ми вважали як позитивний кожен випадок, у якому забарвлення визначалось або в цитоплазмі, або в ядрах і в цитоплазмі, тобто спостерігалась змішана позитивна реакція.

Всі спостереження контрольної групи мали негативний імуногістохімічний статус до р16INK4A. При ЦІН І визначались два варіанти імуногістохімічної реакції – фокальний та негативний. При цьому кількість випадків з негативною реакцією статистично вагомо (більше ніж у 2,5 рази) перевищувала число ушкоджень з фокальним варіантом забарвлення. У групі ЦІН ІІ ми визначали всі можливі варіанти забарвлення – негативне, фокальне та дифузне, причому кількість випадків з дифузною реакцією була більшою, ніж з фокальним типом реакції на 10%, а з негативною експресією – майже у 3,5 рази (р<0,05). Встановлено, що при ЦІН ІІІ кількість випадків з дифузною реакцією достовірно перевищувала число випадків з фокальною та негативною реакцією – у 5 та 26 разів відповідно. У групі інвазивних раків ШМ дифузний тип реакції спостерігався в 31 випадку (86,1%), що було в 8 разів частіше, ніж фокальна реакція, та в 31 раз – ніж негативна.

При ЦІН І у випадках з фокальним забарвленням спостерігалась слабка реакція 20-35% клітин базального та парабазального шарів, у спостереженнях з негативною реакцією визначалось слабке забарвлення до 5% клітин базального шару. При ЦІН ІІ у спостереженнях з дифузним типом забарвлення ми виявили переважно помірну реакцію в клітинах нижніх двох третин епітеліального шару, у випадках, віднесених до фокального типу, кількість р16INK4A-позитивних клітин коливалась від 20 до 60%, останні розташовувались у нижніх ділянках епітеліального шару, інтенсивність реакції була помірною та слабкою. У групі ЦІН ІІІ у спостереженнях з дифузним забарвленням переважала інтенсивна змішана реакція в клітинах всієї товщі епітелію, кількість позитивно забарвлених клітин дорівнювала 80-95%, в спостереженнях з фокальним типом забарвлення з p16ІNK4a кількість клітин з помірною та високою позитивною реакцією коливалась від 40 до 70%.

При інвазивних раках шийки матки імуногістохімічна реакція частіше була гетерогенною, з різною інтенсивністю. У зонах інвазивного росту пухлини інтенсивність реакцій в клітинах підсилювалась. Тільки 4 з 36 випадків були віднесені до фокального типу реакції, причому кількість р16INK4A-позитив-них клітин коливалась у межах 65-75%, інтенсивність забарвлення розцінювалась як висока та помірна. В 31 випадку спостерігалась дифузна реакція з переважно високою інтенсивністю.

Ми встановили прямий зв'язок рівня р16INK4A експресії з наявністю ВПЛ ВКР. Так, негативна реакція з р16INK4A була асоційована з ВПЛ високого канцерогенного ризику в 8,95% випадків, тоді як фокальна та дифузна – в 14,1% та 49,2% спостережень відповідно. Отже, експресія онкопротеїну р16INK4A є 100% специфічним індикатором ЦІН, чутливим показником В-ПІУ (93,8%) та визначення ВПЛ ВКР (87,6%). Отримані нами результати щодо частоти експресії р16INK4A при різних ступенях ЦІН та інвазивних раках узгоджуються з літературними даними (Klaes R. та ін., 2001; Sano T. та ін., 1998). З іншого боку, в дослідженнях Wang S. та співавт. (2004) всі ЦІН ІІІ були дифузно забарвлені незалежно від ВПЛ статусу, а при дисплазіях легкого ступеня спостерігався дифузний тип реакцій.

У нашому дослідженні при аналізі рівня проліферативної активності було визначено, що показники індексу проліферації (ІП) при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки суттєво перевищують відповідні значення в контрольній групі (табл.2).

Зокрема, при ЦІН І ІП статистично вагомо перевищував аналогічний показник в групі жінок з патологією шийки матки без диспластичних ушкоджень більш ніж у 2 рази, тоді як при ЦІН ІІ – майже у 6 разів (р<0,05). Встановлено, що ІП при ЦІН ІІІ та РШМ достовірно перевищував параметри в контрольній групі (в 14 та 16 разів відповідно). Індекс проліферації в НПР вірогідно перевищував загальний показник ЗПР на 18,6%. Подібну тенденцію ми спостерігали і при АК: при НДАК ІП був вище на 17,3% (р<0,05), ніж у випадках ВДАК.

Таблиця 2

Середні значення індексу проліферації в залежності від ступеня

ушкоджень епітелію шийки матки

Діагноз | n | Середнє значення ІП, (Mm)

Норма | 7 | 4,291,11

ЦІН І | 30 | 9,230,68

ЦІН ІІ | 29 | 23,92,30

ЦІН ІІІ | 32 | 62,82,18

Раки | 36 | 72,02,43

ЗПР | 18 | 64,43,19

НПР | 9 | 83,01,68

ВДАК | 6 | 70,36,08

НДАК | 3 | 87,64,29

Всього | 134 | 41,81,18

У контрольній групі імуногістохімічна реакція з Кі-67 виявлялась в ядрах окремих клітин базального та парабазального шарів. При ЦІН І частота Кi-67-позитивних клітин парабазального шару коливалась від 5 до 20%. У випадках ЦІН ІІ кількість клітин з інтрануклеарною реакцією збільшувалась до 10-50%, позитивно забарвлені клітини займали від 1/3 до 2/3 товщі ЕШМ, інтенсивність імуногістохімічної реакції була помірною та високою. При ЦІН ІІІ кількість диспластично змінених клітин з переважно високою інтрануклеарною реакцією коливалась від 45 до 80%, розташовувались вони гетеротопічно в усіх шарах епітелію, в тому числі і зовнішніх. В РШМ ІП коливався в межах від 45% до 90% з високою інтенсивністю реакцій у більшості клітин. У випадках ЗПР ділянки зроговіння характеризувались відсутністю Кi-67-позитивності клітин. Найбільш чисельними й інтенсивними були інтрануклеарні ІГХ реакції в зонах інвазивного росту пухлин.

Проведений нами аналіз відмінностей показників ІП у різних групах ЦІН та інвазивних раках дав підстави запропонувати діапазони значень параметра, які відображають залежність останніх від ступеня диспластичних та неопластичних ушкоджень ЕШМ: високий ІП при забарвленні більш 50% клітин, низький – при реакції менше10% клітин, 10-50% - помірна проліферативна активність. Це загалом узгоджується з підходами ряду авторів (Cambruzzi E., 2005), хоча деякі автори пропонують інші варіанти оцінки рівня експресії Кі-67 при патології ШМ (Фролова И. И. та ін., 2002).

Виявлено, що ІП в однорідних групах був суттєво вищим в ушкодженнях асоційованих з ВПЛ ВКР. Так, низький ІП визначався лише в 8,2% випадків, що містили ДНК ВПЛ ВКР, в той час як помірний та високий – в 25,3% та 40,2% спостережень відповідно. Індекс проліферації позитивно корелює зі ступенем диспластичних та неопластичних ушкоджень (r=+0,89) та ступенем диференціювання, тобто агресивною поведінкою інвазивних пухлин (r=+0,65). Таким чином, експресія Kі-67 збільшується з мірою наростання рівня онкотрансформацій епітелію шийки матки і досягає максимуму при інвазивному раці шийки матки. Високий рівень проліферації є 100% специфічним індикатором ЦІН та В-ПІУ та специфічним тестом для визначення ВПЛ ВКР (94.6%), рівень ІП вищий за 10% є чутливим тестом виявлення В-ПІУ (90,1%), що узгоджується з іншими дослідженнями (Ohara M., 2004).

При вивченні рівня експресії VEGF в контрольній групі нами не виявлено випадків VEGF - позитивного статусу. Відносний об’єм капілярів у субепітеліальній і глибоких зонах слизової оболонки дорівнював 13,51,00 мкм3/мкм3 та 13,20,97 мкм3/мкм3 відповідно. При оцінці експресії VEGF в епітелії шийки матки при ЦІН І 63,3% випадків ми розцінили як негативні, в 2 ушкодженнях визначалась помірна експресія цього маркера. ВОК під епітелієм складав 19,40,67 мкм3/мкм3, в глибоких зонах – 17,80,61 мкм3/мкм3. При ЦІН ІІ в 48,2% випадків спостерігалось слабке забарвлення, в 27,5% – помірне, в 24,1% ушкоджень ми не виявили імуногістохімічної реакції. ВОК під епітелієм та в глибоких зонах дорівнював 22,10,54 мкм3/мкм3 та 20,10,49 мкм3/мкм3 відповідно. Помірна та інтенсивна експресія VEGF асоціювалась з випадками ЦІН ІІІ та інвазивними раками. Зокрема, при ЦІН ІІІ кількість випадків з помірним і інтенсивним забарвленням було 10 (31,2%) і 15 (46,8%) відповідно, в решті спостережень спостерігались слабка та негативна експресія. ВОК під епітелієм дорівнював 34,21,06 мкм3/мкм3, в глибоких зонах – 28,70,92 мкм3/мкм3. При інвазивних раках помірна реакція зустрічалась в 25% спостережень, а інтенсивна - в 58,3%. 2 спостереження ВДАК та 3 випадки ЗПР ми віднесли до групи із слабкою реакцією, один випадок ЗПР був розцінений як негативний. Серед групи пухлин з інтенсивною експресією VEGF переважали НПР та НДАК. Показники ВОК в стромі раків складали в середньому 32,10,95 мкм3/мкм3.

Інтенсивність імуногістохімічних реакцій з VEGF була вищою в ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР. Так, негативний статус до VEGF в ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР, спостерігався тільки у 5,22% випадків, тоді як слабка, помірна та інтенсивна – в 20,1%, 21,6% та 25,3% випадків відповідно. З одного боку, ці дані узгоджуються з рядом досліджень (Branca M. та ін., 2006; Terlikowski S. та ін., 2001). З іншого, в літературі описана відсутність кореляції між рівнем VEGF та відносним об’ємом капілярів (Soini Y. та ін., 1996; Hashimoto I. та ін., 2001). У нашому дослідженні визначено прямий кореляційний зв’язок рівня експресії VEGF з відносним об’ємом капілярів (r=+0,76), ступенем тяжкості диспластичних ушкоджень (r=+0,79) та низьким ступенем диференціювання інвазивних пухлин (r=+0,70). Таким чином, інтенсивне VEGF забарвлення є 100% специфічним індикатором ЦІН і В-ПІУ та є специфічним тестом для визначення ВПЛ ВКР (специфічність дорівнює 94,6%).

Для вивчення процесів диференціювання в ЕШМ ми провели аналіз показника експресії р63 у пацієнток з диспластичними та неопластичними процесами шийки матки. Середнє значення індексу експресії р63 при ЦІН І (27,01,05) статистично вагомо перевищувало аналогічний показник у контрольній групі (9,140,91) майже у 3 рази, при ЦІН ІІ (45,22,22) –у 5 разів (р<0,05). Показники р63 позитивності при ЦІН ІІІ (72,22,06) та інвазивних раках (65,06,33) достовірно перевищували контрольні показники у 8 та 7 разів відповідно.

У незміненому епітелії позитивна імуногістохімічна реакція з р63 виявлялась виключно в ядрах клітин базального шару. При ЦІН І частота р63-позитивних ядер коливалась від 20 до 40%, усі вони переважно розташовувалися в базальному та парабазальному шарах. У випадках ЦІН ІІ позитивно забарвлені клітини займали від 1/3 до 1/2 товщі епітеліального шару шийки матки, кількість клітин з р63-позитивними ядрами складала 40-60%. При ЦІН ІІІ частота диспластично змінених клітин з ядрами, що позитивно реагують на р63, коливалась від 60 до 90%, при цьому клітини з імуногістохімічною міткою виявлялися в усіх шарах епітелію.

У випадках ПР спостерігались найбільш високі показники експресії р63, кількість клітин з інтрануклеарною реакцією сягала 90-100%. Індекс р63 позитивності при НПР статистично вагомо перевищував аналогічний показник у ЗПР на 11%. Слід відзначити, що експресія р63 в аденокарциномах була мінімальною, що обумовлює використання цього маркеру як диференціальнодіагностичного для визначення плоскоепітеліальної природи пухлини.

При аналізі експресії р63 нами запропоновано діапазони значень параметра, які відображають залежність порушення диференціювання клітин ЕШМ від ступеня диспластичних та неопластичних ушкоджень: низький рівень р63 експресії (<30% клітин з інтрануклеарною реакцією), помірний рівень (30-75%) та високий - >75% клітин з імуногістохімічною міткою в ядрах. Згідно нашим даним, рівень експресії р63 був суттєво вищим в ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР. Зокрема, низький рівень р63 експресії визначався лише в 11,9% випадків, що містили ДНК ВПЛ ВКР, тоді як помірний та високий – в 29,1% та 31,3% спостережень відповідно.

Не визначено значного кореляційного зв’язку експресії р63 з рівнем ІП. Позитивна р63 експресія є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та 100% специфічним і 100% чутливим маркером плоскоклітинного диференціювання при РШМ, високий рівень р63 експресії є 100% специфічним методом виявлення В-ПІУ та ВПЛ ВКР. При цьому була визначена висока пряма кореляція між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки, кількісними показниками інтрануклеарних реакцій та інтенсивністю забарвлення з р63 (r=+0,89).

Проведений нами аналіз відмінностей середніх значень р53 експресії у всіх клінічних групах дає підстави передбачати зв’язок між рівнем р53 експресії та ступенем диспластичних і непластичних процесів ЕШМ. Так, при ЦІН І індекс р53 експресії (1,900,23) статистично вагомо перевищував аналогічні показники в контрольній групі (0,210,14) (більш як в 9 разів), а при ЦІН ІІ (4,550,42) – у 21 раз (р<0,05). Середній рівень р53 позитивності при ЦІН ІІІ (27,13,19) та інвазивних раках (27,13,19) різко перевищував контрольні показники – в 129 та 183 рази відповідно. Середнє значення р53 позитивності при НПР достовірно перевищувало аналогічний показник у ЗПР майже у 2 рази. Подібну тенденцію ми спостерігали і в аденокарциномах: у НДАК середній показник р53 експресії був вище майже у 2 рази, ніж у випадках ВДАК (р<0,05).

У контрольній групі виявлялось 0-1% позитивно забарвлених з р53 клітин базального шару слабкої інтенсивності. При ЦІН І кількість р53-позитивних ядер коливалась від 0 до 4 % зі слабкою та помірною інтенсивністю реакції. При ЦІН ІІ кількість клітин з позитивно забарвленими ядрами коливалася від 0 до 10%; інтенсивність реакції була слабкою та помірною. При ЦІН ІІІ кількість клітин з інтрануклеарною реакцією коливалась від 0 до 55%, інтенсивність реакцій переважно була помірною, рідше слабкою та інтенсивною. Топологічно більшість позитивно забарвлених клітин визначалась у базальному та парабазальному шарах епітелію. В групі пацієнток з ВДАК та ЗПР реакція спостерігалася у 10-40% клітин зі слабкою інтенсивністю реакції. В НДАК та НПР кількість забарвлених клітин досягала 60-70%, з помірним та високим ступенем інтенсивності реакцій.

У нашому дослідженні ми розподілили всі випадки диспластично та неопластично зміненого ЕШМ та спостереження контролю на групи з позитивним і негативним статусом щодо р53 експресії з урахуванням ступеня інтенсивності імуногістохімічного забарвлення та кількості клітин з інтрануклеарною реакцією. При забарвленні менше 5% ядер, поза залежністю від інтенсивності, пухлина або диспластично змінений епітелій вважалися р53-негативними. Позитивний статус до р53 встановлювався при: 1) забарвленні більш 50% ядер поза залежністю від інтенсивності, 2) інтенсивному забарвленні більш 5% ядер, 3) помірному забарвленні 10-50% ядер. Ряд авторів використовують спрощений варіант оцінки р53 експресії: при забарвленні більше 5% ядер, поза залежністю від інтенсивності, матеріал вважають р53-позитивним (Herbsleb M. та ін., 2001; Klussmann J.P. та ін., 2003).

Згідно з нашими даними, рівень експресії р53 не залежав від наявності ВПЛ ВКР. Позитивна р53 експресія є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та є чутливим, але не специфічним, маркером низького ступеня диференціювання РШМ (чутливість – 100%, специфічність - 29,2%). Дослідження виявило прямий кореляційний зв’язок між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки і експресією р53 (r=+0,69). Отже, з наростанням неопластичних процесів в епітелії шийки матки від ЦІН І до ЦІН ІІІ та інвазивних раків експресія продуктів цього гена збільшується і забарвлення з р53 виявляється в ядрах клітин з ознаками атипії в усіх епітеліальних шарах.

При проведенні імуногістохімічних реакцій до рецепторів стероїдних гормонів було визначено, що в незміненому епітелії шийки матки (контрольна група) клітини базального шару були негативними у відношенні експресії PgR та позитивними у відношенні експресії ER, без кореляції з фазою менструального циклу. Парабазальні клітини демонстрували позитивну реакцію з ER та негативну – з PgR у фолікулярній фазі. При ЦІН І ми спостерігали позитивну реакцію з PgR у 26,6% та з ER у 20,0% спостережень. Всі позитивно забарвлені клітини розташовувались у базальному та парабазальному шарах епітелію. При ЦІН ІІ позитивна реакція з PgR була визначена в 20,7%, з ER - у 13,7% спостережень. 6 випадків ЦІН ІІІ (18,7%) були ER-позитивними та 5 випадків (15,6%) – PgR-позитивними, в той час як більшість ушкоджень такого типу були негативними щодо експресії стероїдних рецепторів.

При інвазивних плоскоклітинних раках імуногістохімічна реакція з PgR спостерігалась у 19,4% випадків, причому в 1 випадку кількість клітин з імуногістохімічною реакцією сягала 40-50%. Експресія ER спостерігалась у 4 випадках РШМ (11,1%), кількість клітин з імуногістохімічною реакцією (не лише в різних пухлинах, але і в різних зонах однієї і тієї ж пухлини) коливалася значною мірою та становила від 5 до 20%. АК шийки матки були PgR-позитивними в 3 із 9 випадків, ER-позитивними – в 2 спостереженнях. Інтенсивність забарвлення та кількість позитивних клітин позитивно корелювали зі ступенем гістологічного диференціювання інвазивних пухлин (r=+0,62).

Негативна експресія як ER, так і PgR є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та 100% чутливим маркером низького ступеню диференціювання пухлин шийки матки; негативна реакція з ER рецепторами є чутливим індикатором наявності ДНК ВПЛ ВКР (92.7%), хоча специфічність та ППЧ дорівнюють лише 16,6% та 37,5% відповідно. Таким чином, в нашому дослідженні був визначений зворотний зв’язок ступеня ушкодження шийки матки з інтенсивністю забарвлення з ER та PgR.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі подано теоретичне узагальнення та нове вирішення науково-практичного завдання, яке полягає у встановленні взаємозв’язку між характером і ступенем виразності диспластичних і неопластичних процесів епітелію шийки матки та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів біологічних властивостей тканин, удосконаленні гістологічної діагностики передракових та ракових захворювань шийки матки, ступеня їх диференціювання та розробленні критеріїв прогнозування прогресії цервікальних інтраепітеліальних неоплазій для формування груп ризику. Отримані дані є основою для наступних експериментальних та клінічних досліджень у галузі гінекології та патологічної анатомії.

1. ДНК ВПЛ ВКР виявляється у 72,4% жінок, генетичний матеріал ВПЛ НКР визначається у 11,2% пацієнток, у 16,4% випадків не знаходиться ДНК ВПЛ будь-якого типу. Із них серед жінок контрольної групи не виявляються жодні фрагменти ДНК ВПЛ у 71,4% випадків, ДНК ВПЛ НКР визначаються в 14,3%, ДНК ВПЛ ВКР присутня в 14,3% спостережень. У жінок з диспластичними та неопластичними процесами не виявляються фрагменти ДНК ВПЛ жодного типу в 13,4% ушкоджень, ДНК ВПЛ НКР наявна в 11,0% спостережень, у 75,6% випадків визначається ДНК ВПЛ ВКР. Існує прямий кореляційний зв’язок між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки та інфікованістю ВПЛ ВКР (r=+0,67).

2. Дифузна реакція з р16INK4A спостерігається у 53,0% ушкоджень шийки матки, у 20,9% визначається фокальний варіант забарвлення, у 26,1% не виявляється експресія р16INK4A. Дифузне забарвлення з р16INK4A визначається у переважній більшості пацієнток із груп з ЦІН ІІ (48,3%), ЦІН ІІІ (81,2%) та інвазивними раками (86,1%) та корелює з визначенням ДНК вірусів папіломи людини високого ступеня ризику (r=+0,91) та ступенем диспластичних і неопластичних процесів епітелію шийки матки (r=+0,87). Позитивне забарвлення р16 INK4A є 100% специфічним індикатором ЦІН, чутливим показником В-ПІУ (93,8%) та визначення ВПЛ ВКР (87,6%).

3. Експресія білка Kі-67 збільшується з наростанням ступеня диспластичних ушкоджень епітелію шийки матки і досягає максимуму при інвазивному раці шийки матки; односпрямовано змінюється і локалізація Кi-67-позитивних клітин в товщі епітелію. Індекс проліферації позитивно корелює зі ступенем диспластичних