МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ПЕТРАШЕВИЧ ЮЛІЯ ВІКТОРІВНА

УДК 616.15.-073.584:57.083.3

ПАТОФІЗІОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНИХ ЗМІН СИРОВАТКИ КРОВІ ПРИ ФОРМУВАННІ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ

14.03.04 – патологічна фізіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ОДЕСА – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник ? доктор медичних наук, професор

БАЖОРА ЮРІЙ ІВАНОВИЧ,

Одеський державний медичний університет,

завідувач кафедри клінічної імунології,

генетики та медичної біології

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, заслужений діяч науки та техніки України, професор ГОЖЕНКО АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної фізіології, м. Одеса

Доктор медичних наук, професор БОЙЧУК ТАРАС МИКОЛАЙОВИЧ, професор кафедри медичної біології Буковинської державної медичної академії МОЗ України, м. Чернівці

Провідна установа ? Донецький державний медичний університет МОЗ України, кафедра патологічної фізіології, м. Донецьк

Захист дисертації відбудеться “11” лютого 2003 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України (м. Одеса, провулок Валіховський, 2)

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Одеського державного медичного університету (м. Одеса, пров. Валіховський, 3)

Автореферат дисертації розіслано “09” січня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

к.мед.н., ст.н .сп. Р. В. Соболєв

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Формування імунної відповіді на чужорідний антиген – реакція, направлена на підтримку структурної та функціональної рівноваги організму.

Вона супроводжується тими або іншими змінами не тільки в клітинах, але й в біологічних рідинах, що становлять внутрішнє середовище організму (Драннік Г.Н., 1999; Петров Р.В., 2000; John Bradley, Jim McCluskey, 1994). Вивчення таких відхилень є актуальним у дослідженні процесів взаємодії системи імунітету з іншими системами, розкриття механізмів яких є одним із перспективних шляхів дослідження можливих варіантів розвитку імунної відповіді, формування патологічних імунних реакцій і, на основі цього, розробки нових методів діагностики й оцінки ефективності лікування багатьох захворювань. Суттєвим є дослідження змін вмісту та взаємодії різних біомолекул, які входять до складу біологічних рідин і безпосередньо зазнають відповідних змін при взаємодії антигенів, антитіл, цитокинів і власне клітин імунної системи, біологічно активних речовин, що створюють основу інших захисних реакцій (Бажора Ю.І та співав., 2000).

Діагностичне значення цих змін може бути встановлено за допомогою методу лазерної кореляційної спектроскопії (ЛКС), який надає багатопараметровий аналіз субфракційного складу плазми, сироватки крові та реєструє зміни, які вказують на механізми, що їх викликають (Бажора Ю.И., Носкин Л.А., 2002; Аклеев А.В. и соавт., 1997).

Метод ЛКС знаходить все більшого застосування в медико-біологічних дослідженнях. Однак, з огляду на багатокомпонентність біологічних рідин, які аналізуються, отримані в клінічних дослідженнях дані найчастіше важко інтерпретувати, оскільки в більшості випадків, останні розглядаються без паралельного вивчення тих чи інших процесів з використанням традиційних аналітичних методів і висуваються як гіпотези (Бажора Ю.И. и соавт., 1996).

Вдосконалення можливостей методу ЛКС може бути здійснено в умовах експерименту при моделюванні певного процесу та порівнянні патофізіологічних його параметрів, що отримані за допомогою фізичних, біохімічних, морфологічних та інших загальноприйнятих методів дослідження.

Вибір в якості об’єкта дослідження реакцій імунної системи пов’язаний з її величезною роллю та незмінною участю в будь-якій патології. Так, імунологічні реакції завжди поєднані з факторами неспецифічного захисту, антиоксидантною та іншими системами, комплексна дія яких спрямована на підтримку гомеостазу. Крім того, актуальними залишаються питання змін біологічних рідин при імуносупресивних станах і контролю за станом внутрішнього середовища під час тривалого використання лікарських засобів, які мають виражений токсичний вплив.

Ці аргументи обґрунтовують необхідність і доцільність проведення експериментальних досліджень імунних реакцій організму з одночасним використанням біохімічних та інших верифікованих методів дослідження, що допоможе з'ясувати механізми зрушень в ЛК-спектрах при різних патологіях та може знайти застосування в клінічній практиці для діагностики, оцінки тяжкості й ефективності лікування, а також прогнозу хвороби.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної НДР галузевого конкурсу МОЗ України “Розробка методів діагностики й оцінки ефективності фармакотерапії специфічних та неспецифічних інфекційно-запальних захворювань на основі молекулярно-генетичних і біофізичних технологій” (№ державної реєстрації 0199U000262), яка виконувалася в рамках науково-технічної програми 01.01. — “Охорона генофонду населення України”. Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є вивчення спектральних характеристик окремих складових сироватки крові й подальше встановлення напрямків патофізіологічних змін макромолекулярного складу сироватки крові в умовах розвитку реакцій первинної та вторинної імунної відповіді, запального процесу і імунодепресії, пов'язаної із використанням цитостатичних препаратів, для виявлення інтегральних показників, які відображають формування загальноадаптативних або патологічних реакцій організму.

Враховуючи всі аспекти актуальності цих питань, у даній роботі визначався такий ряд задач:

1. Визначити внесок основних компонентів сироватки крові в ЛК-спектрі та встановити його модифікації в залежності від температури й часу вимірювання зразків, що вивчаються;

2. Встановити макромолекулярні зміни спектральних характеристик біологічних речовин протягом часу перебігу реакцій взаємодії антиген-антитіла in vitro та при формуванні імунної відповіді при введенні антигену in vivo;

3. Провести аналіз субфракцій сироватки й черевного ексудату при експериментальному перитоніті та сироватки на фоні пригнічення імунної відповіді цитостатиками;

4. Порівняти інформативність ЛКС із загальноприйнятими методами лабораторного дослідження (імунологічними, біохімічними).

Об’єкт дослідження: імунологічні механізми, що спрямовані на підтримку сталості внутрішнього середовища в умовах гострої запальної реакції, при антигенній стимуляції та використанні цитостатиків.

Предмет дослідження: молекулярні зміни біологічних рідин при формуванні імунологічної відповіді на фоні первинної та вторинної імунної відповідей, перитоніту та при введенні цитостатиків.

Методи дослідження: патофізіологічні, біофізичні, біохімічні, імунологічні, стандартні статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлена обумовленість змін спектрів при моделюванні реакції антиген-антитіло in vitro та in vivo появою великомолекулярної фракції (95,0 та більше нм) у зв’язку з утворенням розчинних імунних комплексів, а також зростання відсоткового внеску у світлорозподіл цієї фракції при тривалій взаємодії відповідних компонентів. Крім того, виявлено, що двох фазність змін спектрів сироватки крові на початку реакцій формування первинної імунної відповіді та при розвитку вторинної імунної відповіді обумовлена збільшенням рівня білків гострої фази (БГФ), імуноглобулінів і розчинних імунних комплексів відповідно.

На прикладі експериментального перитоніту доведено, що токсична фаза пов’язана переважно з нагромадженням молекул з радіусом від 38,0 до 94,0 нм, що відповідає зростанню рівня гліколіпопротеїдів у сироватці крові та черевному ексудаті, та зменшенням низькомолекулярних фракцій, яке обумовлене зменшенням рівня імуноглобулінів, з подальшим зростанням показників відповідних фракцій при стабілізації процесу.

Встановлено також, що використання цитостатиків (6-меркаптопурину та метотрексату) знижує рівень низькомолекулярних і надвисокомолекулярних фракцій, що пов’язано, по-перше, з порушенням функцій імунної системи (здебільшого - гуморальної ланки імунної відповіді, зменшенням утворення імунних комплексів); по-друге, має гепатотоксичний ефект.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження молекулярного складу сироватки крові та перитонеального ексудату in vitro на прикладі розвитку запального процесу, імуносупресивного стану або стану активації імунної відповіді дозволяє вивчити характеристики окремих фракцій. Отримані результати дозволяють запропонувати метод ЛКС для оцінки ступеня очищення біологічно активних речовин, дає можливість раніше, ніж інші загальноприйняті методи дослідження, встановити розвиток дезадаптивних процесів, вплив небажаних ефектів лікарських засобів на системи організму, час їх максимального терапевтичного ефекту.

Особистий внесок здобувача полягає в постановці мети та задач науково-практичного дослідження, обґрунтуванні методів їх адекватного розв’язання, проведенні патентно-інформаційного пошуку за допомогою бази даних “Medline”, постановці, виконанні експериментальної частини роботи, самостійному проведенні патофізіологічних, біофізичних та імунологічних досліджень, аналізі й узагальненні власно отриманих результатів дослідження, здійсненні математико-статистичної обробки отриманих результатів, підготовці наукових праць до публікації та написанні дисертаційної роботи й автореферату.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та загальні висновки дисертаційної роботи доповідалися й дістали позитивну оцінку на таких наукових форумах: ІІІ Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю, присвяченому 100-річчю від дня народження акад. АМН СРСР проф. М. М. Горєва (м. Одеса, 2000); ІV Міжнародному медичному конгресі молодих вчених і студентів (м. Тернопіль, 2000); VІІІ Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (СФУЛТ) (м. Львів-Трускавець, 2000); 70-й підсумковій НПК студентів і молодих вчених (м. Одеса, 2001); V Міжнародному медичному конгресі молодих вчених і студентів (м. Тернопіль, 2001); XV Міжнародній НПК “Застосування лазерів у медицині та біології” (м. Ялта, 2001); І Національному з'їзді токсикологів України (м. Київ, 2001); II Національному з'їзді фармакологів України (м. Дніпропетровськ, 2001); VII Міжнародній НПК “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (м. Одеса, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових робіт, з яких 4 статті у фахових наукових журналах, 2 деклараційних патенти на винаходи (корисні моделі), решта 9 робіт – за підсумками роботи наукових закладів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу подано в одному томі; текстовий матеріал викладено на 184 сторінках машинопису, він складається з титульного аркуша, змісту, переліку умовних позначень, символів, одиниць, скорочень і термінів, вступу, огляду літератури, опису об’єкта, загальної методики й основних методів дослідження, чотирьох розділів власно виконаних досліджень, висновків і списку використаних джерел, котрий загалом містить 250 бібліографічних одиниць, з них: 184 вітчизняних наукових праць і країн СНД та 66 наукових праць – зарубіжних авторів; ілюстровано 33 таблицями та 24 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для визначення спектральних характеристик основних компонентів сироватки крові (альбуміну, глобуліну, протромбіну) проводили дослідження in vitro моноспецифічного розчину відповідних фракцій виробництва Одеської обласної станції переливання крові, розчини готували ex tempore відповідно до методичних рекомендацій (Бажора Ю.И. и соавт., 1996). Вимірювання проводили у двох температурних режимах (20,0 і 37,7?С) на 10, 20, 30-ту хвилину на ЛК-спектрометрі з метою визначення біофізичних характеристик даних компонентів у залежності від часу та температурних умов. Для встановлення змін спектральних характеристик рідин при розвитку реакції антиген-антитіло використовували сироватку здорових донорів-військовослужбовців (контроль) і хворих, які перебували на стаціонарному лікуванні (джерело антигенів), і моноспецифічну сироватку проти імуноглобуліну M (джерело антитіл) (виробництво НДІЕМ ім. М.Ф. Гамалєї, м. Москва).

Усі експериментальні дослідження проведені на 365 статевозрілих щурах лінії Вістар масою 120,0–150,0 г, які утримувались у звичайних умовах віварію на повноцінному харчовому раціоні. У відповідні доби експерименту під легким ефірним наркозом тварин забивали шляхом одномоментної декапітації згідно з усіма вимогами ВООЗ щодо використання тварин в експериментальних дослідженнях.

Для вивчення реакцій первинної та вторинної імунної відповіді тваринам вводили внутрішньоочеревно 5,0·109 еритроцитів барана (ЕБ) (0,5 мл, 50,0%-го розчину), попередньо відмитих у фізіологічному розчині. Декапітацію тварин здійснювали на 1-шу, 2-гу, 3-тю, 5-ту, 7-му, 10-ту, 14-ту доби первинної імунної відповіді. На 15-ту добу щурам додатково (вторинно) вводили ЕБ в кількості 5,0·104 (0,5 мл, 25,0%-го розчину) й аналізували сироватку крові протягом перших 10 діб розвитку реакцій вторинної імунної відповіді.

Для моделювання гострого розповсюдженого запального процесу використовували модель експериментального перитоніту (Дерябин И.А., 1964).

Для досліджень із використанням цитостатичних препаратів було створено дві експериментальні групи: щурам І групи через годину після одноразової антигенної стимуляції (5,0·109 ЕБ внутрішньоочеревно) протягом 4-х діб вводили підшкірно 6-меркаптопурин в дозі 50,0 мг/кг маси тіла, що становила 1/5 LD50, у ІІ групі через 24 та 48 год. після імунізації підшкірно вводили метотрексат у дозі 5,0 мг/кг маси тіла (доза є терапевтичною для людини). Обрана схема введення препаратів обумовлена раніше проведеними дослідженнями із вивченням відповідної кінетики імунологічних змін (Утешев Б.С., Бабичев В.А, 1974).

Сироватку крові досліджували за допомогою ЛК-спектрометра (довжина хвилі 0,6328 мкм, потужність випромінювання лазера 8,0 мВт, діапазон вимірювання розмірів частинок від 1,0 до 10000,0 нм). Прилад розроблений Санкт-Петербурзьким інститутом ядерної фізики РАН.

Усі біохімічні дослідження сироватки крові здійснювалися на автоматичному біохімічному аналізаторі “Spectrum Series II” фірми “Abbott” (США). Визначення рівня загального білка проводили за біуретовим методом за набором к.т. 9106 Ф. “Biocon”, в якості контроля використовували стандартний розчин альбуміну 80 г/л Ф. із мультикалібратором к.т. 65004 HWOO Ф. Рівень альбуміну визначали за реакцією з бромкрезоловим зеленим (ВСr) за набором к. № 9136 Ф. “Віосоn”. Глобулінова фракція визначалася розрахунковим методом. С-реактивний білок визначали за наявністю або відсутністю преципітації у капілярі.

З поміж імунологічних тестів визначали рівень антитілоутворюючих клітин (АУК) (за модифікацією Назаренко Н.А. и соавт., 1987) циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), фагоцитарну активність поліморфно-ядерних лейкоцитів (ПМЯЛ) і титр гетерофільних антитіл (ТГА) за стандартними методиками (Фриммель Г, 1990; Неллиус Д, 1984).

Математико-статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням загальноприйнятих методів варіаційної статистики на комп’ютері IBM АТ/РС 486 з розрахунком середньої величини [M], її середньоквадратичного відхилення ±[m] і t- критерію Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. При дослідженні розчину альбуміну методом ЛКС в умовах різних температурних режимів (20,0 та 37,0оС) встановлено, що відносна просторова стабілізація молекул альбуміну настає до 30 хвилини експерименту, причому при температурі 37,0 оС більш виражені процеси агрегації з утворенням великодисперсних частин, однак основний відсоток внеску за масою становлять частки з радіусом від 1,7 до 3,5 нм. Виявлення на 10-й та 20-й хвилині після приготування розчину великодисперсних частинок вказує на агрегаційні процеси, які відбуваються в розчині, особливо при температурі 37,0оС, але активність їх незначна, про що свідчить низький їх внесок за масою протягом усього експерименту.

Результати проведених нами досліджень розчину глобуліну показали, що при температурі 20,0 оС характер ЛК-спектрів більш стійкий до 30-ої хвилини експерименту та на 99,96 % складається зі світлорозсіювальних частинок розміром 3,7-5,9 нм. В умовах термостатування ЛК-спектри мали більш виражені коливання за світлорозподілом спектра.

При аналізі розчину протромбіну протягом усього часу дослідження переважну масу (99,98 - 99,99 %) становили частинки з гідродинамічним радіусом 1,41 – 1,81 нм (20,0 оС) та 1,62 - 5,82 - 3,15 нм при 37 оС. Аналіз змін спектральних характеристик основних компонентів сироватки крові показав, що розміри молекул альбуміну становлять від 2,2 до 3,5 нм, молекули глобуліну – від 3,7 до 5,9 нм, протромбіну – від 1,4 до 5,8 нм. Серед усіх розчинів, що досліджувалися, найбільш виражені агрегаційні зміни спостерігались у тих, які піддавалися термостатуванню (особливо, в розчині протромбіну); за результатами ЛКС встановлено високий ступінь очищення відповідних речовин.

У подальшому проводили дослідження моноспецифічної сироватки проти імуноглобуліну М у монокомпонентному розчині та в реакції з сироваткою здорових людей і хворих на гостру пневмонію і дисемінований туберкульоз легень. За результатами ЛКС моноспецифічна сироватка є високоочищеною речовиною з переважною кількістю частинок діаметром у діапазоні від 2,0 до 12,0 нм. Загальний вигляд усередненої гістограми ЛК-спектрів сироватки крові донорів мав трипікову конфігурацію (рис.1).

В реакціях взаємодії моноспецифічної сироватки проти імуноглобуліну М і сироватки крові здорових людей чітко демонструються піки частинок у діапазоні від 1,0 до 10,0 нм і великомолекулярних частинок із зсувом у бік більших розмірів вже через 1 хв. після постановки реакції антиген-антитіло (АГ-АТ) та поява, хоча й у незначній кількості, компонентів з діаметром більше 1000,0 нм.

ЛКС-метрія реакційної суміші АГ-АТ через 1 та 2 год. показала відсутність суттєвих змін у розподілі частинок на фоні зростання рівня велико- та понадвеликодисперсних (100,0–1000,0 нм і більше) частинок, що дає підстави вважати це взаємодією антигену й антитіла й утворенням імунних комплексів in vitro.

На етапі вивчення ЛК-спектрів у реакціях АГ-АТ при взаємодії з сироваткою крові хворих на гостру пневмонію виявлені такі зміни ЛК-спектрів.

Усереднена гістограма ЛК-спектра патологічної сироватки крові поза межами реакції мала двофазову характеристику з чітким лівобічним зсувом спектра з переважно низьким відсотком дрібнодисперсних частинок (1,0-10,9 нм) і наявністю фракції великомолекулярних компонентів (1000,0 нм і більше) (рис.1).

Через 1 хв. (в 50 % спостережень) і 1 год. після реакції виявлялася провідна за відносною масою дрібнодисперсна фракція (від 2,8 до 10,0 нм), зникає фракція понадвеликих частинок (1000,0 нм і більш), виявляються фракції, що мають діаметр частинок від 150,0 до 900,0 нм. До 2-ї години збільшується рівень частинок з радіусом від 1,0 до 37,0 нм і зростає внесок понадвеликомолекулярних частинок з радіусом більше 1000,0 нм, зменшується відсоток часток з радіусом від 95,0 нм і більше.

При дослідах із сироваткою крові хворих на дисемінований туберкульоз легень через 1 хв. після постановки реакції ЛК-спектри характеризувалися лише зсувом моди великих частинок у бік зменшення але зростання їх спостерігалося вже на 1-й годині паралельно зі збільшенням рівня понадвеликомолекулярних компонентів на 2-гу год.

Зміни, які виявлені при порівнянні усереднених гістограм у реакціях АГ-АТ з використанням сироватки хворих з усередненими гістограмами контрольних реакцій ймовірно, пов’язані з таким: по-перше, високий рівень дрібнодисперсних молекул свідчить про підвищений вміст антитіл, що є цілком логічним при гострому та хронічному запальних процесах, прикладами яких є пневмонія і дисемінований туберкульоз легень; по-друге, зростання рівня великомолекулярних сполук при пневмонії пов’язано з активацією імунної системи та здебільшого утворенням ЦІК, причому більш високі показники перших фракційних груп при аналізі сироватки хворих на дисемінований туберкульоз та в подальшому високі значення понадвисокомолекулярних фракцій у порівнянні зі значеннями спектрів хворих на пневмонію вказують на початково більш напружений стан й активацію імунних реакцій при відповідній патології.

При вивченні змін макромолекулярного складу і міжмолекулярних взаємодій компонентів сироватки крові в процесах розвитку імунної відповіді in vivo при введенні лабораторним тваринам чужорідного антигену за даними ЛКС спостерігається збільшення внеску частинок із радіусом 264,0 нм і більше протягом перших 4 діб первинної імунізації, але на 7-му добу останні повністю відсутні та з'являються знов у значно більшій кількості на 10-ту добу (рис.2).

Протягом 5-ї, 7-ї доби збільшується внесок частинок із радіусом 2,0-11,0 нм із подальшим наближенням до показників контролю.

Вже на 1-шу добу вторинної імунізації спостерігається збільшення четвертої (на 2-гу–4-ту добу експерименту), п'ятої фракційних груп, саме вони зазнали істотних змін (відсоток понадвеликомолекулярних частинок потроївся в порівнянні з вихідним рівнем). Незначного підвищення зазнали перша–друга фракційні групи на 1-шу, 5-ту добу. Зазначені зміни спектрального складу сироватки мають чітке патофізіологічне обґрунтування.

Виявлення великомолекулярних сполук на початкових етапах первинної імунізації є результатом зростання БГФ, в тому числі, С-реактивного білка, наявність якого є результатом адаптативних змін в організмі тварин у відповідь на введення ЕБ та вплив клітин імунної системи на купферівські клітини печінки. Це підтверджується даними літератури (Арцимович Н.Г и соавт., 1992; Хаитов Р.М. и соавт., 2000; Бажора Ю.І. та співавт., 2000) і результатами власних біохімічних досліджень, за якими, з деяким запізненням, також фіксується зростання рівня С-реактивного білка.

Здатність С-реактивного білка взаємодіяти з ліпопротеїдами низької та дуже низької щільності з утворенням комплексних сполук (Холодов Ю.Д., Чаялов В.П., 1990; Алешкин В.А. и соавт., 1988), може призводити до коливань у третій–четвертій фракційних групах на ЛК-гістограмах, що викликає підвищення внеску відповідних частинок на 7-му, 10-ту та 14-ту добу експерименту на фоні зменшення рівня частинок із радіусом 264,0 нм і більше, тобто тоді, коли С-реактивний білок вже зазнав катаболічних змін, оскільки останній є досить нестійкою сполукою (Алешкин В.А. и соавт., 1988).

Крім того, здатність активованих зірчастих ретикулоендотеліоцитів секретувати низькомолекулярний білок, що стимулює проліферацію ліпоцитів і посилює синтез ліпопротеїнів, також сприяє збільшенню рівня відповідних сполук (Холодов Ю.Д. и соавт., 1990 ).

При вторинній імунізації активація імунних механізмів відбувається швидше, тому зрозумілим є коливання рівня частинок з радіусом 2,0-11,0 нм, які характеризують наявність антитіл і участь їх в утворенні ЦІК, а також підвищення рівня альбулярної фракції сироватки крові. Зростання кількості понадвисокомолекулярних частинок (265,0 нм і більш) в даному випадку пов’язано з утворенням ЦІК. Ці твердження чітко корелюють з результатами імунологічних досліджень, а саме, зі встановленням високого рівня АУК і титру гетерофільних антитіл на відповідну добу експерименту.

При аналізі сироватки крові на моделі експериментального перитоніту відзначається значне зниження показників першої та другої фракцій протягом перших 3 діб експерименту з наближенням показників першої фракції на 5-ту добу до показників вихідного рівня (рис. 3).

У третій фракції відсотковий внесок частинок досягає максимальних значень на 2-гу, 3-тю добу (39,41; 35,46 %), на 5-ту добу набуває значень, які в 5,5 разів менше контролю й у 6 разів менше вихідного рівня (5,80 %).

Частинки четвертої фракційної групи досягають максимальних значень на 3-тю добу, але до 5-ї доби їх показники нижче вихідного рівня (33,37; 49,79; 30,29 %).

Підвищення внеску найбільших за своїм гідродинамічним радіусом частинок спостерігається на 1-шу, 5-гу добу експерименту (19,51 і 16,75 % у порівнянні з контролем – 4,94 %) із стійким зниженням показників цієї групи на 2-гу – 4-ту добу.

Ці зміни відображають стадійність розвитку патології, яка вивчається. Так, зниження показників перших двох фракцій, які за даними літератури (Камминс Г. И соавт., 1978; Серафимов-Димитров В. и соавт., 1974) та власних досліджень відповідають альбулярним, глобулярним білкам (імуноглобулінам класу М, А, G), обумовлено гіпопротеїн-, гіпоальбумін- і гіпоглобулінемією, що пов’язано, по-перше, з порушенням проникності стінок мікроциркуляторного русла, виходом білків через стінки капілярів, венул та зниженням внаслідок цього їх рівню у системному кровообігу, що є однією з найяскравіших ознак запалення (Глумов И.А. и соавт., 1993; Гостищев В.К. и соавт., 1992); по-друге, за даними літератури 2-га доба експериментального перитоніту відповідає токсичній фазі захворювання, однією з важливих характеристик якої є максимальне пригнічення імунної реактивності організму (Кауфман О.А. и соавт., 1989; Струков А.И. и соавт., 1987; Попов В.А., 1985; Ерюхин И.А., 1989).

Збільшення в подальшому компонентів другої фракції збігається із зростанням активності АУК, що свідчить про поступове відновлення імунних реакції. Токсична фаза перитоніту характеризується розвитком ендотоксикозу, підвищенням всмоктувальної активності очеревини, зниженням дезінтоксикаційної функції печінки (Рейс Б.А. и соавт., 1994; Шкроб Л.О. и соавт., 1992). Саме ці процеси призводять до збільшення в ЛК-спектрі компонентів третьої – четвертої фракції, виникнення яких обумовлено дегенеративно-деструктивними процесами з нагромадженням продуктів розпаду. Початкове підвищення та подальше зниження понадвеликомолекулярних фракцій характеризує зменшення утворення С-реактивного білка у зв’язку з пригніченням імуносинтетичних властивостей купферівських клітин внаслідок токсичної дії продуктів розпаду. Динаміка змін біохімічних показників, активності печінкових ферментів та фагоцитарної активності лейкоцитів також відображають основні етапи розвитку запального процесу й корелює з даними ЛКС-метрії.

Під час ЛКС-метрії змивів перитонеального ексудату спостерігалось зростання відсоткового внеску частинок першої–другої фракційних груп до 2-ї доби експерименту, третя–четверта фракції мали характеристики, схожі з характеристиками сироватки крові, стабільна динаміка зростання показників відзначається в п'ятій фракційній групі.

Ці зміни пов’язані з тим, що перші 3 доби експериментального перитоніту відповідають фазам альтерації й ексудації, основною характеристикою яких є місцевий розвиток катаболічних процесів із вивільненням лізосомальних гідролаз, порушенням обміну речовин у сполучній тканині, в зв’язку з чим відбувається деполімеризація білково-глікозаміногліканових комплексів, розщеплення пептидних зв'язків, зростання низько- та понаднизькомолекулярних компонентів. Зростання п'ятої фракційної групи в ЛК-спектрі свідчить про активацію репаративних процесів, що характеризують початок проліферативної фази запалення.

Суттєвим виявилося паралельне вивчення змін сироватки крові в умовах попереднього цілеспрямованого гальмування імунної системи (в даному разі – при використанні цитостатиків – 6-меркаптопурину та метотрексату).

Сумарний відсотковий внесок у світлорозподіл ЛК-спектра першої–другої фракцій у групі з введенням препарату на фоні та без неї до 7-ї доби знижений, а після починає зростати; у третій–четвертій фракціях від 3-ї до 10-ї доби значення підвищені в обох групах. Показники п’ятої фракції знижені, особливо в порівнянні з ЛК-спектрами сироватки крові при введенні чужорідного антигену. Зазначені зміни відбуваються на фоні гіпопротеїнемії при зниженні показників альбумінової та глобулінової фракцій, більш вираженому у групі з введенням препарату при попередній імунізації (за даними біохімічних досліджень), спостерігається зростання кількості АУК на фоні низьких показників рівня ЦІК.

На підставі цих даних можна припустити, що більш виражений фармакологічний ефект 6-меркаптопурину спостерігається при попередньому введенні ЕБ і призводить до зниження синтезу імуноглобулінів, що підтверджується результатами біохімічних досліджень та ЛКС. Причому, ймовірно, ефект цього препарату є дозозалежним із слабо вираженим ефектом його нагромадження в організмі, що підтверджується поверненням відповідних значень до норми наприкінці експерименту. Високі показники АУК і одночасно з цим низький рівень ЦІК свідчать про вплив на проліферацію АУК, а також на синтетичну фазу імунної відповіді, яка супроводжується зниженням рівню імуноглобулінів класу М та G, порушенням механізмів взаємодії та утворення імунних комплексів, внаслідок чого реєструється зниження їх рівня в сироватці крові.

При застосуванні метотрексату, який є антиметаболітом фолієвої кислоти, в групі з введенням препарату найбільш стабільні характеристики відзначаються в другій фракції, в той час як у групі з попередньою імунізацією знижений рівень цієї фракції на першому тижні збігається зі зростанням показників IV–V фракцій, у подальшому з протилежним напрямком змін.

До 10-ї доби відбувається збільшення понаднизько- і низькомолекулярних частинок, до 14-ї доби значне зниження компонентів першої фракції спостерігається на фоні зростання другої фракції та значно зменшуються показники п'ятої фракції.

За результатами біохімічних досліджень, до п’ятої доби спостерігається гіперпротеїнемія з подальшою гіпопротеїнемією. При оцінці імунологічних показників рівень АУК зменшується після 3-ї доби, рівень ЦІК значно знижений протягом усього експерименту.

Якщо врахувати відповідну динаміку змін ЛК-спектрів то помітно, що одноразове введення метотрексату незначно, але впливає на рівень низькомолекулярних компонентів, і тільки дворазове його використання суттєво пригнічує їх синтез і процес утворення велико- та понадвеликомолекулярних сполук. Зниження відсоткового внеску середньо- і високомолекулярних частинок паралельно з інтенсивним зростанням переважно низько- і понаднизькомолекулярних частинок пов’язане з руйнуванням клітин внаслідок блокування метотрексатом синтезу ДНК і продовженням синтезу РНК і білка (феномен "незбалансованого росту клітин").

Нагромадження в сироватці крові середньо- і високомолекулярних компонентів, скоріше за все гліколіпопротеїдних комплексів, обумовлене інтенсивним розпадом клітин і виходом у міжклітинний простір та сироватку крові продуктів розпаду.

Відомо також, що метотрексат має виражений гепатотоксичний ефект, що в наших дослідженнях підтверджується низькими значеннями перших двох і п’ятої фракцій ЛК-гістограм із відсутністю збільшення росту С-реактивного білка (за даними біохімічних досліджень).

ВИСНОВКИ:

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми що виявляється у вивчені напрямків міжмолекулярних взаємодій, які відбуваються в біологічних рідинах на відповідних проміжках часу, в умовах різних температурних режимів, при розвитку патологічних процесів та залежність макромолекулярного складу біологічних рідин від активації або супресії імунних реакцій, фази запального процесу. Отримані за допомогою методу ЛКС результати свідчать про його інформативність під час спостереження за напрямком патофізіологічних змін, що обумовлюються макромолекулярними змінами сироватки крові та перитонеального ексудату.

1. При аналізі ЛК-спектрів монокомпонентних розчинів складових сироватки крові людини (альбулярних, глобулярних білків) визначено переважний їх вміст у межах першої фракції ЛК-спектра. Підвищення температури до 37?С та подовження експозиції розчинів призводить до збільшення відсоткового внеску великомолекулярних компонентів, що пояснюється агрегаційними змінами й утворенням конгломератів.

2. Іn vitro в реакціях утворення імунних комплексів із використанням сироватки крові здорових людей визначене поступове зростання низько-, понад- і великомолекулярних компонентів спектра переважно протягом першої години експерименту та подальшою стабілізацією відповідного процесу. В дослідах із використанням сироватки крові хворих на інфекційно-запальні захворювання відмічається значно більший відсотковий склад компонентів першої, другої, п’ятої фракцій ЛК-спектра з нагромадженням імуноглобулінів та значним утворенням імунних комплексів.

3. У реакціях формування первинної та вторинної імунної відповіді початкове наростання понадвисокомолекулярних компонентів пов’язане з підвищенням рівня С-реактивного білка, поступове зростання другої, п’ятої фракцій вказує на збільшення вмісту імуноглобулінів та імунних комплексів.

4. Імунодепресивні властивості цитостатиків (6-меркаптопурину та метотрексату) мають виражений зв’язок із попереднєю антигенною стимуляцією та токсичний ефект, який призводить до збільшення відсоткового складу компонентів 3-ї, 4-ї та зниження компонентів 2-ї, 5-ї спектральних субфракцій.

5. При експериментальному перитоніті у сироватці крові зниження рівня частинок із радіусом від 2 до 38 нм та підвищення внеску частинок із радіусом від 38 нм до 96,0 нм відповідає токсичній та термінальній фазам; у перитонеальному ексудаті підвищення перших фракційних груп і збільшення вмісту великомолекулярних компонентів у більш віддалені строки на фоні постійно високого внеску частинок із радіусом від 96,0 до 264,9 нм і більше вказує на значний ступень дегенеративно-деструктивних а, в наступному - проліферативних процесів в черевній порожнині.

6. Встановлено, що перші дві фракційні групи ЛК-спектрів відображують вміст альбумінів та глобулінів. Зниження їх рівня відмічається при ураженні печінки та порушенні її синтетичної й імунної функцій (токсична фаза експериментального перитоніту, імунодепресивні стани, гепатотоксичний ефект лікарських препаратів тощо). Збільшення цих фракцій збігається з активацією імунологічних реакцій після введення антигену.

7. Третя-четверта фракції ЛК-спектру свідчать про нагромадження продуктів розпаду, гліколіпопротеїдів різної щільності тощо. Ці показники збільшуються при активації дегенеративно-деструктивних процесів, нагромадження продуктів розпаду в токсичній і термінальній фазах експериментального перитоніту, меншою мірою – при використанні цитостатичних препаратів. Підвищення їх в перитонеальному ексудаті свідчить про активацію проліферативних процесів.

8. Збільшення вмісту понадвисокомолекулярних компонентів п’ятої та частково великомолекулярної фракцій від 96,0 до 265,0 та більше нм має місце при підвищеному синтезі білків гострої фази (первинна імунна відповідь), а також активації процесів утворення імунних комплексів. Зниження їхнього вмісту пов’язано з порушенням імунної відповіді організму при дії цитостатиків, при гнійно-септичних захворюваннях.

9. Застосування методу ЛКС дозволяло провести інтегральний аналіз молекулярного складу біологічних рідин, стан гуморальної ланки імунної системи при гострому запальному процесі, на фоні антигенної стимуляції та використання цитостатиків, встановити токсичний ефект лікарських засобів.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Бажора Ю.І., Петрашевич Ю.В. Механізми макpомолекуляpних взаємодій в системному гомеостазі при фоpмуванні пеpвинної імунної відповіді в експеpименті // Буковинський мед. вісник. – 2001. – Т. 5. - № 3. – С. 162-166. (Проведення експериментальних досліджень, оформлення статті).

2. Петрашевич Ю.В. Макромолекулярні основи патогенезу неспецифічного перитоніту за даними лазерної кореляційної спектроскопії // Одеський мед. журнал. – 2001. - № 5 . – С. 31-34.

3. Петрашевич Ю.В., Бажора Ю.І., Кресюн В.Й. Механізми змін макpомолекуляpного стану сиpоваткі кpові при уведенні меpкаптопуpину та метотpексату в експеpименті (за даними лазеpної коpеляційної спектpоскопії) // Ліки. – 2002. - № 1-2. – С. 89-93. (Проведення біофізичних та експериментальних досліджень, огляд літератури).

4. Лазерна кореляційна спектроскопія компонентів сироватки крові та продуктів реакції антиген-антитіло in vitro / Ю.І Бажора., Ю.В. Петрашевич, І.А. Міхова, В.Л. Кожаков // Одеський мед. журнал – 2002. - № 3. – С. 8-11. (Проведення експерименту, біофізичних досліджень, оформлення статті).

5. Патент 41677А України, МПК А61В10/00, А61N5/06. Спосіб виявлення токсичних доз фармакологічного препарату в експерименті / Ю.І. Бажора, В.Й. Кресюн, В.В. Годован, Ю.В. Петрашевич – Рішення про встановлення дати подання заявки на винахід (корисну модель) № 20001010309; Заявлено 15.01.2001 р.; Дата прийняття рішення про видачу деклараційного патенту від 01.06. 2001.; Опубл. 17.12.2001 р. – Бюл. № 11. – 2 с. (Проведення експерименту, оформлення патенту)

6. Патент 43514А України, МПК А61В5/145, А61N5/067. Спосіб експрес-діагностики стану гомеостазу при неспецифічному перитоніті в експерименті / Ю.І. Бажора, Л.А. Носкін, Ю.В. Петрашевич – Рішення про встановлення дати подання заявки на винахід (корисну модель) № 2000126965; Заявлено 05.12.2000 р.; Дата прийняття рішення про видачу деклараційного патенту від 24.06.2001.; Опубл. 17.12.2001 р. – Бюл. № 11. – 2 с. (Проведення експериментальних досліджень)

АНОТАЦІЯ

Петрашевич Ю.В. Патофізіологічні аспекти макромолекулярних змін сироватки крові при формуванні імунної відповіді. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. – Одеський державний медичний університет МОЗ України. – Одеса, 2003.

Дисертація присвячена вивченню макромолекулярного складу біологічних речовин із врахуванням біофізичних характеристик їх компонентів та встановленню напрямку їх змін при патологічних станах, що супроводжуються підвищенням активності або супресією імунологічних реакцій.

При попередньому дослідженні основних фракцій сироватки крові (альбуміну, глобуліну, протромбіну) за допомогою ЛКС встановлений їх біофізичний радіус (в середньому близько 5,8 нм) та відношення до першої фракційної групи ЛК-спектра. Показано, що при підвищені температури та часу експозиції в ЛК-спектрі зростає рівень велико молекулярних фракцій за рахунок утворення конгломератів.

У реакціях взаємодії антигену й антитіла утворення циркулюючих імунних комплексів призводить до зростання в ЛК-спектрі низько- та понадвисокомолуклярних фракцій, у зв’язку зі збільшенням імуноглобулінів та імунних комплексів. Більш високі значення відповідних фракцій спостерігаються при використанні сироватки крові хворих на інфекційно-запальні захворювання (гостра пневмонія та десимінований туберкульоз легень).

При аналізі сироватки крові в експерименті на фоні введення антигену та формування реакцій первинної та вторинної імунної відповідей початкове зростання понадвисокомолекуярної фракції корелює зі зростанням рівня С-реактивного білка, подальше підвищення другої та п’ятої фракцій у спектрі характеризує нагромадження рівня імуноглобулінів та розчинних імунних комплексів. У той же час використання цитостатичних препаратів обумовлюється зниженням показників відповідних фракцій. В експерименті з дослідженням сироватки крові та черевного ексудату при експериментальному перитоніті накопичення токсичних продуктів розпаду обумовлює зростання значень третьої-четвертої фракцій, пригнічення імунологічних реакцій характеризується зменшенням відсоткового внеску низько- та понадвисокомолекулярних компонентів.

Ключові слова: макромолекули, імуноглобуліни, перитоніт, імунна відповідь, цитостатики, імунні комплекси.

АННОТАЦИЯ

Петрашевич Ю. В. Патофизиологические аспекты макромолекулярных изменений сыворотки крови при формировании иммунного ответа. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология – Одесский государственный медицинский университет, МОЗ Украины, Одесса, 2003 г.

Диссертация посвящена изучению биофизических характеристик и межмолекулярных взаимодействий компонентов биологических жидкостей, определению направлений их изменений при соответствующих патологических процессах и определению влияния иммунных реакций на их макромолекулярный состав.

Моделирование определенных патологических процессов проводилось на крысах-самцах линии Вистар (365 шт.), в опытах in vitro использовали фракции альбумина, глобулина, протромбина, моноспецифическую сыворотку против иммуноглобулина М, а так же, сыворотку здоровых людей (контроль) и больных инфекционно-воспалительными заболеваниями (острая пневмония, диссеминированный туберкулез легких).

В результате предварительного изучения спектральных характеристик монокомпонентных растворов альбумина, глобулина, протромбина установлено расположение их в пределах первой фракции ЛК-спектра, что соответствует частицам с биофизическим радиусом от 2,0 до 11,0 нм.

При изучении сдвигов в спектре ЛК-гистограмм в реакциях взаимодействия антигена с антителом с использованием моноспецифической сыворотки против иммуноглобулина М и контрольной сыворотки определяется нарастание компонентов низкомолекулярной фракции с последующим увеличением высоко- и сверхвысокомолекулярных частиц, что связано с повышением уровня иммуноглобулинов и, соответственно, активирует процессы образования иммунных комплексов. Причем, при использовании сыворотки крови больных инфекционно-воспалительными заболеваниями, в данном случае острой пневмонией и диссеминированным туберкулезом легких, на фоне изначально более высоких показателей низко- и высокомолекулярных фракций, в дальнейшем отмечается значительно более существенный процентный вклад соответствующих частиц, что объясняется повышенной активностью иммунных реакций при соответствующих патологиях.

Аналогичная динамика изменений спектральных характеристик сыворотки крови отмечалась в реакциях in vivo при моделировании реакций первичного и вторичного иммунных ответов. Особенностью явилось более раннее (вторые, третьи сутки после первичного введения антигена) увеличение компонентов пятой фракции, что связанно с ростом уровня С-реактивного белка (задействованы иммунологические свойства печени), и лишь с 10 суток показатели соответствующей фракции указывают на рост уровня иммунных комплексов. По данным биохимических и иммунологических исследований так же отмечается рост этих показателей.

В состоянии супрессии иммунной системы в связи с использованием цитостатических препаратов (6-меркаптопурина и метотрексата) на фоне предварительного введения антигена отсутствует рост показателей второй, пятой фракций и повышен процентный вклад частиц с радиусом от 37 до 264 нм, причем, соответствующие характеристики слабо выражены при введении препарата без предварительного использования антигена. Учитывая результаты биохимических и иммунологических исследований, а так же данные литературы, доказано, что соответствующие изменения спектрального состава сыворотки крови связаны с угнетением процессов синтеза иммуноглобулинов, образования иммунных комплексов, снижением иммунологических свойств