Українська академія аграрних наук

Інститут біології тварин

АНТОНЯК

Галина Леонідівна

УДК 577.12:612.119:519.147

ОСОБЛИВОСТІ ГЕМОПОЕЗУ У тварин на ранніх стадіях

постнатального розвитку

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН,

Заслужений діяч науки і техніки України

Снітинський Володимир Васильович

Львівський державний аграрний університет, ректор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України (м.Львів),

завідувач відділу регуляції проліферації клітин

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця (м.Київ), професор кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії

доктор медичних наук, професор

Гонський Ярослав Іванович

Тернопільська державна медична академія ім.І.Я.Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри

медичної хімії і біології

Провідна установа: Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України,

відділ біохімії ліпідів, відділ хімії та біохімії ферментів

Захист відбудеться “24 “ вересня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою 79034, м. Львів, вул. В.Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Інституту біології тварин УААН (79034, м.Львів, вул. В.Стуса, 38).

Автореферат розісланий “23” серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ___________________ Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З'ясування вікових особливостей гемопоезу і механізмів регуляції процесів кровотворення за участю гормонів, цитокінів, факторів росту і мікроелементів є однією з важливих проблем сучасної біології. Погіршення екологічної ситуації, зокрема в деяких регіонах України, сприяло підвищенню ризику захворювань, пов'язаних з розладами функціональної активності кровотворної та імунної систем, особливо в ранньому віці (Касаткина Э.П. и др., 1997; Thomas G.A. et al., 1999; Santoro M. et al., 2000). Виникнення таких захворювань може зумовлюватись порушенням контролю за функціонуванням цих систем з боку ендокринних залоз, чутливих до дії екологічних, аліментарних та інших чинників (Misiewicz A. et al., 1993; Felig P. et al., 1995; Arthur J.R., Beckett G.J., 1999).

Ранній постнатальний період розвитку у ссавців характеризується змінами в функціональній активності наднирників, ?-клітин підшлункової залози, щитоподібної залози, що спричиняє дисбаланс у співвідношеннях між вмістом в організмі глюкокортикоїдів, інсуліну, йодотиронінів (Girard J. et al., 1994; Cнітинський B.B. та ін., 1994; Fowden A.L., 1995; Whittle W.L. et al., 2001). Відомо, що ці гормони регулюють анаболічні й катаболічні ланки обміну речовин, процеси проліферації, диференціації і апоптозу клітин, впливаючи на експресію специфічних генів. Однак роль інсуліну, тироксину, гідрокортизону в регуляції гемопоезу у ранньому постнатальному періоді розвитку тварин і людини з'ясована неповністю. Недостатньо вивчені й механізми регуляції гемопоезу мікроелементами – іонами заліза й селену, які в складі залізовмісних білків і селенопротеїнів регулюють важливі життєві процеси в організмі тварин і людини. Зокрема, селензалежні ферменти тироксин-5'-дейодинази каталізують процес перетворення молекул тироксину (Т4) до трийодтироніну (Т3), який опосередковує геномні ефекти гормону в клітинах-мішенях (Leonard J.L., 1990; Kohrle J., 2000; Bianco A.C. et al., 2002). Тироксин-5'-дейодинази функціонують також і в клітинах системи гемопоезу, однак вікові особливості процесу конверсії Т4 ®Т3, як і функціональні властивості цих ферментів у клітинах кісткового мозку і крові тварин, не досліджені.

Згідно із сучасними положеннями, гормональні механізми регуляції гемопоезу є однією з функціональних ланок цілісної системи регуляції обміну речовин в організмі тварин і людини. Вони не лише контролюють обмінні процеси в клітинах органів і тканин (в тому числі кровотворних), але й визначають рівень експресії в цих клітинах генів цитокінів, факторів росту (Blalock J.E., 1994; Imura H., Fukata J., 1994). Здатність до синтезу і секреції факторів росту і цитокінів (HGF, VEGF, IGF-I, TNF-?, IFN-? та інших) виявляють як поліпотентні клітини, так і попередники окремих ліній клітин кровотворення (Hino M. et al., 1996; Majka M. et al., 2001). Вказані молекули, у свою чергу, можуть брати участь у паракринних та аутокринних механізмах регуляції метаболізму в клітинах, визначаючи їх здатність до проліферації, диференціації, апоптозу, адгезії, міграції.

Одним із чинників, які визначають проліфераційну, адгезійну, міграційну, інвазійну активності клітин, є процес активації плазміногену на клітинній поверхні (Blasi F., 1993; Chapman H.A., 1997). Система активації плазміногену є функціональною ланкою фібринолізу, а такі компоненти цієї системи як урокіназа (uPA) та рецептор урокінази (uPAR) є біологічно активними речовинами, що беруть участь у фізіологічних і багатьох патологічних процесах (Collen D., Lijnen H., 1995; Degryse B. et al., 2001). Тому становить інтерес з'ясування ролі регуляторних чинників (фактор росту гепатоцитів HGF, фактор некрозу пухлин TNF-?, інтерферон-? IFN-?) у процесах активації плазміногену в кровотворних клітинах.

Як відомо, зміни в системі кровотворення, що відбуваються у ссавців під час перинатального розвитку, та перебудова регуляторних механізмів гемопоезу при переході до постнатального періоду життя визначають функціональну активність клітин крові та імунної системи не лише відразу після народження, але і в дальші вікові періоди онтогенезу. Тому становить інтерес дослідження процесів гемопоезу в організмі поросят, оскільки у цих тварин у ранньому постнатальному періоді спостерігається порушення регуляторних механізмів кровотворення з розвитком анемії та стану імунодефіциту (Карелин А.И., 1975; Pekkanen T. et al., 1987; Hill G. et al., 1999). Виникненню патологічних станів у системі гемопоезу сприяє оксидаційний стрес, який розвивається в організмі новонароджених тварин при переході до легеневого типу дихання та зниження рівня глікемії, що зумовлює зменшення енергетичного забезпечення клітин кровотворної тканини і крові (Cнітинський B.B., 1989; Sies H., 1997; Robles R. et al., 2001). Дослідження такого плану дають можливість виявити критерії для ранньої діагностики і прогнозу анемій, лейкозів, бактеріальних і вірусних інфекцій та їх профілактики у тварин і людини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна праця є частиною науково-дослідної роботи лабораторії ендокринної регуляції Інституту біології тварин УААН (бюджетні теми “Дослідити субстратно-гормональні механізми високої продуктивності свиноматок і інтенсивного росту поросят”, № держреєстрації А 01002232; “Вивчити молекулярні механізми формування системи регуляції метаболізму, гемопоезу та імунної функції у свиней і вeликої рогатої худоби на ранніх етапах постнатального розвитку”, № держреєстрації 0198U009008).

Мета і завдання дослідження. Вивчити особливості гемопоезу та механізми регуляції метаболізму в клітинах кровотворних тканин і крові поросят у ранньому постнатальному періоді. Розробити шляхи профілактики патологічних порушень у процесах гемопоезу та корекції гормонального, метаболічного і антиоксидантного статусу тварин у цей період онтогенезу.

Для вирішення даної проблеми були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити вікові зміни у процесах еритро- і лейкопоезу в організмі поросят у періоді від народження до 45 днів та вплив гормонів (інсулін, тироксин, гідрокортизон) і мікроелементів – іонів заліза (у складі препарату “Декстрофер-100”) і селену (у складі селеніту натрію) на популяційний склад клітин кісткового мозку і крові тварин.

2. З'ясувати функціональні зміни кисень-транспортної функції крові поросят у ранньому постнатальному періоді.

3. Дослідити інтенсивність синтезу білків і ДНК, окремих ланок енергетичного обміну, перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантних процесів у клітинах кровотворної тканини кісткового мозку, органів лімфопоезу і крові поросят під час раннього постнатального періоду та з'ясувати вплив гормонів (інсулін, тироксин, гідрокортизон) на метаболічні процеси у цих клітинах.

4. Дослідити процеси протеолізу в клітинах системи гемопоезу поросят у ранньому постнатальному періоді та вплив гормонів (інсулін, тироксин, гідрокортизон) на активність протеїназ. Вивчити функціональні властивості АТР-залежної протеїнази (КФ 3.4.99.46) еритроїдних клітин поросят.

5. Дослідити вплив препарату “Декстрофер-100” і селеніту натрію на гормональний статус та метаболізм у клітинах кісткового мозку і крові поросят раннього віку.

6. З'ясувати вікові особливості процесу конверсії тироксин ® трийодтиронін і функціональні властивості тироксин-5'-дейодиназ (КФ 3.8.1.4) у клітинах кісткового мозку і крові тварин.

7. Дослідити інтенсивність експресії компонентів системи активації плазміногену у клітинах ліній К-562, U-937 і ТНР-1 та вплив на цей процес регуляторів росту клітин HGF, TNF-?, IFN-? та форболміристатацетату (РМА).

Об'єкт дослідження: метаболічний і функціональний стан кровотворної тканини кісткового мозку та клітин органів лімфопоезу і крові в організмі поросят під час раннього постнатального періоду.

Предмет дослідження: механізми регуляції за участю гормонів (інсулін, тироксин, гідрокортизон) і мікроелементів (іони заліза і селену) еритропоезу, мієлопоезу, лімфопоезу та функціональної активності клітин крові в організмі поросят раннього віку, регуляція експресії компонентів активації плазміногену в лініях клітин системи гемопоезу за участю цитокінів (HGF, TNF-?, IFN-?).

Методи дослідження: біохімічні, морфологічні, радіологічні, імунологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено адаптаційні зміни в системі гемопоезу поросят у ранньому періоді постнатального розвитку. Досліджено динаміку популяційного складу кровотворної тканини кісткового мозку і крові поросят на ранніх стадіях постнатального розвитку. Досліджено метаболічний і антиоксидантний стан клітин системи гемопоезу у поросят раннього віку. З'ясовано вплив інсуліну, тироксину і гідрокортизону на функціональну активність кровотворних тканин і метаболізм (синтез білків і ДНК, протеоліз, енергетичний обмін, перекисне окислення ліпідів і антиоксидантні процеси) у клітинах системи гемопоезу поросят у ранньому постнатальному періоді. Вивчено функціональні властивості АТР-залежної протеїнази еритроїдних клітин поросят. Досліджено рецепцію інсуліну в клітинах системи гемопоезу поросят у ранньому постнатальному періоді та з'ясовано кінетичні характеристики рецепторів гормону в еритроцитах поросят. Встановлено вплив мікроелементів (іони заліза і селену) на популяційний склад клітин кісткового мозку, окремі ланки енергетичного обміну та антиоксидантний стан клітин системи гемопоезу в організмі поросят у ранньому періоді після народження. З'ясовано вплив іонів заліза й селену на гормональний статус поросят раннього віку. Досліджено вікові особливості процесу конверсії Т4 ®Т3 і вивчено функціональні властивості тироксин-5'-дейодиназ у клітинах кісткового мозку і крові тварин, вивчено регуляцію активності цих ферментів за участю гормонів (тироксин, гідрокортизон), іонів заліза і селену. Встановлено функціональний зв'язок між рівнем забезпечення організму тварин мікроелементами, активністю процесів дейодування тироксину до трийодтироніну, інтенсивністю основного метаболізму та функціональним станом антиоксидантної системи у клітинах системи гемопоезу. З'ясовано вплив регуляторів росту клітин (HGF, TNF-?, IFN-? і форболміристатацетат) на експресію компонентів системи активації плазміногену (урокіназа, рецептор урокінази, інгібітор активаторів плазміногену) у клітинах ліній К562, U937, THP-1.

Практичне значення. Отримані результати можуть бути застосовані у ветеринарній практиці для профілактики, ранньої діагностики і прогнозу анемій, лейкозів, бактеріальних і вірусних інфекцій у тварин та для розробки імуно- і гемомодуляторів, для прогнозування можливих наслідків порушень функціональної активності ендокринних залоз і розробки ефективних засобів їх корекції. На підставі результатів досліджень розроблено методи профілактики анемії та оксидаційного стресу у поросят раннього віку і корекції гормонального й метаболічного статусу новонароджених тварин.

Отримані результати мають значення для з'ясування біохімічних механізмів регуляції гемопоезу у тварин під час періоду постнатальної адаптації, ролi гормонів, цитокінів і мікроелементів у механізмах регуляції процесів гемопоезу і лімфопоезу та функціональної активності клітин кровотворної системи, молекулярних механізмів дії вказаних біорегуляторів у клітинах кровотворної тканини і крові. Результати цих досліджень використовуються у курсі лекцій з біохімії і загальної екології у Львівському державному аграрному університеті.

Особистий внесок дисертанта. Дисертант є автором ідей, покладених в основу дисертаційної праці. Нею особисто опрацьовано робочі схеми та практичне застосування всіх описаних у роботі методик. Дисертант провела експериментальні дослідження функціонального, метаболічного і антиоксидантного станів кровотворної тканини кісткового мозку, клітин крові й органів лімфопоезу поросят та змін цих станів під впливом гормонів і мікроелементів, дослідила функціональні властивості тироксин-5'-дейодиназ та їх регуляцію у клітинах тварин, експресію компонентів системи активації плазміногену в клітинах ліній К562, U937, THP-1 та її регуляції цитокінами, провела аналіз та інтерпретацію результатів, сформулювала основні висновки роботи, підготувала до друку публікації за матеріалами дисертації. Окремі експериментальні роботи виконувались за участю співавторів публікацій, які були виконавцями спільних тем.

Апробація резульатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на VІІ Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997 р.), XIV з'їзді Міжнародного товариства гематологів (Стокгольм, 1997 р.), Першому FEPS конгресі (Маастріхт, 1995), ХІІІ Міжнародному конгресі з фібринолізу і тромболізу (Барселона, 1996 р.), XV Конгресі Міжнародного товариства по вивченню тромбозу і гемостазу (Єрусалим, 1995 р.), ХХХІІІ Міжнародному конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, 1997 р.), Українсько-Австрійському симпозіумі “Сільське господарство: наука і практика” (Чернівці, 2000 р.), Міжнародних симпозіумах “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996 р., 1998 р., 2000 р.), 1-ій, 2-ій і 3-ій конференціях ім.Я.Парнаса (Львів, 1996 р., 2000 р.; Гданськ, 1998 р.), розширеному засіданні кафедри агроекології і біології Львівського державного аграрного університету (2001р.).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 55 публікаціях. З них книг – 1 (у співавторстві), наукових статей, які опубліковані у наукових фахових виданнях, – 37 (11 одноосібних), методичних розробок – 3, тез доповідей, опублікованих у наукових журналах і матеріалах конференцій, – 14.

Структура і об'єм роботи. Дисертація складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Аналіз і узагальнення результатів досліджень”, “Висновки”, “Практичні рекомендації” та містить список використаних літературних джерел із 1280 найменувань. Основна частина роботи викладена на 287 сторінках, містить 73 таблиці і 22 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Експериментальна частина роботи виконана на 220 поросятах віком від народження до 45 днів, отриманих від свиноматок великої білої породи, новонароджених і 5-місячних кролях, 1-денних курчатах, клітинах кровотворних ліній К562, U937 і THP-1. Ефекти гормонів вивчали при різних дозах і тривалості дії. Моделі станів підвищеного вмісту в організмі інсуліну створювали шляхом введення поросятам гормону в дозах: 0,5 МО/кг маси починаючи з 48 год після народження двократно через кожні 12 год; 2,0 МО/кг маси через кожні 12 год, починаючи з 7-го по 10-й день, моделі гіпертиреоїдного і гіпотиреоїдного станів створювали, відповідно, шляхом введення внутрішньоочеревинно тироксину в дозі 4 мг/кг маси і 6-n-пропіл-2-тіоурацилу в дозі 1 мг/кг через кожні 12 год починаючи з 48 год після народження по 10-й день. Стан підвищеного вмісту гормону кори наднирників в організмі поросят створювали шляхом введення гідрокортизону в дозі 10 мг/кг маси через кожні 12 год з 7-го по 10-ий день після народження. Вплив іонів заліза і селену на гемопоез вивчали шляхом введення поросятам препарату “Декстрофер-100” (який містить Fe3+ у сполуці з декстраном) у дозі 2 мл через 48 год після народження і селеніту натрію (Na2SeO3) у дозі 0,075 мг селену/кг маси через 1 год і через 24 год після народження. Клітини ліній K562, U937 і THP-1 культивували згідно з методами клітинних культур за присутності HGF (100 нг/мл), TNF-? (500 U/мл) та IFN-? (500 U/мл) та форболміристатацетату (РМА 100 нМ) впродовж 24 год (Doyle A. et al., 1996).

З кровотворної тканини кісткового мозку і крові тварин виділяли популяції еритроїдних і мієлоїдних клітин, нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів шляхом диференціального центрифугування суспензій клітин у градієнтах густини фікол-верографіну, фікол-гіпаку або перколу (Boyum A.A., 1968; Harrison F.L. et al., 1981; Freshney R.I., 1987; Сибирная Н.A. и др., 1991). Еритроцити виділяли шляхом пропускання крові через колонку, заповнену сумішшю a-целюлози і мікрокристалічної целюлози у співвідношенні 1:1 (Beutler E. et al., 1976). Цитологічний аналіз клітин проводили згідно з загальноприйнятими методиками (Кудрявцев А.А. и др. 1969; Неменова Ю.М., 1976). У клітинах кісткового мозку, тимусу, селезінки, лімфатичних вузлів, лімфоцитах крові вивчали процеси синтезу ДНК і білків за інтенсивністю інкорпорації в молекули вказаних біополімерів позначених радіоактивними мітками тимідину та суміші амінокислот (Ling N.R., Kay J.E., 1975; Mishell B.B., Shiigi S.M., 1980). У клітинах кісткового мозку і крові вивчали процес специфічного зв'язування інсуліну (Gambhir K.K. et al., 1978; Nakao K. et al., 1986). У лізатах клітин досліджували активність ферментів енергетичного обміну гексокінази (Bergmeyer H.U., Bernt E., 1974), 6-фосфофруктокінази (Sugden P.H., Newsholme E.A., 1975), піруваткінази (Bergmeyer H.U., Bernt E., 1974), лактатдегідрогенази (Chapman R.G. et al. 1962), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Deutsch J., 1983), ізоцитратдегідрогенази (Goldberg D.M., Ellis G., 1983), малатдегідрогенази (Ochoa S., 1955), цитохром с-оксидази (Wharton D., Tzagoloff А., 1967), відносну активність ізоферментів гексокінази і лактатдегідрогенази (Davis B.I.G., 1964; Eaton G.M., Brever G.J., 1966; Корочкин Л.И. и др., 1977), активність нейтральних, кислих і лужних протеїназ (Асатиани В.С. 1966; Балаян В.М., Левицкий А.П., 1982; Wang K.K.W. et al., 1988), активність ферментів антиоксидантної системи супероксиддисмутази (Дубинина Е.Е. и др., 1983), глутатіонпероксидази (Моин В.М., 1986) і глутатіонредуктази (Pinto R.E., Bartley W., 1969), вміст глюкози (Bergmeyer H.U., Bernt E., 1974), молочної і піровиноградної кислот (Lowry O.H., Passoneau J.V., 1972; Czok R., Lemprecht W., 1974), глутатіону (Thomas D.S., et al. 1960), гідроперекисів ліпідів (Орехович В.Н., 1977), малонового діальдегіду (Коробейникова Е.Н., 1989). В еритроїдних клітинах досліджували активність бісфосфогліцеромутази (Oesper Р., 1955), вміст 2,3-дифосфогліцерату (2,3-DPG) (Dyce B.J., Bessman S., 1973), кoнцентрацію та фракційний склад гемоглобіну (Кушаковский М.С., 1968; Davis B.I.G., 1964), спорідненість гемоглобіну до кисню (Иванов Ю.Г., 1975). Функціональні властивості АТР-залежної протеїнази в еритроїдних клітинах вивчали після очищення ферменту шляхом гельфільтрації, іонообмінної хроматографії і хроматографії на гідроксилапатиті (Ishiura S. et al., 1985; Hough R. et al., 1987). Активність та кінетичні характеристики тироксин-5'-дейодиназ типу І (Д1) і типу ІІ (Д2) визначали в гомогенатах клітин кісткового мозку, еритроцитів, лейкоцитів, а також клітин печінки, нирок, серцевого і скелетного м'язів, легенів, селезінки, сім'яників, слизової оболонки тонких кишок радіологічним методом з використанням радіоактивно позначеного реверсивного трийодтироніну (Leonard J.L., Rosenberg I.N., 1980; Jack L.J.W. et al., 1994). У сироватці крові досліджували концентрацію феритину, у плазмі – концентрації гормонів тироксину, трийодтироніну, інсуліну, гідрокортизону радіологічним методом з використанням наборів фірми "ХОПИБОХ-МЕНСК". Дослідження рівня поверхневої і внутрішньоклітинної експресії компонентів системи активації плазміногену у клітинах ліній К562, U937, THP-1 проводили методом імунофлуоресцентного аналізу за допомогою моноклональних антитіл миші проти молекул uPAR, uPA, tPA і PAI-1 людини. Як вторинне антитіло використовували кон'югований з R-фікоеритрином IgG проти антитіл миші (Knapp W. et al., 1994).

Результати досліджень

Особливості процесів еритропоезу і лейкопоезу в організмі поросят у ранньому постнатальному періоді

Динаміка популяцій клітин у крові і кістковому мозку, кисень-транспортна функція гемоглобіну поросят у постнатальному періоді. Результати досліджень популяційного складу клітин кровотворної тканини кісткового мозку поросят віком від народження до 30 днів та крові поросят віком від народження до 45 днів свідчать про те, що, залежно від віку тварин, існують значні відмінності в інтенсивності процесів еритропоезу, гранулоцитопоезу, лімфопоезу і моноцитопоезу в їхньому організмі.

У кістковому мозку новонароджених і 1-денних поросят показник співвідношення між вмістом еритроїдних і мієлоїдних клітин є більшим, ніж у тварин старшого віку. Вміст еритробластів, що проліферують, і еритроїдних клітин, які дозрівають, у кровотворній тканині 5-, 10-, 30-денних поросят менший, ніж у новонароджених тварин (p<0,05-0,001). На 5-й і 10-й дні після народження зменшується концентрація гемоглобіну в еритроїдних клітинах кісткового мозку, а в періоді з 7- до 30-денного віку – в крові поросят (р<0,05-0,01). У 10-денних поросят зменшується інтенсивність включення 59Fe до складу молекул залізопротеїнів в еритроїдних клітинах кісткового мозку (р<0,01), а починаючи з 3-денного віку до 30-го дня після народження збільшується концентрація феритину в сироватці крові тварин (р<0,05-0,01). Такі результати свідчать про зменшення інтенсивності використання іонів заліза у процесах еритропоезу. Разом з тим, починаючи з 3-денного віку поросят показник Р50 гемоглобіну збільшується порівняно з таким у новонароджених поросят (р<0,05). Це свідчить про зниження спорідненості гемопротеїну до кисню, що є однією з компенсаторних реакцій організму, скерованих на забезпечення зростаючого кисневого запиту тканин у періоді інтенсивного росту (Meberg A. et al., 1980; Oski F.A., Naiman J.L., 1982).

Отримані результати дають підставу вважати, що в механізмах пригнічення синтезу гемоглобіну та розвитку постнатальної анемії в організмі поросят раннього віку важливу роль відіграє не лише зменшення вмісту заліза в організмі тварин після народження (у зв'язку з недостатньою функціональною активністю печінки як залізодепонуючого органу в пренатальному періоді та низьким вмістом іонів заліза в молоці свині) (Stankiewicz W., 1973; Карелин А.И., 1975), але й зниження проліферативної активності еритроїдних клітин та інтенсивності використання іонів заліза в біосинтетичних процесах, що може зумовлюватись порушеннями у регуляторних механізмах. Певною мірою такий ефект може зумовлюватись зменшенням функціональної ролі еритропоетину в регуляції еритропоезу у ранньому періоді після народження через зниження вмісту цього біорегулятора в організмі тварин (Kling P.J. et al., 1996; Doyle J.J., 1997), а також активацією надходження до крові інгібіторів еритропоезу, зокрема IL-1, синтез якого стимулюють чинники, що містяться в молозиві (Krzymowski T., 1971; Bessler H. et al., 1996).

Пригнічення еритропоезу в кістковому мозку поросят у постнатальному періоді відбувається одночасно з активацією в їх організмі процесів гранулоцитопоезу, лімфопоезу і моноцитопоезу. Так, співвідношення між вмістом клітин мієлоїдної і еритроїдної ліній у кровотворній тканині більш ніж удвічі зростає в періоді від народження до 30-денного віку, що зумовлюється збільшенням вмісту в кістковому мозку 10- і 30-денних поросят як мієлоїдних клітин, що проліферують, так і зрілих – сегментоядерних нейтрофілів (р<0,05-0,001). Це супроводжується збільшенням кількісного вмісту лейкоцитів, що перебувають у кровообігу 10- і 30-денних тварин (р<0,05-0,001) та зменшенням показника співвідношення між вмістом нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів у крові 10- і 30-денних поросят (у 3,6 і 5,8 раза відповідно) порівняно зі значеннями, притаманними новонародженим тваринам. У періоді від 5- до 10-денного віку в крові поросят удвічі зростає вміст базофільних і еозинофільних гранулоцитів, а у крові 30-денних поросят вміст цих клітин зростає, відповідно, у 2,3 і 3,4 раза (р<0,01-0,001). На інтенсифікацію лімфопоезу і моноцитопоезу в організмі поросят від народження до 30-денного віку вказує збільшення вмісту лімфоцитів у кістковому мозку 3-денних поросят, лімфоцитів та моноцитів – у крові 10- і 30-денних тварин (p<0,05-0,001).

Синтез ДНК і білків, енергетичні та антиоксидантні процеси у клітинах кровотворної та імунної систем поросят у ранньому постнатальному періоді. Процес постнатальної адаптації системи гемопоезу в організмі свині значною мірою реалізується на рівні метаболізму в клітинах кровотворної тканини і крові – у віковій динаміці синтезу клітинних біополімерів, протеолізу, енергетичних, антиоксидантних процесів. Важливою ланкою механізмів, які зумовлюють функціональні зміни у процесах кровотворення в організмі тварин, є синтез білків і нуклеїнових кислот. У періоді від 1- до 10-денного віку поросят зростає інтенсивність включення 14С-амінокислот до складу білків еритроїдних і мієлоїдних клітин кісткового мозку, клітин тимусу та лімфатичних вузлів, 3Н-тимідину – в молекули ДНК мієлоїдних клітин, тимоцитів, клітин селезінки (р<0,05-0,01).

Результати досліджень дають підставу вважати, що стратегія постнатальних адаптаційних змін у клітинах системи гемопоезу полягає, з одного боку, в активації процесів надходження кисню до клітин кровотворної тканини, а з другого – у формуванні метаболічної відповіді клітин, тобто активації окисних стадій енергетичного метаболізму. Встановлено, що інтенсивність використання глюкози як субстрату енергетичного метаболізму в еритроїдних клітинах кісткового мозку і еритроцитах новонароджених поросят перевищує таку в клітинах 30-денних тварин (p<0,001). Однак показник співвідношення між концентраціями лактату і пірувату в еритроїдних клітинах кісткового мозку 10- і 30-денних тварин зменшується в 2,4-2,5 раза порівняно з таким у новонароджених поросят водночас із пригніченням активності ферментів, що каталізують кінцеві реакції гліколізу, та активацією ферментів, які каталізують окисні стадії катаболізму субстратів. Напрямок змін у процесах енергетичного метаболізму в мієлоїдних клітинах кісткового мозку та лейкоцитах поросят у періоді від народження до 30-денного віку є, переважно, таким самим, як в еритроїдних клітинах. Вірогідно, активація окисних процесів у клітинах кровотворної системи віддзеркалює загальну тенденцію у динаміці обмінних процесів в організмі тварин після народження, оскільки таким чином реалізується процес адаптації метаболізму до збільшення оксигенації клітин внаслідок переходу організму до легеневого типу дихання (Stave U., 1978; Снітинський В.В., 1989).

Активація окисних процесів у клітинах, в тому числі й кровотворних, супроводжується інтенсифікацією утворення активних метаболітів кисню, що володіють значною реакційною здатністю та можуть викликати порушення структури і функціональної активності клітинних біополімерів (ліпідів, білків, нуклеїнових кислот), зумовлюючи розвиток оксидаційного стресу (Loft S. et al., 1994; Saugstad O.D., 1996; Sies H., 1997; Robles R. et al., 2001). Тому важливою ланкою адаптаційних механізмів у ранньому постнатальному періоді є активація внутрішньоклітинних захисних систем, у першу чергу антиоксидантної системи, компоненти якої попереджують утворення або сприяють зменшенню вмісту в клітинах реакційноздатних метаболітів кисню (Fridovich I., 1995; Arthur J.R., 2000; Erden-Inal M. et al., 2002). Результати досліджень свідчать про те, що вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) – гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду – зростає в періоді від народження до 1-3-денного віку поросят у клітинах кісткового мозку, еритроцитах, нейтрофільних гранулоцитах, клітинах лімфатичних вузлів (p<0,05-0,01). У періоді від 1-до 5-денного віку зростає й активність ферментів-антиоксидантів (супероксиддисмутаза, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза) у клітинах системи гемопоезу тварин. Проте рівень становлення захисних систем, вірогідно, залежить від метаболічного стану клітин, вмісту в них гемопротеїнів та інших систем-генераторів активних форм кисню. Очевидно, у зв'язку з активацією системи антиоксидантного захисту вміст продуктів ПОЛ у клітинах системи гемопоезу 5- і 10-денних поросят знижується порівняно з рівнем, який виявляється у клітинах 3-денних тварин (p<0,05-0,001).

Функціональна роль процесів протеолізу в клітинах системи гемопоезу поросят раннього віку. Ранній період постнатального розвитку тварин супроводжується змінами функціональної активності системи протеолізу. Однак активність протеїназ, які діють у нейтральній, кислій і лужній зонах рН (рН 7,4; 3,0 і 8,5 відповідно), у клітинах системи гемопоезу поросят по-різному змінюється в процесі постнатальної адаптації. Зокрема, активність нейтральних протеїназ еритроїдних і мієлоїдних клітин кісткового мозку, нейтрофільних гранулоцитів, лімфоцитів зростає протягом 1-ї доби після народження та в дальшому розвитку тварин (p<0,05). З метою з'ясування ролі окремих протеїназ у процесах гемопоезу проведено часткове очищення ферментів із лізатів клітин кровотворної системи поросят. Оскільки важливу роль у регуляторних процесах відіграють високомолекулярні протеїнази, основна увага приділялась виявленню протеїназ із близькою 100 kDа або більшою молекулярною масою. Після гельфільтрації солюбілізованих білків лізатів еритроїдних клітин у нейтральній області рН виявляються основні зони протеолітичної активності, які відповідають білкам ~1000 kDa, 600 kDa, ~126 kDa, ~80 kDa. Широкий спектр білкових фракцій з протеолітичною активністю в нейтральній ділянці рН, що відповідають ферментам з молекулярною масою від 950 до 126 kDa і 110 kDа, властивий клітинам мієлоїдного ряду і лімфоцитам. Аналіз результатів дає підстави вважати, що у клітинах кісткового мозку і крові поросят функціонує декілька протеїназ, які виявляють активність при нейтральних значеннях рН. До них, очевидно, належить високомолекулярний комплекс з молекулярною масою ~1000 kDa. Відомо, що до складу цього комплексу входить 600-700 kDa-протеїназа, яка може функціонувати й самостійно, виявляючи протеолітичну активність у нейтральній і лужній зонах рН (Coux O. et al., 1996; Hershko А., Ciechanover А., 1998; Orlowski M., Wilk S., 2000). Властивості цієї протеїнази досліджувались після очищення шляхом фракціонування гемолізатів сульфатом амонію, іонообмінної хроматографії на DEAE-Toyopearl 650 M (рН 7,5), гельфільтрації на Toyopearl-HW 65 та хроматографії на гідроксилапатиті. За результатами гельфільтрації молекулярна маса очищеного ферменту становить 700±50 kDa, а оптимальний рівень рН для протеолітичної активності – 8,5. Аналіз впливу на активність протеїнази катіонів, протекторів сульфгідрильних груп та інгібіторний аналіз дає підставу стверджувати про належність ферменту до мультикаталітичних АТР-залежних протеїназ. Встановлено, що активність АТР-залежної протеїнази досягає високого рівня в еритроїдних клітинах новонароджених тварин, проте до 10-денного віку знижується в еритробластах кісткового мозку і еритроцитах, відповідно, в 1,7 і 3,1 раза (p<0,01-0,001). У дальшому розвитку тварин активність ферменту зростає, досягаючи істотних змін у клітинах 30-денних поросят (p<0,01-0,001). При дослідженні активності протеїнази у фракціях еритроїдних клітин кісткового мозку найбільшу активність ферменту виявлено в клітинах, які проліферують. При дозріванні цих клітин до еритроцитів рівень активності протеїнази знижується у 5,8-8,6 раза. Такі дані можуть вказувати на роль ферменту у процесах проліферації клітин системи гемопоезу.

Вплив гормонів на процеси гемопоезу в організмі поросят у ранньому постнатальному періоді

Вплив гормонів на динаміку популяцій клітин у кістковому мозку і крові поросят у ранньому постнатальному періоді. До важливих регуляторів процесів проліферації і диференціації клітин, у тому числі кровотворних, належать гормони – інсулін, тироксин, гідрокортизон (Cheatham В., Kahn C.R., 1995; Bauer A. et al., 1998; von Lindern M. et al., 1999). Встановлено, що вказані біорегулятори впливають на функціонування системи гемопоезу у поросят раннього віку. При цьому інсулін, тироксин і гідрокортизон стимулюють процес еритропоезу в кістковому мозку тварин. Однак дія інсуліну виявляється у збільшенні вмісту клітин, які проліферують, тоді як тироксин і гідрокортизон зумовлюють збільшення вмісту еритробластів, які проліферують і тих, що дозрівають. Інсулін, як відомо, є необхідним фактором росту багатьох клітин та впливає на процеси проліферації попередників еритроїдного ряду BFU-E і CFU-E (Konwalinka G. et al., 1988). Отримані результати і дані літератури вказують на те, що цей гормон бере участь у регуляції еритропоезу також і на стадіях термінальної диференціації еритроїдних клітин, виявляючи ефекти, подібні до ефектів еритропоетину (Panzenbock B. et al., 1998). Вірогідно, стимулюючий вплив гормону на проліферативну активність попередників еритроцитів у ранньому постнатальному періоді розвитку може відігравати певну роль у підтриманні відповідного рівня еритропоезу під час інтенсивного росту тварин (Sanengen T. et al., 1987; Widness J. et al., 1989).

Необхідно відзначити, що, стимулюючи процеси проліферації еритроїдних клітин у поросят 3- і 10-денного віку, інсулін зумовлює збільшення вмісту проліферуючих мієлоїдних клітин – промієлоцитів – у кістковому мозку 3-денних поросят (p<0,05), проте не виявляє істотного впливу на інтенсивність гранулоцитопоезу у 10-денних тварин. Одночасно тироксин, стимулюючи еритропоез як у 3-денних поросят (сумарна доза введеного тваринам гормону 8 мг/кг), так і в тварин 10-денного віку (сумарна доза 64 мг/кг), не впливає на вміст мієлоїдних клітин, які проліферують, у кістковому мозку 3-денних тварин та пригнічує процес гранулоцитопоезу у 10-денних поросят. Гідрокортизон стимулює процеси проліферації і дозрівання еритроїдних клітин, однак пригнічує функціональну активність мієлобластів – мієлоїдних клітин, які проліферують (p<0,05). Водночас гідрокортизон зумовлює зменшення вмісту лімфоцитів у крові 10-денних тварин (p<0,05). Отримані результати узгоджуються з даними літератури щодо інгібуючого впливу глюкокортикоїдів на імунну функцію організму тварин і людини (Goldstein R.A. et al., 1992; McEwen B.S. et al., 1997; Sapolsky R.M. et al., 2000).

Зв'язування інсуліну клітинами системи гемопоезу поросят у постнатальному періоді. Вплив гормонів на процеси гемопоезу опосередковується зв'язуванням їхніх молекул зі специфічними рецепторами, що містяться у плазматичних мембранах і внутрішньоклітинних структурах еритроїдних, мієлоїдних і лімфоїдних клітин (Gambhir K.K., Agarwal V.R., 1991; Wessely О. et al. 1997; Bauer A. et al., 1998, 1999). Встановлено, що еритроїдні клітини кісткового мозку новонароджених поросят характеризуються значно більшою, ніж мієлоїдні клітини, інтенсивністю специфічного зв'язування інсуліну. Однак рівень рецепції інсуліну рецепторами еритроїдних клітин кісткового мозку, лімфоцитів, еритроцитів поросят знижується у постнатальному періоді (р<0,05-0,01). При аналізі інсулін-рецепторної взаємодії в еритроцитах, інсулін-зв'язуючі характеристики яких віддзеркалюють гормон-рецепторні властивості інших клітин організму, встановлено, що після народження поросят у цих клітинах зменшується концентрація рецепторів з високою спорідненістю до інсуліну (p<0,05-0,01), але константи утворення ліганд-рецепторних комплексів у ранньому постнатальному періоді істотно не змінюються. В еритроцитах 30-денних поросят разом із зменшенням концентрації цих рецепторів спостерігається також і зменшення характерної для них константи зв'язування. Зниження інтенсивності специфічного зв'язування 125І-інсуліну клітинами крові виявляється на тлі значного збільшення концентрації гормону в плазмі поросят. Це може свідчити про участь інсуліну в регуляції концентрації власних рецепторів у мембранах клітин.

Вплив гормонів на процеси синтезу ДНК і білків у кістковому мозку і крові поросят раннього віку. Відомо, що в основі багатьох ефектів гормонів лежить вплив на функціональну активність специфічних генів, який реалізується у змінах інтенсивності синтезу білків, що каталізують процеси внутрішньоклітинного метаболізму (Felig Р. et al., 1995; Pierreux C.E. et al., 1998). Згідно з результатами досліджень, гідрокортизон пригнічує процеси синтезу білків у нефракціонованих клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і селезінки поросят 10-денного віку та знижує інтенсивність включення радіоактивної позначки в молекули ДНК тимоцитів і клітин селезінки поросят (p<0,01). При вивченні метаболічних ефектів інсуліну встановлено, що в більшості клітин системи гемопоезу, які досліджували, гормон виявляє стимулюючий вплив на процеси синтезу біополімерів. Так, після введення тваринам інсуліну інтенсивність включення 14С-амінокислот у молекули білків зростає у клітинах кісткового мозку (нефракціонованих і еритроїдних), селезінки 3-денних поросят (p<0,05),3Н-тимідину – в нефракціонованих клітинах кісткового мозку 3- і 10-денних поросят (p<0,05-0,01). За наявності інсуліну в середовищі інтенсифікація включення позначених радіоактивними мітками попередників виявляється у клітинах кісткового мозку (нефракціонованих, еритроїдних, мієлоїдних), селезінки, тимусу (p<0,05-0,01). При цьому встановлено, що інсулін стимулює включення 3Н-тимідину в молекули ДНК еритроїдних клітин, які проліферують, а 14С-амінокислот – у молекули білків як клітин, що проліферують, так і еритробластів, які дозрівають (p<0,05-0,01). У мієлоїдних клітинах кісткового мозку інсулін стимулює синтез ДНК у 1-денних поросят (p<0,01), білків – у 1- і 10-денних тварин (p<0,05). Водночас інсулін стимулює синтез біополімерів у клітинах тимусу 10-денних поросят (p<0,05). Отже, вплив інсуліну на метаболізм у клітинах системи гемопоезу подібний до механізмів дії гормону в інших клітинах, у яких під час раннього періоду після народження інсулін стимулює процеси проліферації і росту (Wray-Cahen D. et al., 1998; Boirie Y. et al., 2001).

Істотні зміни в інтенсивності синтезу біополімерів у клітинах системи гемопоезу виявляються під впливом тироксину. У 3-денних тварин тироксин стимулює синтез білків у нефракціонованих і еритроїдних клітинах кісткового мозку, клітинах селезінки і тимусу (p<0,05-0,01), синтез ДНК – у нефракціонованих і еритроїдних клітинах кісткового мозку, клітинах селезінки (p<0,01). Після інкубації клітин за присутності 6-п-пропіл-2-тіоурацилу – препарату, який виявляє інгібуючий вплив на процес 5'-дейодування тироксину, – інтенсивність синтезу білків у клітинах системи гемопоезу зменшується (p<0,05-0,01). Це вказує на роль процесу дейодування молекул тироксину у метаболічних ефектах гормону.

Вплив гормонів на окремі ланки енергетичного метаболізму, процеси протеолізу і стан антиоксидантної системи в клітинах органів гемо- і лімфопоезу та крові поросят. У механізмах впливу гормонів на функціональну активність клітин важливе значення мають їх регуляторні ефекти щодо внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму. Встановлено, що тироксин активує енергетичні процеси як в еритроїдних, так і в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і крові поросят. Зокрема, після введення тваринам тироксину активність малатдегідрогенази та ізоцитратдегідрогенази в еритроїдних клітинах збільшується, відповідно, в 1,5 і 1,9 раза, а цитохром с-оксидази – в 2,5-1,4 раза, активність піруваткінази і лактатдегідрогенази зростає, відповідно, в 1,4-1,2 раза та в 1,9-1,6 раза (p<0,05-0,01). У клітинах крові поросят, яким вводили тироксин, виявляється інтенсифікація перетворення глюкози в реакціях гліколізу. Так, на окремих стадіях експерименту в еритроцитах зростає активність гексокінази, 6-фосфофруктокінази, піруваткінази, збільшується вміст лактату і знижується концентрація пірувату, а в нейтрофільних гранулоцитах збільшується активність гексокінази і лактатдегідрогенази (p<0,05-0,001).

При дослідженні впливу інсуліну на енергетичні процеси у клітинах системи гемопоезу встановлено, що гормон зумовлює активацію перетворення глюкози в реакціях гліколізу і пентозофосфатним шляхом, а в деяких клітинах – зниження інтенсивності аеробних ланок катаболізму субстратів. Так, в еритроїдних клітинах 3- і 10-денних тварин, яким вводили інсулін, збільшується активність гексокінази, піруваткінази, лактатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (p<0,05). У мієлоїдних клітинах 10-денних тварин інсулін активує гексокіназу і піруваткіназу (p<0,01-0,001), у тимоцитах – піруваткіназу і лактатдегідрогеназу (p<0,01-0,001), у лімфоцитах – лактатдегідрогеназу (p<0,01), у клітинах селезінки – гексокіназу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу (p<0,05), в еритроцитах – піруваткіназу і лактатдегідрогеназу (p<0,05-0,01). Збільшення активності ферментів гліколізу супроводжується інтенсифікацією утворення лактату в еритроїдних клітинах кісткового мозку і крові (p<0,05), зниженням концентрації пірувату в еритроцитах (p<0,05), пригніченням активності цитохром с-оксидази в еритроїдних клітинах