КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЯСИНСЬКА ІННА МИХАЙЛІВНА

УДК 577. 152. 199.1/175.64

ВИДІЛЕННЯ, ДОСЛІДЖЕННЯ КАТАЛІТИЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТА МЕХАНІЗМІВ РЕГУЛЯЦІЇ АКТИВНОСТІ ЦИТОХРОМУ Р450 АРОМАТАЗИ

03. 00. 04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного

факультету Одеського національного університету

м. І. І. Мечникова .

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор

Розанов Анатолій Якович,

Одеський національний університет імені

І. І. Мечникова,

професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Дмитренко Микола Петрович,

Інститут екогігієни і токсикології імені

Л.І. Медведя,

Завідувач лабораторії біохімії

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Левицький Євген Леонідович,

Інституту фармакології та токсикології АМН України,

головний науковий співробітник відділу

біохімічної фармакології

Провідна установа – Інститут біохімії ім О. В. Палладіна

НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “__18___”____березня__________2002 р. о 16 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 001. 24 у Київському

національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

вул. Академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

01033, Київ-33, вул. Володимирська, 52.

Автореферат розісланий____29_січня__________________ 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Кірсенко О. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальність теми. Цитохром Р450 ХІХА1 ароматаза (КФ: 1.14.14.1) – фермент, що каталізує послідовне трьохразове гідроксилювання андростендіону та тестостерону у положенні 19 та одноразове – у положенні 2 (Brodie et. al., 1999). Утворені продукти реакції перетерплюють некаталітичне декарбоксилювання за 19-м вуглецевим атомом, що призводить до ароматизації першого кільця стероїдного ядра з утворенням естрону та естрадіолу, відповідно.

За структурою ароматаза, як і всі ізоформи цитохрому Р450, є гемопротеїд та вміщує тіол-зв’язаний гем. У якості донору електронів фермент використовує НАДФН+Н+ (Brodie et al., 1999).

Відомо, що аскорбінова кислота та інші відновлювачі активують ряд ферментів, що вміщують гем, наприклад деякі ізоформи цитохрому Р450, що відповідають за утворення кортикостероїдів (Смірнов, 1974). У зв’язку з цим можливо, що аскорбінова кислота та інші відновлювачі (відновлений глутатіон, цистеїн, гідрохінон) впливають на ароматазну активність. Однак висунуте припущення не було підтверджено експериментально. Вивчення цього питання викликає науковий та практичний інтерес.

Встановлено, що кортизол активує ароматазу у дослідах in vivo (Schmidt, et al. 1994). Однак невідомо, чи активує кортизол ароматазу безпосередньо, або індукує експресію її гену. З’ясування цього ефекту є актуальним завданням.

В останній час у довкіллі ідентифіковані токсиканти, що проявляють естрогенну активність. Найбільш розповсюджені серед них поліхлорбіфеніли, а також деякі ізофлавони рослинного походження (Safe, 1994). Відомо, що поліхлорбіфеніли є лігандами гему та здатні інгібувати каталітичну активність деяких ферментів - гемопротеїдів (Giordano et al., 1976). Крім того, теоретично можливо, що поліхлорбіфеніли та ізофлавони здатні впливати на експресію ароматазного гену. Однак, вплив цих сполук на активність ароматази на сьогоднішній день вивчений не достатньо, тому актуальним завданням є дослідження впливу такого роду нестероїдних сполук з естрогеноподібною дією на активність ароматази, як ферменту, що генерує стероїдні естрогени. З іншого боку теоретичне та практичне значення має вивчення активності ароматази за впливу фармакологічно активних флавоноїдів (кверцетину та інших), що проявляють Р-вітамінну активність і структурно споріднені до поліхлорбіфенілів та ізофлавоноїдів.

Встановлено, що активність та кількість ізоформ цитохрому Р450, що метаболізують ксенобіотики, знижується в умовах оксидативного стресу. Але невідомо, чи впливає гіперпродукція активних форм кисню на активність цитохрому Р450 ароматази, а також інших гемопротеїдів, таких як синтаза оксиду азоту, що генерує потужний інгібітор ароматази - NO. З’ясування цього питання є актуальним завданням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема подано дисертації затверджена на засіданні вченої ради біологічного факультету ОНУ ім. І. І. Мечникова та є частиною планової теми НДР кафедри біохімії (напрямок "Здоров'я людини") "Механізми реалізації активності вітамінів як інтегративної системи регуляторів метаболізму" (реєстраційний номер 0897V008988).

Мета і задачі дослідження. Метою наведеної роботи є вивчення впливу відновлювачів - антиоксидантів: аскорбінової кислоти, глутатіону-SH, цистеїну та гідрохінону, глюкокортикоїду кортизолу, поліхлорбіфенілів ДДТ та ДДЕ, фітоестрогену геністеїну та флавоноїду кверцетину на активність високоочищених препаратів ароматази в дослідах in vitro, а також вивчення впливу деяких з цих агентів на активність ароматази та утворення естрогенів в дослідах in vivo.

У процесі виконання роботи вирішували завдання:

Вдосконалення методів очищення ароматази, яке дозволило б отримати високоочищені ферментні препарати з тваринних тканин з високим виходом ферменту.

Вивчення впливу аскорбінової кислоти, кортизолу, ДДТ, геністеїну та кверцетину на активність та вміст ароматази у тваринних тканинах у дослідах in vivo.

Вивчення впливу оксидативного стресу (гіперпродукції активних форм кисню) та змін активності синтази оксиду азоту на активність цитохрому Р450 ароматази.

Об’єкт дослідження – цитохром Р450 ароматаза, яку досліджували на трьох рівнях – очищені препарати, гомогенати тваринних тканин, цілісний тваринний організм.

Предмет дослідження – каталітичні властивості та механізми регуляції активності цитохрому Р450 ароматази.

Методи дослідження – цитохром Р450 ароматазу очищали з матки щурів афінним осадженням на активованій субстратом агарозі; активність ароматази, синтази оксиду азоту, вміст естрогенів та S-нітрозотіолів визначали за допомогою спектрофотометричних методів; чистоту препаратів ароматази та вміст цього ферменту у тканинах визначали за допомогою диск-електрофорезу в поліакріламідному гелі з подальшим спектрофотометричним аналізом.

Наукова новизна отриманих результатів. У наведеній роботі вперше розроблений метод виділення та очищення цитохрому Р450 ароматази, заснований на афінному осадженні ферменту на агарозі, до якої ковалентно приєднаний тестостерон через спейсер янтарну кислоту. Показано, що аскорбінова кислота та інші відновлювачі активують ароматазу. З’ясовано, що кортизол активує ароматазу, а поліхлорбіфеніли та ізофлавоноїди конкурентно інгібують її активність, а також знижують кількість активного ферменту в цілісному організмі щурів. Встановлено, що кверцетин є високоспецифічним конкурентним інгібітором ароматази. Показано, що активність ароматази знижується в умовах оксидативного стресу.

Практичне значення отриманих результатів. Виходячи з отриманих нами результатів, аскорбінова кислота може бути рекомендована для досліджень як агент, що стимулює активність ароматази, а кверцетин – що інгібує її.

Встановлене в роботі зниження ароматазной активності в умовах оксидативного стресу вказує на можливість гіпопродукції естрогенів за вірусних інфекцій, радіаційних уражень та інших станах організму, при яких спостерігається гіперпродукція активних форм кисню.

Особистий внесок здобувача. Усі наведені в роботі дослідження та методичні розробки здійснені безпосередньо автором під керівництвом доктора медичних наук, професора А. Я. Розанова.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлен на 18-му Всесвітньому конгресі з біохімії та молекулярної біології (м. Бірмінгем, Велика Британія, 2000), на конференції молодих вчених “Актуальные вопросы современного естествознания” (м. Сімферополь, 2001) та на 27-му з’їзді Федерації Європейських біохімічних товариств (Лісабон, Португалія, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 наукових статей та одержаний 1 патент України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 128 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, 12 розділів власних досліджень, висновків і списку використаних джерел, серед яких 66 відчизняних та 134 іноземних. Матеріал ілюстровано 9 таблицями та 26 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури.

Розглянуто роль цитохрому Р450 ароматази в біохімічних процесах та її місце в біосинтезі стероїдних гормонів. Обговорено дані літератури про структуру, механізми дії, субстратну спеціфічність ароматази та вплив різноманітних речовин на її активність. Наведено матеріали про участь даного ферменту у розвитку патологічних процесів в організмі людини. Обгрунтовано необхідність проведення наведених досліджень.

Методи експериментальних досліджень.

Дослідження розділяли на два етапи. На першому етапі досліджували вплив відновлювачів, поліхлорбіфенілів, кортизолу, геністеїну та кверцетину на активність високоочищених препаратів цитохрому Р450 ароматази. Фермент очищали за допомогою розробленого нами методу, який заснований на афінному осадженні ароматази на агарозі, ковалентно з’єднаній з тестостероном за допомогою спейсеру – янтарної кислоти, після попереднього очищення. Розробку захищено патентом України (Ясинська, 2001). Одержаний за допомогою даного методу препарат (ступінь очищення ферменту 220 разів, а його вихід – 23,3 %), стабільний протягом приблизно двох тижнів, був використаний для вивчення впливу описаних вище агентів на ароматазну активність.

У якості об’єкту для виділення ароматази використовували матку щурів лінії Вістар вагою вагою 200 20 г у віці 5 – 6 місяців.

Активність ароматази в гомогенатах та очищених препаратах визначали за методом, що заснований на реєстрації кількості НАДФН+Н+, що окислюється ферментом при рН 7,4 в присутності субстрату протягом однієї хвилини на 1 мг білка (Ясинська, 1999).

На другому етапі вивчали вплив аскорбінової кислоти, кортизолу, ДДТ, геністеїну та кверцетину на активність ароматази та утворення естрогенів в цілісному організмі щурів in vivo.

У дослідах використовували однопоносних щурів-самиць лінії Вістар у віці 3 - 5 місяців вагою – 100 - 200 г. Для кожної серії дослідів брали по 10 однопоносних щурів. Тварин розподіляли на дві групи (по 5 голів) – контрольну та дослідну. Тварини контрольних груп отримували внутрішньочеревно 0,9 % розчин NaCl (під час вивчення дії аскорбінової кислоти, геністеїну та кверцетину) або персикову олію (при вивченні дії кортизолу та ДДТ). Тварини дослідної групи отримували аскорбінову кислоту (100 мг/кг), ДДТ (20 мг/кг), геністеїн (500 мкг/кг), кортизол (20 мг/кг) та кверцетин (20 мг/кг) у відповідних розчинниках. Усі ін’єкції здійснювали протягом трьох діб. Через дві години після останньої ін’єкції тварин декапітували. Під час дослідження впливу аскорбінової кислоти та кверцетину на активність ароматази та вміст естрогенів у щурів проводили забір крові з серця під хлороформним наркозом, після чого здійснювали декапітацію. В усіх випадках для досліджень брали матку та яєчники щурів, в гомогенатах яких визначали ароматазну активність. З крові тварин отримували плазму, у якій визначали загальний вміст естрогенів (Ittrich, 1960). Крім того, вивчали кількість ароматази в гомогенатах яєчників та матки щурів.

Кількісне визначення ароматази (проводили лише в органах тварин, що отримували геністеїн, та відповідної контрольної групи) здійснювали шляхом екстракції мікросомальних білків холатом натрію (Margaret, 1990), які потім розділяли за допомогою диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі (Остерман, 1981), ідентифікували ароматазу (Sumbayev, Yasinska, 2001) та визначали її кількість методом диференційної спектрофотометрії, який базується на вимірюванні величини світлопоглинання комплексу відновленого цитохрому Р450 з монооксидом вуглецю при 450 нм (Omura, Sato, 1964).

На цьому етапі також вивчали вплив оксидативного стресу на активність ароматази, синтази оксиду азоту та вміст S-нітрозотіолів. Для досліджень використовували 10 однопоносних щурів-самиць лінії Вістар у віці 8 місяців вагою 250 20 г. Тварин розділяли на дві групи (по 5 голів). Тварини контрольної групи отримували 0,9 % NaCl, а дослідної – розчин CoCl2 в 0,9 % NaCl із розрахунку 30 мг/кг (Каліман, Беловецька, 1986). Ін’єкції здійснювали внутрішньочеревно, одноразово, та через дві години після ін’єкцій тварин декапітували, ізолювали яєчники та матку, в гомогенатах яких визначали активність ароматази, синтази оксиду азоту (Сумбаєв, Ясинська, 2000) та вміст S-нітрозотіолів (Wink et al., 1996), що є показником дії оксиду азоту (ІІ) на білки. Показником пероксидного окислення ліпідів служив вміст тіобарбітурат–реактивних продуктів (основним з них є малоновий діальдегід), які визначали за відомою методикою (Стальна, Гарішвілі, 1977).

Отримані результати статистично обробляли у відповідності до t-критерію Стьюдента.

Відомості про очищені ферментні препарати.

При використанні агарози, яка вміщувала тестостерон для очищення ароматази, були отримані препарати, ступень очищення ферменту в яких у середньому дорівнював 220 разів, а його вихід – 23,3 %. Km ароматази в першому випадку дорівнювала 0,49 0,05 мМ, а Vmax реакції 408,2 21,1 нмоль хв1 на 1 мг білка.

Вплив відновлювачів - антиоксидантів на активність ароматази у дослідах in vitro та in vivo.

Нами встановлено, що відновлювані - антиоксиданти – аскорбінова кислота, глутатіон-SH, цистеїн у кінцевих концентраціях 0,2 мМ та вище є активаторами очищеної ароматази в дослідах in vitro (рис. 1). Найвища швидкість реакції спостерігається при кінцевій концентрації аскорбінової кислоти – 0,3 мМ (рис 1.), цистеїну – 0,4 мМ (рис. 2), глутатіону-SH – 0,6 мМ (рис. 2). При вищих концентраціях швидкість реакції знижується, але залишається достовірно підвищеною у порівнянні з вихідною. Гідрохінон активує фермент при кінцевих концентраціях 0,1 – 0,3 мМ (рис. 3). Найвища швидкість реакції спостерігається при його кінцевій концентрації – 0,2 мМ. При кінцевих концентраціях агенту від 0,4 мМ та вище швидкість ароматазної реакції знижується до вихідного рівню.

Активуючи ароматазу, відновлювачі, очевидно, підтримують гемінове залізо ферменту у відновленому стані. Крім того, частково окислені форми відновлювачів здатні окислювати НАДФН+Н+ та прискорювати передачу електронів від нього до каталітичного центру ферментів (Смірнов, 1974). Ефект, що спостерігається у випадку впливу

Рис. 1. Залежність швидкості ароматазної реакції від концентрації аскорбінової кислоти в реакційній системі

Рис. 2. Залежність швидкості ароматазної реакції від концентрації цистеїну ( ) та глутатіону-SH ( ? ) в реакційній системі

Рис. 3. Залежність швидкості ароматазної реакції від концентрації гідрохінону в реакційній системі

Рис. 4. Вміст естрогенів у плазмі крові контрольних (білий колір) та ін’єкованих аскорбіновою кислотою (сірий колір) щурів

гідрохінону на ароматазну активність можна пояснити його можливою взаємодією, як поліфенолу, з активним центром ферменту, що заважає приєднанню субстрату до нього.

В дослідах in vivo показано, що в яєчниках та матці щурів, що отримували аскорбінову кислоту, активність ароматази була достовірно підвищена (таблиця 1). Вміст естрогенів в сироватці крові тварин, що отримували аскорбінову кислоту був також достовірно підвищений (рис 4).

Таблиця 1

Активність ароматази в яєчниках та матці контрольних та ін’єкованих аскорбіновою кислотою щурів (n=5)

* - розбіжності достовірні у порівнянні з контролем, p < 0.05

З цих даних можна зробити висновок, що аскорбінова кислота активує ароматазу та утворення естрогенів в цілісному організмі щурів.

Вплив кортизолу, поліхлорбіфенілів, геністеїну та кверцетину на активність ароматази у дослідах in vitro та in vivo.

Встановлено, що в дослідах in vitro кортизол у кінцевих концентраціях від 1 до 10 мкМ не впливає на активність високоочищеної ароматази. Однак, в дослідах in vivo було показано, що даний агент викликає достовірне підвищення активності ароматази в яєчниках та матці щурів (рис. 5). Зроблено припущення, що кортизол індукує експресію ароматазного гену, за рахунок чого підвищується кількість активного ферменту в тканинах, та, відповідно, його активність.

У дослідах in vitro поліхлорбіфеніли (ДДТ і ДДЕ) та геністеїн достовірно інгібують високоочищену ароматазу при концентраціях від 0,05 мМ та вище (рис. 6).

Рис. 5. Активність ароматази в гомогенатах яєчників (1) та матки (2) контрольних (білий колір) та ін’єкованих геністеїном (сірий колір) щурів

Рис. 6. Залежність швидкості ароматазної реакції від концентрації ДДТ ( ), ДДЕ ( ) та геністеїну ( ) в реакційній системі

Дослідження кінетики інгібування показали, що воно має конкурентний характер. Для кожного інгібітора були розраховані константи дисоціації фермент - інгібіторного комплексу (таблиця 2).

Таблиця 2

Значення інгібіторних констант (Кі) для інгібіторів ароматази

В дослідах in vivo показано, що активність цитохрому Р450 ароматази в яєчниках та матці щурів, яким ін’єкували ДДТ та геністеїн, достовірно знижується. У випадку конкурентного інгібування ферментативної реакції in vivo зниження активності ферменту неможливо зареєструвати в гомогенаті, тому що субстрат витискує інгібітор з активного центру ферменту. Для з’ясування цього в гомогенатах яєчників та матки піддослідних тварин досліджували кинетику ароматазної реакції. Встановлено, що Km ароматази в органах контрольних та дослідних тварин не змінюється, а максимальна швидкість реакції достовірно знижується (таблиця 3). Такий ефект може спостерігатись у разі неконкурентного алостеричного інгібування ферменту, яке в свою чергу призводить до зниження молекулярної активності ферменту. Це суперечить результатам,

Таблиця 3

Значення Km та Vmax в яєчниках та матці щурів за ін’єкцій ДДТ та геністеїну

(М m; n = 5)

* - розбіжності достовірні у порівнянні з контролем, p < 0,05

що отримані в дослідах in vitro, де було встановлено конкурентне інгібування реакції. З іншого боку, зниження максимальної швидкості зі зберіганням величини константи Міхаеліса може також спостерігатись в разі зниження кількості ферменту у реакційній системі. Тому ми припустили, що ДДТ та геністеїн, як нестероїдні сполуки, що проявляють естрогеноподібний ефект, інгібують експресію ароматазного гену та, відповідно, знижують кількість активного ферменту в яєчниках та матці. Щоб підтвердити це припущення ми електрофоретично визначали кількість ароматази в гомогенатах яєчників та матки щурів, що отримували геністеїн, та відповідних органів контрольних тварин. Встановлено, що кількість ароматази в гомогенатах яєчників та матки щурів, яким ін’єкували геністеїн, достовірно знижена у порівнянні з контрольною групою (таблиця 4). Таким чином, цілком можливо, що досліджені агенти інгібують цитохром Р450 ароматазу на геномному рівні, тобто гальмують експресію її гену.

Таблиця 4

Кількість ароматази в яєчниках та матці щурів за умов ін’єкцій геністеїну

* - розбіжності достовірні у порівнянні з контролем, p < 0,05

Встановлено, що кверцетин інгібує високоочищену ароматазу в концентраціях від 18,75 нМ та вище (рис. 7). Дослідження кинетики інгібування показало, що воно має конкурентний характер. Розрахована інгібіторна константа (таблиця 2) була досить близька до відомих з літератури констант незворотних інгібіторів ароматази – форместану та екземестану (Brodie et al., 1999).

В дослідах in vivo встановлено, що активність ароматази в яєчниках та матці щурів, що отримували кверцетин, достовірно знижується (таблиця 5). Цьому відповідає достовірне зниження вмісту естрогенів у сироватці крові піддослідних тварин (рис. 8). Дослідження кінетики реакції показало, що максимальна швидкість реакції в гомогенатах органів контрольних та дослідних тварин зберігається, у той час як знижується константа

Таблиця 5

Активність ароматази в яєчниках та матці щурів, що отримували кверцетин (n = 5)

* - розбіжності достовірні у порівнянні з контролем, р<0,05

Рис. 7. Залежність швидкості ароматазної реакції від концентрації кверцетину в реакційній системі

Рис. 8. Вміст естрогенів у плазмі крові контрольних (білий колір) та ін’єкованих кверцетином (сірий колір) кислотою щурів

Міхаеліса (рис. 9). Тобто в даному випадку конкурентне інгібування реєструється в гомогенаті у дослідах in vivo. Таке можливо лише у випадку незворотного конкурентного інгібування ферменту. Таким чином, можна зробити припущення, що кверцетин є незворотним конкурентним інгібітором ароматази.

Рис 9. Залежність швидкості ароматазної реакції від концентрації субстрату в яєчниках (А) та матці (Б) контрольних ( ) та ін’єкованих кверцетином ( ) щурів

Активність ароматази, синтази оксиду азоту та вміст S-нітрозотіолів в яєчниках та матці щурів за оксидативного стресу, індукованого дією хлориду кобальту (ІІ).

Встановлено, що в яєчниках та матці щурів, що отримували хлорид кобальту вміст тіобарбітурат-реактивних продуктів був достовірно підвищений (таблиця 5), що свідчить про інтенсифікацію процесів вільнорадикального пероксидного окислення ліпідів в даних органах.

Показано, що в яєчниках та матці щурів, що отримували хлорид кобальту, активність ароматази була достовірно знижена (таблиця 6). Це свідчить про інгібування ферменту за участі активних форм кисню. Можна зробити висновок про інгібуючий вплив саме активних форм кисню на активність ароматази та інших ізоформ цитохрому Р450, оскільки відомо, що хлорид кобальту не впливає на активність даних ферментів (Каліман та ін., 1997). Активність синтази оксиду азоту та вміст S-нітрозотіолів в гомогенатах яєчників та матки щурів також були достовірно знижені.

Зниження активності ароматази, а також синтази оксиду азоту може бути результатом безпосередньої взаємодії активних форм кисню, як лігандів гему, з даними ферментами, а також їх інгібуючого впливу на активність -амінолевулінатсинтази (Каліман, Беловецька, 1986), що гальмує синтез гему та викликає недолишок простетичних груп для здійснення посттрансляційної модифікації відповідних ферментів з утворенням біологічно активних оксигеназ.

Таблиця 6

Активність ароматази, синтази оксиду азоту, вміст нітрозотиолів та малонового діальдегіду в яєчниках та матці щурів за оксидативного стресу, індукованого дією хлориду кобальту (ІІ)

* - розбіжності достовірні у порівнянні з контролем, p < 0.05

Слід відмітити, що знижуючи активність ароматази, активні форми кисню гальмують утворення NO-синтазою її потужного інгібітору – оксиду азоту.

ВИСНОВКИ

1. У результаті комплексних досліджень на високоочищених ферментних препаратах та групах однопоносних щурів-самиць лінії Вістар отримані нові дані відносно регуляції активності цитохрому Р450 ароматази – ключового ферменту в біосинтезі естрогенів. Встановлено, що аскорбінова кислота, глутатіон-SH, цистеїн та гідрохінон є активаторами ароматазної реакції. З’ясовано, що кортизол активує ароматазу, а поліхлорбіфеніли та геністеїн конкурентно інгібують її активність, а також знижують кількість активного ферменту в цілісному організмі щурів. Встановлено, що кверцетин є високоспецифічним конкурентним інгібітором ароматази. Показано, що активність ароматази знижується в умовах оксидативного стресу.

2. Розроблений нами метод дозволяє отримати високоочищені, препарати цитохрому Р450 ароматази з високим виходом ферменту – більш ніж 20 %.

3. Відновлювані-антиоксиданти: аскорбінова кислота, глутатіон-SH, цистеїн та гідрохінон в концентраціях від 0,1 до 1,0 мМ активують очищену ароматазу матки щурів у дослідах in vitro.

4. У дослідах in vivo аскорбінова кислота у дозі 100 мг/кг підвищує активність ароматази в матці та яєчниках, а також підвищує вміст естрогенів у плазмі крові щурів-самиць лінії Вістар.

5. Поліхлорбіфеніли – ДДТ та ДДЕ, а також ізофлавоноїд геністеїн у концентраціях від 0,05 мМ та вище конкурентно інгібують очищену ароматазу у дослідах in vitro.

6. У дослідах in vivo ДДТ у кількості 20 мг/кг та геністеїн у кількості 500 мкг/кг знижують активність ароматази в матці та яєчниках щурів-самиць лінії Вістар, можливо, зменшуючи кількість активного ферменту.

7. Кверцетин конкурентно інгібує очищену ароматазу в дослідах in vitro в концентраціях від 18,75 нМ та вище з високою специфічністю (інгібіторна константа дорівнює 15,6 нМ).

8. У дослідах in vivo кверцетин у дозі 20 мг/кг конкурентно інгібує ароматазу в яєчниках та матці, а також знижує вміст естрогенів у плазмі крові щурів-самиць лінії Вістар.

9. В умовах оксидативного стресу, індукованого дією хлориду кобальту, активність ароматази, синтази оксиду азоту та вміст S-нітрозотіолів знижується в яєчниках та матці щурів-самиць лінії Вістар.

СПИСОК ОПУБЛКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦ

Сумбаев В.В., Ясинская И.М. Влияние аскорбиновой кислоты на окисление аденина и образование мочевой кислоты в организме животных и человека // Укр. биохим. журн. – 1997. – 69, № 2. – С. 116–120.

Ясинская И.М. Влияние восстановителей - антиоксидантов на активность ароматазы матки крыс in vitro // Укр. биохим. журн. – 2000. – 72, №2. – С. 47–50.

Ясинська І.М. Активнісь ароматази за впливу гідрокортизону та геністеїну // Вісник Одеського державного університету. Серія Біологія. – 2000. – 5, № 1. – С. 54–59.

Сумбаев В. В., Ясинская И. М. Влияние ДДТ на активность синтазы оксида азота в печени, легких и головном мозге крыс // Современные проблемы токсикологии. – 2000. – 3, № 3. – С. 3–7.

Ясинская И.М., Розанов А.Я. Влияние нестероидных веществ с эстрогеноподобным эффектом на активность ароматазы // Укр. биохим. журн. – 2001. – 73, № 3. – С. 121-125.

Ясинская И.М. Кверцетин - новый необратимый ингибитор цитохрома Р450 ароматазы // Ученые записки ТНУ. – 2001. – 14, №2. – С. 200–203.

Ясинская И.М., Розанов А.Я. Активность цитохрома Р450 ароматазы, синтазы оксида азота и содержание S-нитрозотиолов в яичниках и матке крыс при оксидативном стрессе, вызванном хлоридом кобальта// Укр. биохим. журн. – 2001. – 73, № 6. – С. 131–133.

Sumbayev V.V., Yasinska I.M. Activities of xanthine oxidase, nitric oxide synthase, aromatase and level of cytochrome P450 1A1, 1A2 and 1В1 isoforms in rat upon parenteral genistein injections //Біополімери і клітина. – 2001. – 17, №5. – P. 396–400.

Пат. 2000106091 Україна МПК 7 С 12 N 9 / 02. Спосіб очищення цитохрому Р450 ароматази / Ясинська І.М. № 42198; заявл. 30.10.2000; опубл. 15.10.2001, Бюл. № 9.

Yasinska I.M., Sumbayev V.V. The regulation of the aromatase activity by the reductors - antioxidants, glucocorticoids and unsteroid estrogens // Proc. 18-th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. – Birmingham (UK), 2000. – P. 322.

Yasinska I.M. and Sumbayev V.V. The activities of aromatase, cytochrome P450 isoforms inducible by xenoestrogens (1A1, 1A2 and 1B1) as well as nitric oxide synthase in the rat organism under conditions of cobalt chloride mediated oxidative stress. // Eur. J. Biochem. Proc. 27-th FEBS/PABMB Meeting. – Lisbon (Portugal) – 2001. – 268, S. 1. – P. 66.

АНОТАЦІЇ

Ясинська І. М. Виділення, дослідження каталітичних властивостей та механізмів регуляції активності цитохрому Р450 ароматази. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002

Дисертацію присвячено вивченню каталітичних властивостей та механізмів регуляції активності цитохрому Р450 ХІХА1 ароматази на трьох рівнях – очищені ферментні препарати, гомогенати тканин щурів, а також цілісний тваринний організм.

Досліджено вплив відновлюванів-антиоксидантів – аскорбінової кислоти, глутатіону-SH, цистеїну та гідрохінону на активність очищеної ароматази з матки щурів. Показано, що дані агенти є активаторами ароматазної реакції. В дослідах in vivo аскорбінова кислота активує ароматазу в яєчниках і матці та підвищує вміст естрогенів в плазмі крові щурів лінії Вістар. Встановлено, що гідрокортизон не впливає на активність високоочищеної ароматази з матки щурів, але в дослідах in vivo підвищує ароматазну активність в яєчниках і матці щурів лінії Вістар. Поліхлорбіфеніли ДДТ та ДДЕ, а також ізофлавоноїд геністеїн, які є ксеноэстрогенами, конкурентно інгібують очищену з матки щурів ароматазу, а також зменшують її кількість в матці та яєчниках щурів в дослідах in vivo. Флавоноїд кверцетин високоспеціфічно інгібує активність ароматази, як в очищених ферментних препаратах, так і в яєчниках та матці піддослідних щурів лінії Вістар. Цьому відповідає зниження кількості естрогенів у плазмі крові щурів, що отримували кверцетин. Активність ароматази, синтази оксиду азоту, а також вміст S-нітрозотиолів знижуються в матці та яєчниках щурів лінії Вістар під впливом оксидативного стресу, індукованого дією хлориду кобальту (ІІ).

Ключові слова: ароматаза, естрогени, аскорбінова кислота, глутатіон, цистеїн, гідрохінон, ДДТ, ДДЕ, геністеїн, кверцетин, оксидативний стрес.

Ясинская И.М. Выделение, исследование каталитических свойств и механизмов регуляции активности цитохрома Р450 ароматазы. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена исследованию каталитических свойств и механизмов регуляции активности цитохрома Р450 ХIXА1 ароматазы на трех уровнях – очищенные ферментные препараты, гомогенаты тканей крыс и целостный животный организм. Изучено влияние восстановителей - антиоксидантов – аскорбиновой кислоты, глутатиона-SH, цистеина и гидрохинона на активность очищенной ароматазы из матки крыс. Показано, что данные агенты являются активаторами ароматазной реакции. В опытах in vivo аскорбиновая кислота активирует ароматазу в яичниках и матке, а также повышает содержание эстрогенов в плазме крови крыс линии Вистар. Установлено, что гидрокортизон не влияет на активность высокоочищенной ароматазы из матки крыс, а в опытах in vivo увеличивает ароматазную активность в яичниках и матке крыс линии Вистар. Полихлорбифенилы ДДТ и ДДЕ, а также изофлавоноид генистеин, являющиеся ксеноэстрогенами, конкурентно ингибируют очищенную ароматазу из матки крыс, а также снижают ее активность и количество в яичниках и матке крыс линии Вистар в экспериментах in vivo. Флавоноид кверцетин высокоспецифично ингибирует активность ароматазы как в очищенных ферментных препаратах, так и в яичниках и матке крыс линии Вистар. Этому соответствует снижение содержания эстрогенов в плазме крови крыс линии Вистар, получавших кверцетин. Активность ароматазы, синтазы оксида азота и содержание S-нитрозотиолов снижаются в матке и яичниках крыс в условиях оксидативного стресса, вызванного действием хлорида кобальта (II).

Ключевые слова: ароматаза, эстрогены, аскорбиновая кислота, глутатион, цистеин, гидрохинон, ДДТ, ДДЕ, генистеин, кверцетин, оксидативный стресс.

Yasinska I. M. Purification, catalytic properties and activity regulation mechanisms of cytochrome P450 aromatase. – Manuscript.

Thesis for Candidate of Biological Sciences degree by speciality – 03.00.04 – biochemistry. – National Taras Shevchenko university of Kyiv, 2002.

Thesis is devoted to the investigations of catalytic properties and activity regulation mechanisms of cytochrome P450 XIXA1 aromatase on three levels – purified aromatase preparations, rat tissue homogenates and animal organism.

The in vitro effects of the reductors-antioxidants (ascorbic acid, glutathione-SH, cysteine and hydroquinone), glucocorticoid cortisol and unsteroid estrogens (polychlorinated biphenyls – DDT and DDE, 4, 5,7-trihydroxyisoflavon or genistein and flavonoid quercetin) on the highly purified rat uterine aromatase were studied. The aromatase was purified by the affinity precipitation on the testosterone - agarose after previous purification, which included homogenization of the material, isolation of the microsomes, elimination of the microsomal proteins by sodium cholate and aromatase precipitation by acetone. It was established that ascorbic acid, glutathione-SH, and cysteine are the aromatase activators in the concentrations 0.2 mM and higher, and hydroquinone is the aromatase activator in the concentrations 0.1 – 0,3 mM. The optimal aromatase activation was observed in different concentrations of the reductors (0.3 mM for ascorbic acid, 0.4 mM for glutathione-SH, 0.6 mM for cysteine and 0.2 mM for hydroquinone). The activation mechanism is based on the reduction of Fe3+ – the aromatase catalytic centеr and the reductor-dependent activation of the electron transportation from NADPH+H+ to the aromatase. Cortisol does not change the aromatase activity in vitro. Unsteroid estrogens - DDT, DDE and genistein are the isosteric aromatase inhibitors (Ki for DDT is 59.6 M, for DDE – 79.7 M and for genistein – 229.8 M). DDT and DDE are more powerful inhibitors then genistein. The inhibition mechanism in all cases may be based on the interactions of the inhibitors with the aromatase active centеr binding site. It was established earlier that DDT and DDE are haem ligands so the interactions between these inhibitors and haem iron also take place. It was established that quercetin inhibits aromatase activity in vitro in the concentrations 18,75 – 100 nM. The inhibition was competitive (Ki was 15,6 nM) according to the kinetical studies. Obtained results show high affinity of quercetin to the aromatase. For the in vivo studies tree months age Wistar female rats were used. They received respectively 20 mg of DDT and cortisol or 500 g of genistein with intraperitoneal injections. The injections were performed during 3 days with the interval in 24 hours. In two hours after the last injection animals were mortified, the ovaries and uteri were isolated and the aromatase activity and quantity was studied in these organs. It was established that cortisol strongly increases the aromatase activity in the rat ovaries and uteri. We concluded that cortisol as glucocorticoid induces the expression of the aromatase gene. DDT and genistein strongly decreased the aromatase activity in the rat ovaries and uteri. Kinetical studies showed that the enzyme quantity in this organs was decreased in comparison to control group. These results were confirmed by the measurement of the aromatase quantity in these organs. The aromatase with the other microsomal proteins were eliminated from the microsoms by the sodium cholate and divided with the help of disk-electrophoresis. After division the aromatase was identified and quantified. The results showed that in the ovaries and uteri of DDT and genistein injected rats the aromatase quantity was decreased in comparison to control group. In vivo studies of quercetin effect on the aromatase showed the decrease of it’s activity in the ovaries and uteri of quercetin injected rats. Vmax of the aromatase reaction was constant and Km increased as in the case of competitive inhibition. These results make possible to assume the irreversible aromatase inhibition by quercetin. Also the decrease of estrogens concentration in the blood serum of quercetin injected rats was observed. Cytochrome P450 aromatase and nitric oxide synthase activities were established to decrease in the ovaries and uteri of CoCl2 injected (oxidative stress modeling) Wistar female rats. Respectively the S-nitrosothiols concentration was also decreased. The quantity of thiobarbiturate reactive species was increased in the ovaries and uteri of CoCl2 injected rats. Assumed that reactive oxygen species formed by CoCl2 inhibit the activities of aromatase and nitric oxide synthase as haem ligands and inhibitors of haem biosynthesis.

Key words: aromatase, estrogens, ascorbic acid, glutathione, cysteine, hydroquinone, DDT, DDE, genistein, quercetin, oxidative stress.