НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ
Пазюк Олег Анатолійович
УДК 631.523
ГЕНЕТИЧНА МІНЛИВІСТЬ СИМБІОТИЧНИХ ОЗНАК ЛЮЦЕРНИ ПОСІВНОЇ
03.00.15 – генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2000
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України
Науковий керівник – доктор біологічних наук
Нічик Майя Михайлівна
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України
провідний науковий співробітник
Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професор
Чекалін Микола Михайлович
Полтавський аграрний університет
професор
кандидат біологічних наук
Єрко Володимир Миколайович
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України
зав. відділом
Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного
НАН України, Київ
Захист відбудеться 19 жовтня 2000 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ 22, вул. Васильківська, 31/17
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, вул. Васильківська, 31/17
Автореферат розісланий 16 вересня 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Проблема симбіотичної азотфіксації молекулярного азоту є фундаментальною проблемою теоретичної і прикладної біології. Знання генетики симбіозу, генетичний аналіз всіх факторів процесу симбіотичної азотфіксації надасть можливість покращити властивості фіто- і ризобіопартнерів, використати значний біологічний резерв рослин і бактерій з метою підвищення ефективності симбіозу і фіксації атмосферного азоту, що безпосередньо пов'язано з урожайністю важливих кормових культур. Симбіоз між Rhizobium meliloti i Medicago sativa L. може бути моделлю для вивчення комплексної взаємодії між бобовими рослинами і бульбочковими бактеріями.
Необхідними етапами вивчення генетики системи Medicago sativa L. - Rhizobium meliloti є дослідження: рівня мінливості і варіабельності, характеру і закономірності розподілу рослин за симбіотичними ознаками; відносного внеску симбіопартнерів у формуванні ознак симбіозу; їх успадковуваності; впливу інбридингу; ефекту гетерозису; характеру і сили зв'язку між ознаками симбіозу. Знання цих генетико-статистичних параметрів симбіосистем дозволить проводити наступні генетичні дослідження, а також здійснювати селекцію на створення високопродуктивних сортів люцерни і штамів бульбочкових бактерій.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у відповідності з планами науково-дослідних робіт відділу симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики на 1990-2000 рр. “Дослідження процесів взаємодії бульбочкових бактерій з бобовими рослинами з метою максимальної реалізації азотфіксуючого потенціалу симбіонтів”, “Вивчення механізмів фізіолого-генетичних процесів фіксації азоту з метою формування високопродуктивних азотфіксуючих систем бобових рослин”.
Мета роботи полягала у дослідженні лінійних і гібридних рослин люцерни, зокрема:
1. визначення ступеня мінливості і закономірності розподілу рослин за ознаками кількості бульбочок і азотфіксувальної активності, маси і висоти рослин;
2. встановлення відносного внеску генотипів люцерни і ризобій у формуванні симбіотичних ознак;
3. розрахування коефіцієнту успадковуваності ознак симбіозу;
4. визначення напрямку і сили впливу інбридингу на показники симбіозу;
5. встановлення величини гетерозису гібридів по відношенню до вихідних ліній за ознаками симбіозу;
6. визначення напрямку і сили взаємодії між кількістю бульбочок і нітрогеназною активністю, масою і висотою рослин.
Завдання роботи полягало в наступному:
1. дослідити рівень мінливості і характер розподілу рослин двадцяти ліній Medicago sativa L. різного походження і покоління інбридингу I3-I7 в симбіозі із штамом М4 за ознаками нодуляційної і азотфіксувальної активності, маси і висоти зелених рослин; встановити силу відносного внеску генотипів рослин у формуванні симбіотичних ознак; виявити знак і силу впливу покоління інбридингу на досліджувані ознаки; встановити напрямок і величину зв'язку між азотфіксацією і кількістю бульбочок, масою і висотою рослин; відібрати контрастні (“плюс” і “мінус”) лінії за інтенсивністю нітрогенази і кількістю бульбочок для одержання від них рослин подальшого покоління інбридингу (In+1) і гібридів першого покоління (F1) шляхом діалельних схрещувань;
2. визначити рівень варіювання і закономірності розподілу інбредних лінійних (In і In+1) і гібридних (F1) рослин люцерни за кількістю бульбочок і азотфіксацією, масою і висотою рослин в симбіозі із штамами 34, 425а і М4; встановити відносний внесок лінійних і гібридних рослин та бульбочкових бактерій у формуванні симбіотичних ознак; визначити коефіцієнт успадковуваності ознак симбіозу у широкому змісті слова для F1; визначити вплив інбридингу на симбіотичні ознаки ліній наступного покоління самозапилення; встановити ефект гетерозису симбіотичних ознак у гібридів F1 по відношенню до вихідних ліній; виявити характер і силу зв'язку між досліджуваними ознаками; одержати наступне інбредне (In+2) і гібридне покоління (F2) шляхом примусового самозапилення;
3. дослідити мінливість і закономірності розподілу лінійних (In і In+1 і In+2 ) і гібридних (F1 і F2) рослин в симбіозі із штамами 34, 425а і М4 за кількістю бульбочок і азотфіксацією, масою і висотою рослин; встановити відносний внесок рослин ліній, гібридів та бульбочкових бактерій у формуванні досліджуваних ознак; знайти коефіцієнти успадковуваності симбіотичних ознак для F2; виявити знак і силу дії на симбіотичні ознаки подальшого інбридингу; встановити ефекти гетерозису F1 і прибавок у F2 по відношенню до вихідних ліній в залежності від генотипів симбіопартнерів; виявити і порівняти характер взаємодії між досліджуваними ознаками у ліній і гібридів різного покоління.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на лінійних і гібридних рослинах Medicago sativa L., які було бактеризовано еталонним (425а) і новими штамами (34 і М4) Rhizobium meliloti:
1. встановлено кількісний і якісний характер мінливості і варіабельності, характер і закономірності розподілу рослин за ознаками кількості бульбочок і азотфіксації, маси і висоти рослин різних генотипів;
2. виявлено відносний внесок генотипів фіто- і ризобіопартнерів у формуванні симбіотичних ознак;
3. розраховано коефіцієнти успадковуваності показників симбіотичних ознак в залежності від природи симбіонтів;
4. встановлено величину негативної дії інбридингу на активність симбіотичних ознак;
5. обчислено ефект гетерозису у гібридів по відношенню до вихідних ліній;
6. встановлено якісний і кількісний характер зв'язку між досліджуваними симбіотичними ознаками у ліній і гібридів в залежності від штаму.
Практичне значення одержаних результатів. Встановлено якісні і кількісні генетико-статистичні параметри симбіотичної системи Medicago sativa L. – Rhizobium meliloti, які поглиблюють знання генетики симбіозу. Одержані результати можуть бути використані для подальшого вивчення генетики симбіозу і селекції на підвищення симбіотичної ефективності.
Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто опрацював відповідну літературу та оволодів необхідними методами досліджень, особисто провів планування і виконання дослідів, статистичну обробку та підготовку матеріалів до друку.
Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на Міжнародній нараді з актуальних питань фізіології рослин в аспектах екологічних проблем України (Чернівці, жовтень 1995 р.). Результати досліджень дисертаційної роботи доповідались на VI конференції молодих вчених з актуальних проблем фізіології рослин і генетики (Київ, жовтень 1996 р.).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 8 робіт, з них 5 статей у провідних фахових виданнях.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 248 сторінках машинописного тексту, з 18 таблицями і 20 ілюстраціями. Дисертація складається зі списку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів експериментальної частини, обговорення одержаних результатів, висновків, списку використаних джерел. Додатки містять 95 таблиць, які займають 95 сторінок. Список літератури охоплює 258 найменування.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Бульбочкові бактерiї люцерни посiвної - Rhizobium meliloti одержано з колекцiї вiддiлу симбiотичної азотфiксацiї Iнституту фiзiологiї рослин i генетики НАН України (Київ). Штами 34 і М4 було отримано генетико-селекцiйними методами у цьому ж вiддiлi.
Штам “425а-34” отримано методом транспозонового мутагенезу ризобiй вiд штаму-стандарту 425а. Як донор Tn5 використовували вектор рSUP 2021 (Ничик М.М., 1994). Використовувалось селективне середовище 79 з антибiотиками (Nal+Nm);
Штам "ВНИИСХМ М4" отримано методом мiжродової кон'югацiї Escherichia coli JC 5466 (pRDI) i Rhizobium meliloti при селекцiї за ознакою “азотфiксувальна активнiсть” (Ничик М.М., 1983).
Рослини двадцяти рiзних за походженням i поколiнням iнбридингу лiнiй Medicago sativa L. 295-29 (I5) - Еврiка-4, 151-2 (I6), 152-7 (I6), 167-4 (I6) - Еврiка-10 - Україна; 270-1 (I4) - Морiс Кабул, 192-2 (I6) - Фелу, 177-4 (I4), 179-3 (I6), 182-4 (I6) - Кiшвардi 16, 171-9 (I6) - Кiшвардi 27, 155-9 (I7), 154-8 (I6), 158-7 (I7), 162-9 (I7) - Кiшвардi 46 - Угорщина; 276-18 (I3) - мiсцева ФРН - Нiмеччина; 191-2 (I6), 212-7 (I4) - Альфа-38, 229-4 (I5) - Вертус - Швецiя; 198-4 (I4), 298-2 (I5) - Бореалє-47 - Францiя одержано від д.б.н. А.Ф. Бобра iз колекцiї вiддiлу генетики кормових культур Iнституту землеробства УААН (Чабани). Як контроль використовували рослини сорту Ярославна, який являється нацiональним стандартом з насiннєвої продуктивностi.
В умовах мікровегетаційного стерильного досліду лінійні і контрольні рослини тестували за кількістю утворених бульбочок і азотфіксувальною активністю, масою і висотою рослин в лабораторiї симбiотичної азотфiксацiї Iнституту фiзiологiї рослин i генетики НАН України.
Мiкровегетацiйний стерильний дослiд. Скарифiковане насiння стерилiзували 2,5 хв 3,3-% розчином перекису водню, пророщували протягом доби в чашках Петрi на вологому фiльтрувальному паперi у термостаті при 28 0C. По одному проростку висаджували в склянi пробiрки (20Ч195 мм, об'єм 60 мл) iз стерильним перлiтом (3,5 г) і середовищем Красильникова-Кореняко (Федоров, 1951) без азоту (9 мл) та сумiшшю мiкроелементiв (1 мл). Інокуляцiю рослин проводили суспензiєю тижневої культури штаму М4 (1 мл, концентрацiя 108 клiтин/мл, Федоров, 1951) i закривали пробкою. На 10-й день вегетацiї в розчин добавляли 0,1 норми азоту з метою запобігання азотному голоданню. Рослини вирощували при 16-годинному природному освiтленнi. Нітрогеназну активнiсть вимірювали через 24 години ацетиленовим методом (Hardy, Holsten, 1963) на газовому хроматографi “Хром 504” виробництва ЧССР. Для цього пробірки з рослинами герметично закривали ковпачками і вводили в них ацетилен (10 % від об'єму пробірки). Кількість бульбочок оцінювали підрахунком, ефективність симбіозу - по масі і висоті зелених рослин.
На основi тестування рослин в мiкровегетацiйному стерильному дослiдi було відібрано контрастнi лiнiї за iнтенсивнiстю азотфiксацiї - 212-7+, 229-4+, 298-2+, 171-9-, 192-2- і за кількістю бульбочок - 152-7+, 295-29+, 154-8+, 198-4-, 192-2-. При доборi лiнiй уникали генотипiв iз значною iнбредною депресiєю.
Від відібраних ліній шляхом примусового самозапилення в подальшому отримали рослини наступного покоління інбридингу, а шляхом штучної гібридизації - гібриди F1. Для самозапилення і гібридизації рослини вирощували в грунті.
Примусове самозапилення i штучна гiбридизацiя. На китицi рослин, якi мали бути запиленi з метою отримання лiнiйних i гiбридних рослин, перед початком цвiтiння одягали двошаровi марлевi iзолятори. Iзолятори пiдв'язували до металевих прутiв - опор.
Самозапилення ліній (з метою отримання наступного покоління інбридингу) і F1 (для одержання F2) проводили шляхом стискання анатомiчним пiнцетом пружних колонок (маточка i трубочка iз тичинками, що зрослися) iзольованих квiток, якi розпустилися, але ще не розкрилися. Пружиниста колонка з силою викидалася з човника на прапорець. В момент удару (трипiнг) колонки об прапорець у приймочки пошкоджувалася плiвка, пилок висипався на приймочку i проростав, викликаючи самозапилення.
Штучне схрещування ліній (для одержання F1) проводили без кастрацiї. Для цього квiтки батькiвських рослин, якi розпустилися, але не розкрилися (колонки не викинутi на прапорець) легким натисканням одною стороною пiнцету на основу човника викликали викидання колонки з таким розрахунком, щоб вона вдарилася об пiнцет i залишила на ньому свiй пилок. Потiм пiнцетом з пилком таким же прийомом вiдкривали три-п'ять квiток на суцвiттi материнської рослини. При викиданнi колонка материнської квiтки вдарялася приймочкою об купку пилку на пiнцетi. Отриманi плоди знiмали при повному їх достиганнi разом з iзоляторами.
Одну частину одержаних рослин тестували в вегетаційних дослідах, іншу вирощували в грунті для одержання наступного покоління ліній і F2.
Вегетацiйнi дослiди. Варiанти дослiдiв складалися з 3-16 рослин, кожна з яких правила за повторність. Посудини - пластиковi ємкості висотою 10 см; об'ємом 440 мл. Субстрат - промитий рiчковий пiсок (0,620 кг). Поживна сумiш - розчин Прянiшнiкова з повною нормою азоту. Скарифiковане насiння рослин стерилiзували 2,5 хв 3,3-% розчином перекису водню, промивали проточною водопровідною водою та iнокулювали. Бактеризацiю проводили суспензiєю Rhizobium meliloti штамiв 425а, 34 і М4 об'ємом 3 мл, концентрація 108 клiтин/мл. Iнокуляцiю проводили в пробiрках. У посудини висаджували по 5 рослин.
Вегетацiя рослин проходила в умовах теплицi. Строк вегетації 43 доби. Для аналiзу азотфiксувальної і бульбочкоутворювальної активностей, маси i висоти рослини коренi вiдмивали вiд пiску, кореневу систему вiддiляли вiд пагонiв на рiвнi кореневої шийки. Для аналiзу нiтрогеназної активностi коренi (по одному) розміщували у пенiцилiновi флакони, об'ємом 15 мл i герметично закривали металевими стоперами. У флакони вводили 1,5 мл ацетилену (10 % вiд об'єму флакону). Після інкубацiї коренiв з ацетиленом аналізували кількість бульбочок, вимірювали масу і висоту рослин.
Вирощування рослин на грунті. Використовували посудини Вагнера на 11 кг грунту (опiдзолений чорнозем), в який додавали поживний розчин Прянiшнiкова з повною нормою азоту (Гродзінський, 1964). Нескарифiковане насiння лiнiй i гiбридiв F1 бактеризували штамом М4. Залишали по 8 рослин на посудину.
Перед початком цвiтiння з метою уникнення неконтрольованого запилення на китицi люцерни одягали двошаровi марлевi iзолятори. Проводили штучне примусове самозапилення лiнiй i F2. Плоди з насiнням знiмали при повному їх достиганнi разом з ізоляторами.
Статистичнi методи. Отриманi експериментальнi данi оброблялись методами бiометрiї, статистичної та бiометричної генетики (Рокицкий П.Ф., 1978, Доспехов Б.А., 1985, Лакин Г.Ф., 1973, 1990, Мазер К., Джинкс Дж., 1985, Мармоза А.Т., 1990, Плохинский Н.А., 1964, Боме Н.А., 1987, Голодрыга П.Я., Трошин Л.П., 1978, Гужов Ю.Л., Фукс А., Валичек П., 1991, Мартынов С.П., Добротворская Т.В., 1996).
В загальних статистичних i бiометрико-генетичних аналiзах використовувалися власнi i широкорозповсюдженi бiометричнi програми для ЕОМ (Diana, Reanal, Tstat, Nsr, Korrel, Quattro 4.00, SPSS 9.0).
МІНЛИВІСТЬ І ЗАКОНОМІРНОСТІ РОЗПОДІЛУ КІЛЬКОСТІ БУЛЬБОЧОК І АЗОТФІКСУВАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ, МАСИ І ВИСОТИ РОСЛИН
Виявлена значна мінливість за кількістю бульбочок і нітрогеназною активністю, масою і висотою рослин, яка залежить від генотипів симбіонтів (табл. 1). Найбільша мінливість рослин спостерігається за азотфіксацією. Значна мінливість ліній викликається інцухт-депресією і екологічною нестабільністю інбредних рослин. На покоління F1, що не розщеплюється, як і лінійні рослини, сильніше впливають модифікаційні чинники. Максимальна внутрішньогрупова мінливість спостерігалася у рослин F2 за кількістю бульбочок і азотфіксацією. Внаслідок значної варіабельності внутрішньогрупова модифікаційна мінливість за дослідженими ознаками наближалася до міжгрупової - фенотипічної. Тому групи з відмінними середніми показників часто достовірно не відрізнялися між собою. Основна маса ліній за кількістю бульбочок і азотфіксацією, масою і висотою рослин не перевищує контроль. Гібриди F1 i F2 в основному перевищують середні показники вихідних ліній і контролю.
Найменший рівень мінливості кількості бульбочок і азотфіксації, маси й висоти рослин виявлено при інокуляції рослин штамом М4. Достовірно відмінні генотипи ліній і гібридів за дослідженими ознаками виявлялися у випадку, якщо вони були інокульовані штамом М4. Найбільшим розмахом мінливості й помилками одержаних показників характеризувалися вибірки штаму 425а. Штам М4 забезпечував максимальну масу й висоту рослин, а за кількістю утворених бульбочок і азотфіксацією не відрізнявся від штамів 34 і 425а.
Таблиця 1.
Мінливість і характер розподілу рослин за кількістю бульбочок і азотфіксацією, масою й висотою ліній і гібридів Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti
Ознака x±sx Cv, % sx2 As Ex
Кількість бульбочок на рослині 4,2±0,1 92,5 15,0 +1,5 +3,2
Азотфіксація, нмоль C2H4/рослину/24 г 911,4±60,8 182,0 2750556,0 +1,7 +3,6
Маса рослин, мг 133,3±4,5 92,0 15033,7 +1,2 +1,6
Висота рослин, см 7,2±0,2 66,8 23,0 +0,7 -0,4
Поліморфізм люцерни за дослідженими ознаками дозволяє відібрати необхідний матеріал для генетичних досліджень симбіотичної азотфіксації і селекційних цілей.
Розподіл рослин за кількістю бульбочок і азотфіксацією, масою й висотою рослин позитивно-асиметричний (рис. 1). Досліджені рослини утворювали незначну кількість бульбочок і мали незначну нітрогеназну активність. Розподіл ліній з максимальними показниками кількості бульбочок і азотфіксації, маси й висоти рослин наближається до симетричного. Розподіл гібридів F1 i F2 більш симетричний, ніж ліній, що вказує на стабільність гібридів порівняно з лініями за всіма ознаками. Вибірки штаму М4 характеризувалися більш симетричним розподілом рослин за дослідженими ознаками. Криві розподілу за всіма дослідженими ознаками характеризуються багатоверхівковістю.
Рис. 1. Емпіричні криві розподілу кількості бульбочок (А), азотфіксації (Б), маси (В) і висоти рослин (Г) ліній, F1 i F2 Medicago sativa L. в симбіозі із штамами 34, 425а і М4 Rhizobium meliloti : по вертикалі - кількість рослин (частота), по горизонталі – розподіл варіант (n=744)
Аналіз показників варіації й розподілів свідчить про відносну незалежність між ознаками кількості бульбочок і азотфіксації, з одного боку, та масою й висотою рослин, з іншого. Найкращі лінії за однією ознакою не проявляють себе кращими за іншими ознаками. Це свідчить про різний генетичний контроль досліджених ознак.
Штами 34 і 425а, які мають генетичну спорідненість через спільне походження, проявляють найбільшу позитивну кореляцію за показниками всіх досліджених ознак.
Між показниками мікровегетаційного й вегетаційного дослідів існує сильна позитивна кореляція.
ВІДНОСНИЙ ВНЕСОК ГЕНОТИПІВ СИМБІОНТІВ У ВИЗНАЧЕННІ КІЛЬКОСТІ БУЛЬБОЧОК І АЗОТФІКСУВАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ, МАСИ Й ВИСОТИ РОСЛИН
Генотипи Medicago sativa L. і Rhizobium meliloti впливають на показники кількості утворюваних бульбочок і азотфіксувальної активності, маси й висоти рослин ліній і гібридів. За однофакторним дисперсійним аналізом найбільший внесок у формуванні симбіотичних ознак належить генотипу рослин, за двофакторним аналізом - комплементарній взаємодії обох симбіонтів (табл. 2).
Таблиця 2.
Відносні внески генотипів симбіонтів у визначенні кількості бульбочок і азотфіксації, маси й висоти рослин ліній і гібридів Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti за одно- і двофакторним дисперсійним аналізом, %
Ознака Однофакторний аналіз Двофакторний аналіз
Бактерії Рослини Бактерії Рослини Взаємодія симбіонтів
Кількість бульбочок 14,2-28,9 13,3-97,0 3,3-6,4 5,1-16,1 5,7-50,7
Азотфіксація - 23,7-97,4 3,0 4,9-18,5 21,5-33,1
Маса рослин 13,4-15,5 16,8-75,8 6,4 17,2-24,8 5,7-51,1
Висота рослин 8,7-26,4 14,0-88,4 2,5-15,5 3,7-26,4 17,6-61,7
Максимальні внески рослин проявляються на утворенні бульбочок та їх азотфіксації. Незначна сила впливу штамів на формування ознак може бути пояснена подібністю досліджених штамів за симбіотичними властивостями. Неконтрольовані чинники часто перевищували 50,0 %, що є наслідком значного варіювання симбіонтів за дослідженими ознаками і сильного впливу на симбіотичні ознаки модифікаційних факторів середовища.
Внески лінійних рослин у формування досліджених ознак перевищують внески гібридів на лініях сильніше, ніж на гібридах, проявляється дія штаму, що виявляє їх більшу залежність від симбіотрофного азоту. Інбридинг збільшує величину внеску рослин і ризобій у формуванні симбіотичних ознак.
Із збільшенням рівня мінливості за рахунок варіювання трьох штамів внески рослин у досліджених ознак зменшувалися в 1,5-2 рази. Внутрішньогрупова мінливість у F2 дорівнює міжгруповій мінливості ліній і F1, що є наслідком розщеплення, яке зменшує внески симбіопартнерів.
Найбільші й достовірні внески у формуванні всіх ознак отримано для “плюс” ліній за кількістю утворюваних бульбочок та їх азотфіксацією - 152-7, 154-8, 198-4, 212-7, 229-4, 298-2.
На формування кількості бульбочок і ацетиленредуктазної активності, маси й висоти рослин найсильніше впливає штам М4.
Величини відносних внесків симбіонтів у формуванні симбіотичних ознак указують на можливість контролю рівня симбіотичної активності й ефективності шляхом добору генотипів рослин-господарів і бульбочкових бактерій.
КОЕФІЦІЄНТ УСПАДКОВУВАНОСТІ КІЛЬКОСТІ БУЛЬБОЧОК І АЗОТФІКСУВАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ, МАСИ Й ВИСОТИ РОСЛИН
Значення коефіцієнта успадковуваності (у широкому змісті слова) залежить від генотипу вихідних ліній і штаму бактерій. За однофакторним дисперсійним аналізом внески материнських і батьківських вихідних ліній на формуванні симбіотичних ознак достовірно не відрізнялися (табл. 3). Максимальні коефіцієнти успадковуваності належали кількості бульбочок та нітрогеназній активності. За двофакторним аналізом найсильніше на успадковуваність симбіотичних ознак впливав генотип рослини-господаря. Внесок лінійних рослин в успадковуваність ознак гібридами залежав від покоління інбридингу вихідних ліній і достовірно проявлявся як фактор взаємодії лінійного генотипу з поколінням інбридингу. Фактор неадитивної комплементарної взаємодії симбіопартнерів достовірно проявляє свою дію в успадковуваності досліджених ознак навіть при недостовірності окремих, адитивних внесків рослин і бактерій.
Із збільшенням фенотипічної мінливості за рахунок варіювання генотипів рослин і бактерій успадковуваність усіх досліджених ознак зменшувалася в 1,5-2 рази. На значення коефіцієнтів успадковуваності суттєво впливають модифікаційні чинники середовища.
Найбільші й достовірні значення коефіцієнтів успадковуваності для всіх ознак було отримано для “плюс” ліній з кількості бульбочок і азотфіксації. “Плюс” лінії проявили свою дію у формуванні маси й висоти рослин значно слабкіше, ніж у формуванні кількості бульбочок і активності нітрогенази, що свідчить про відносну незалежність даних ознак. Найбільші величини успадковуваності отримано в симбіозі із штамами 425а і М4. Отримані коефіцієнти успадковуваності свідчать про генетичну мінливість серед досліджених ліній за ознаками симбіозу і вказують на можливість добору з метою підвищення симбіотичної активності й ефективності.
Таблиця 3.
Коефіцієнти успадковуваності кількості бульбочок і азотфіксації, маси й висоти рослин ліній і гібридів Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti за одно- і двофакторним дисперсійним аналізом, %
Ознака Однофакторний аналіз Двофакторний аналіз
Батьківська форма Материнська форма Рослини Бактерії Взаємодія симбіонтів
Кількість бульбочок 25,3-99,9 2,7-99,6 86,8 43,7-58,4 87,3
Азотфіксація 22,1-99,7 50,3-97,3 49,5-71,6 22,0-27,9 35,7-68,6
Маса рослин 31,2-83,9 21,6-81,9 71,0-75,1 14,9 30,6-52,5
Висота рослин 18,4-85,1 25,1-75,8 71,0-78,0 14,0-40,5 33,6-52,9
ВПЛИВ ІНБРИДИНГУ НА КІЛЬКІСТЬ БУЛЬБОЧОК І АЗОТФІКСУВАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ, МАСУ Й ВИСОТУ РОСЛИН
Поглиблення інбридингу негативно й суттєво впливає на утворювану кількість бульбочок і азотфіксацію, масу й висоту рослин (табл. 4).
Таблиця 4.
Вплив інбридингу на кількість бульбочок і азотфіксацію, масу й висоту рослин ліній Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti за кореляційно-регресійними та одно- і двофакторними дисперсійними аналізами
Ознака r за кореляційним аналізом h2 за однофакторним аналізом, % h2 за двофакторним аналізом, %
Кількість бульбочок -0,4…-0,9 57,2-62,7 19,1-61,4
Азотфіксація -0,8…-0,9 26,4-29,7 -
Маса рослин -0,5…-0,7 27,7-30,1 53,7
Висота рослин -0,6…-0,9 - 14,1-59,3
Генотип фіто- і ризобіосимбіонта впливає на величину кореляційно-регресійної залежності між дослідженими ознаками й поколінням інбридингу. Інбредні рослини мають менші симбіотичні показники, ніж гібриди. Від'ємний вплив інбридингу за кореляційно-регресійними й дисперсійними аналізами сильніше позначився на утворенні бульбочок та інтенсивності ацетиленредукції. Найбільший негативний вплив інбридингу зазнали лінійні рослини, інокульовані штамом 34.
Теоретична регресія демонструє зменшення симбіотичних показників із збільшенням покоління інбридингу (рис. 2).
Рис. 2. Емпірична й теоретична регресія кількості бульбочок (А) і азотфіксації (Б), маси (В) і висоти рослин (Г) по поколінню інбридингу рослин ліній Medicago sativa L. в симбіозі із штамами 34, 425а і М4 Rhizobium meliloti: по вертикалі – покоління інбридингу рослин (In), по горизонталі - кількість бульбочок на рослину (А); азотфіксація, нмоль C2H4/рослину/24год (Б), маса рослин, мг (В), висота рослин, см (Г)
ВПЛИВ ГЕТЕРОЗИСУ НА КІЛЬКІСТЬ БУЛЬБОЧОК І АЗОТФІКСУВАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ, МАСУ Й ВИСОТУ РОСЛИН
Середній ефект гетерозису гібридів залежав від генотипів вихідних ліній і штаму ризобій. Середні показники гібридів за всіма ознаками звичайно перевищували лінійні значення. Найбільший ефект гетерозису був за кількістю бульбочок і активністю нітрогенази у гібридів, інокульованих штамом 425а, за ефективністю симбіозу (маса й висота рослин) у F1, бактеризованих штамом М4 (табл. 5). Максимальні ефекти гетерозису серед досліджених груп рослин характерні для штаму-еталону 425а. Найбільші прибавки кількості бульбочок і азотфіксації, маси й висоти рослин відмічено у гібридів, які походили від “плюс” ліній за нодуляційною й нітрогеназною активністю.
Таблиця 5.
Ефект гетерозису кількості бульбочок і азотфіксації, маси й висоти рослин гібридів F1 Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti (прибавка до середнього вихідних ліній, %)
Ознака Штам 34 Штам 425а Штам М4
Кількість бульбочок 118,6 148,5 87,0
Азотфіксація 244,2 271,6 96,1
Маса рослин 106,6 105,9 119,8
Висота рослин 105,6 106,5 120,4
КОРЕЛЯЦІЙНО-РЕГРЕСІЙНИЙ ЗВ'ЯЗОК МІЖ КІЛЬКІСТЮ БУЛЬБОЧОК І АЗОТФІКСУВАЛЬНОЮ АКТИВНІСТЮ, МАСОЮ І ВИСОТОЮ РОСЛИН
Між кількістю утворених бульбочок та їх азотфіксувальною активністю, масою і висотою рослин ліній і гібридів існує достовірний позитивний зв'язок середньої і вище сили (табл. 6). На величину кореляції між симбіотичними ознаками специфічно впливає генотип штаму.
Таблиця 6.
Коефіцієнти кореляції між кількістю бульбочок і азотфіксувальною активністю, масою і висотою рослин ліній і гібридів Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti (n=744)
Ознака Кількість бульбочок Азотфіксація Маса рослин Висота рослин
Кількість бульбочок - +0,4…+0,8 +0,4…+0,5 +0,3…+0,6
Азотфіксація +0,4…+0,8 - +0,4…+0,5 +0,2…+0,5
Маса рослин +0,4…+0,5 +0,4…+0,5 - +0,3…+0,9
Висота рослин +0,3…+0,6 +0,2…+0,5 +0,3…+0,9 -
Величина кореляції змінювалася в залежності від пар ознак, ступеня інбридингу ліній і покоління гібридів. Середня кореляція між кількістю бульбочок і азотфіксацією у всіх досліджених рослин +0,4; між кількістю бульбочок і азотфіксацією з одного боку та масою і висотою рослин з іншого боку +0,3...+0,4; між масою і висотою рослин +0,9.
Максимальні показники кореляції у вибірках проявили таку ж саму закономірність. Зв'язок між азотфіксацією та масою і висотою зелених рослині був найсильнішим у лініях, що виявляє залежність депресованих рослин від симбіотичного азоту.
Кореляційно-регресійні показники мікровегетаційного і вегетаційного дослідів добре збігалися.
ВИСНОВКИ
1. Існує високий рівень між- і внутрішньогрупової мінливості і позитивна асиметрія розподілу рослин ліній і гібридів Medicago sativa L. за кількістю бульбочок і азотфіксувальною активністю, масою і висотою рослин. Найсильніше варіює азотфіксація. Найбільша мінливість викликається штамом 425а.
2. Найсильнішим у формуванні симбіотичних ознак був фактор комплементарної неадитивної взаємодії рослин і ризобій, внесок рослин перевищував вплив генетично подібних штамів Rhizobium meliloti. Найбільший вплив на формування симбіозу чинять “плюс” лінії за кількістю бульбочок і азотфіксацією, інокульовані штамом М4.
3. Внески батьківських і материнських форм в успадковуваність досліджених ознак достовірно не відрізняються. На коефіцієнт успадковуваності симбіотичних ознак найсильніше впливав генотип рослини та фактор взаємодії симбіонтів. Успадковуваність кількості бульбочок і азотфіксації перевищує успадковуваність маси і висоти рослин. Найбільші коефіцієнти успадковуваності ознак симбіозу належать “плюс” лініям за кількістю бульбочок та нітрогеназною активністю, які інокульовані штамами 425а і М4.
4. Інбридинг зменшує симбіотичні показники, особливо кількості бульбочок і азотфіксації. Максимальна інбредна депресія спостерігалася у вибірках штаму 34.
5. У гібридів F1 спостерігається ефект гетерозису за ознаками симбіозу, особливо за кількістю бульбочок і ацетиленредукцією у рослин, інокульованих штамом 425а.
6. Між симбіотичними ознаками існує позитивний зв'язок. Кореляція між симбіотичною активністю і ефективністю - нижчесередньої сили, між кількістю бульбочок і азотфіксацією - середньої сили, між масою і висотою рослин - вищесередньої сили.
РОБОТИ, ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Пазюк О.А., Нічик М.М. Мінливість ліній люцерни посівної за активністю азотфіксації і бульбочкоутворення в симбіозі з Rhizobium meliloti. // Цитология и генетика. - 1998. – Т. 32, № 2. – С. 66-73.
2. Пазюк О.А. Наследуемость признака «высота растений» и его зависимость от генотипов симбионтов при взаимодействии линий и гибридов люцерны со штаммами Rhizobium meliloti // Цитология и генетика. - 1998. – Т. 32, № 4. – С. 37-42.
3. Пазюк О.А. Влияние симбиоза линий и гибридов люцерны с разными штаммами Rhizobium meliloti на высоту растений // Цитология и генетика. – 1998. – Т. 32, № 5. – С. 47-53.
4. Пазюк О.А. Изменчивость высоты растений линий и гибридов люцерны в симбиозе с разными штаммами Rhizobium meliloti // Цитология и генетика.- 1999. – Т. 33, № 3. – С. 65-72.
5. Нічик М.М., Пазюк О.А., Бобер А.Ф., Башкірова Н.В. Ефективність симбіозу люцерни з новими штамами бульбочкових бактерій, отриманих методом транспозонового мутагенезу // Физиология и биохимия культурных растений. - 2000. - Т. 32, № 3. - С. 219-222.
6. Пазюк О.А., Нічик М.М., Бобер А.Ф. Вивчення мінливості азотфіксуючої активності і нодуляції в люцерни посівної // Актуальні питання фізіології рослин в аспекті екологічних проблем України: Тези доп. Міжнародної наради. – Чернівці, 1995. – С. – 42.
7. Пазюк О.А., Нічик М.М. Вплив симбіозу і інбредної депресії на ріст люцерни // Тези доп. VI конфер. молодих вчених “Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики”. - Київ. – 1996. – С. 29-31.
8. Пазюк О.А. Изменчивость симбиотических признаков внутри вида Medicago sativa L. // Тези доп. VI конфер. молодих вчених “Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики”. - Київ. – 1996. – С. 88-89.
Пазюк О.А. Генетична мінливість симбіотичних ознак люцерни посівної. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. – Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2000.
Дисертацію присвячено вивченню генетичної мінливості кількості утворюваних бульбочок і азотфіксувальної активності, маси і висоти рослин Medicago sativa L. в симбіозі з Rhizobium meliloti. Досліджували різні за походженням лінії та одержані від них гібриди F1-F2. Встановлено кількісний і якісний рівень мінливості і варіабельності кількості бульбочок та їх азотфіксації, маси і висоти рослин, характер і закономірності розподілу рослин за цими ознаками, відносний внесок макро- і мікросимбіонта у формуванні активності симбіозу, коефіцієнти успадковуваності досліджених ознак, силу негативної дії інбридинга на активність симбіотичних ознак, ефект гетерозису у гібридів F1-F2 по відношенню до вихідних ліній I3-I8 за симбіотичними ознаками, характер і силу зв'язку між кількістю бульбочок і азотфіксацією, масою і висотою рослин люцерни. Виявлено найкращі комплементарні пари фіто- і ризобіопартнерів за дослідженими ознаками.
Ключові слова: Medicago sativa L., Rhizobium meliloti, лінії, гібриди, симбіоз, азотфіксація, бульбочкоутворення, маса рослин, висота рослин.
Пазюк О.А. Генетическая изменчивость симбиотических признаков люцерны посевной. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00.15 - генетика. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2000.
Диссертация посвящена изучению генетической изменчивости азотфиксирующей и клубенькообразующей активности, массы и высоты зеленых растений Medicago sativa L. в симбиозе с Rhizobium meliloti. Исследовали разные по происхождению линии и полученные от них гибриды F1-F2, количественный и качественный уровень изменчивости и вариабельности исследованных признаков. Определен количественный и качественный уровень изменчивости и вариабельности азотфиксирующей активности и клубенькообразования, массы и высоты зеленых растений, характер и закономерности распределения растений по этим признакам. Выявлен высокий уровень изменчивости и позитивная асимметрия распределения растений Medicago sativa L. по количеству образующихся клубеньков и азотфиксации, масе и высоте растений. Сильнее варьирует азотфиксация. Наибольшая изменчивость вызывается штаммом 425а. Выявлен относительный вклад макро- и микросимбионта в формировании активности симбиоза. При формировании симбиотических признаков наиболее сильным был фактор комплементарного взаимодействия растений и ризобий, вклад растений превышал влияние штамма Rhizobium meliloti. Наибольшее влияние на формирование симбиоза производят “плюс” линии по количеству клубеньков и азотфиксации. Неконтролируемые факторы формирования симбиоза могут превышать суммарный вклад симбионтов. Рассчитаны коэффициенты наследуемости исследованных признаков. Вклады отцовских и материнских форм в наследуемость изученных признаков достоверно не отличаются. На коэффициент наследуемости симбиотических признаков сильнее влиял генотип растений и фактор взаимодействия симбионтов. Наибольшие коэффициенты наследуемости признаков симбиоза принадлежат «плюс» линиям, инокулированным штаммами 425а и М4, по количеству клубеньков и нитрогеназной активности. Коэффициенты наследуемости количества клубеньков и азотфиксации превышают величины наследуемости массы и высоты растений. Модификационные факторы среды существенно влияют на показатели наследуемости. Определена сила отрицательного действия инбридинга на активность симбиотических признаков. Инбридинг уменьшает симбиотические показатели, особенно количества клубеньков и азотфиксации. Максимальная инбредная депрессия наблюдалась в выборках штамма 34. По отношению к исходным линиям I3-I8 установлен эффект гетерозиса у гибридов F1-F2 по симбиотическим признакам. У гибридов F1 наблюдается эффект гетерозиса по признакам симбиоза, особенно по количеству клубеньков и ацетиленредукции у растений, инокулированных штаммом 425а. Выявлен характер и сила связи между количеством клубеньков и азотфиксацией, а также массой и высотой растений люцерны. Между количеством клубеньков и нитрогеназной активностью, массой и высотой растений существует положительная связь. Корреляция между количеством клубеньков и азотфиксацией с одной стороны, и массой и высотой растений з другой стороны нижесредней силы, между количеством клубеньков и азотфиксацией средней силы, между массой и высотой растений вышесредней силы.
Выявлены наилучшие комплементарные пары фито- и ризобиопартнеров по изученным признакам.
Ключевые слова: Medicago sativa L., Rhizobium meliloti, линии, гибриды, симбиоз, азотфиксация, клубенькообразование, масса зеленых растений, высота растений.
Paziuk O.A. Genetic variability of symbiotic indications of alfalfa sowing: - Manuscript.
Thesis for Ph.D. (Biology) by speciality 03.00.15 – Genetics. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.
The thesis is dedicated to analysis of genetic variability of nitrogen fixation and nodulation activity, as well as of mass and height of plants Medicago sativa L. in symbiosis with Rhizobium meliloti. Lines, different in their origins, F1-F2 hybrids obtained from those lines, quantitative and qualitative level of changeability and variability of the investigated indications were studied. Quantitative and qualitative levels of changeability and variability of nitrogen fixing activity and nodulation, mass and height of plants were investigated too. The character and laws of plant distribution by these indications, relative contribution of macro- and microsymbionts in formation of symbiosis activity, inheritance coefficients of the investigated indications, power of negative inbreeding effect on the activity of symbiotical indications, heterosis effect of F1 hybrids according to I3-I8 original lines by symbiotic indications, the direction and power of correlation between nitrogen fixation and the amount of nodules, mass and height of alfalfa plants were also determined. The best complementary pairs of phyto- and rhizobiumpartners by the investigated indications have been revealed.
Key words: Medicago saliva L., Rhizobium meliloti, lines, hybrids, symbiosis, nitrogen fixation, nodulation, plant mass and height.
