НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

Крисько Андрій Арнольдович

УДК 577.32’17.012:543.422.25

СИНТЕЗ І ВЛАСТИВОСТІ ІНГІБІТОРІВ АГРЕГАЦІЇ ТРОМБОЦИТІВ

02.00.10 – біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса – 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в | Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського

Національної академії наук України

Науковий керівник: | академік НАН України, доктор хімічних наук, професор Андронаті Сергій Андрійович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, директор, завідувач відділу.

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

Вовк Андрій Іванович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, в.о. заступника директора

кандидат хімічних наук

Басок Степан Степанович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, старший науковий співробітник

Провідна установа: | Київський національний університет ім. Тараса

Шевченка МОіН Украіни, кафедра органічної хімії, м. Київ.

Захист відбудеться “ 18”січня 2001 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 при Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України (65080, Одеса, Люстдорфська дорога, 86. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України (65080, Одеса, Люстдорфська дорога, 86. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського).

Автореферат розісланий “ 15 ” грудня 2000 р.

Вчений секретарспеціалізованої вченої ради

к. х. н. | Л.О. Литвинова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Пошук нових антитромботичних і антиагрегаційних засобів, які мають високу ефективність і низьку токсичність, є однією з найважливіших задач біоорганічної та медичної хімії. З кожним роком з'являється все більше публікацій щодо створення лікарських засобів, які впливають на різні етапи тромбоутворення. Це зумовлено відсутністю досить ефективних і безпечних препаратів для лікування захворювань серцево-судинної системи. Тому найвідоміші фармацевтичні компанії світу проводять розробку нових сполук як потенційних лікарських засобів даного класу.

Відомо, що тромбоцити крові людини відіграють важливу роль не тільки в нормальному гемостазі, а й в артеріальних тромбозах, які ведуть до таких захворювань, як інфаркт міокарда, інсульт та ін. Успіхи у рішенні медико-біологічних проблем тромбоутворення і боротьби з ним, безсумнівно, дозволять підвищити ефективність профілактики і терапії багатьох найтяжчих і небезпечних недугів.

В наш час відомо багато антиагрегантів, які за механізмом їх дії підрозділяються на кілька груп. Одні пов’язані з впливом на метаболізм арахідонової кислоти, другі – з АДФ-залежним шляхом агрегації, треті – з інгібуванням фактора активації тромбоцитів. Проте, існує широкий ряд сполук різноманітної структури, механізм дії яких до теперішнього моменту не виявлений в достатній мірі. Великий інтерес викликають азотовмісні гетероцикли як потенційні антиагреганти. Високоактивні сполуки були знайдені серед представників бенздіазепінового ряду, похідних імідазохіноліну, піридину, ізоксазолону, піперидин-3-карбоксамідів, тощо.

Останнім часом окремо розглядається група сполук, котрі є антагоністами фібриногенових рецепторів. Відповідальною за зв’язування фібриногену з його рецепторами є трипептидна RGD (Arg-Gly-Asp) послідовність. Невеликі білки і пептиди, що містять RGD-послідовність, є антагоністами фібриногенових рецепторів, тому для запобігання агрегації тромбоцитів можливе використання природних RGD-пептидів. Проте, недоліками таких пептидів є низька селективність і схильність до біодеградації. Молекулярний дизайн потенційних антагоністів фібриногенових рецепторів з метою підвищення афінітету і селективності включає моделювання структур, що містять RGD-послідовність або імітують її фрагменти.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною досліджень Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за темою № 234 (№ державної реєстрації 0100V001145) та міжнародної програми РЕСО-94 (BIOMED, Проект № ERВCIPDCT 940247).

Мета і задачі дослідження. Мета дисертації – синтез, вивчення властивостей і молекулярного механізму дії антиагрегаційних засобів в рядах похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону і RGD-міметиків.

В зв’язку з метою роботи були поставлені такі задачі:

1. Синтез похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, вивчення зв’язку “структура-активність”.

2. Синтез нового RGD-міметика – 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну, який імітує RGD-послідовність фібриногену.

3. Синтез модельного RGD-міметика – 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирил-гліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну.

4. Оптимізація схеми синтезу і одержання нових RGD-міметиків на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти в якості Arg-міметика.

5. Вивчення молекулярного механізму дії ряду синтезованих RGD-міметиків.

Наукова новизна одержаних результатів. Синтезований ряд похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, антиагрегаціний ефект котрих перевищує ефект ацетилсаліцилової кислоти.

Вперше показана можливість застосування залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти як Arg-міметика для одержання RGD-міметиків.

За двома альтернативними схемами синтезований ряд нових RGD-міметиків на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти, які мають в дослідах in vitro високу антиагрегаційну активність і є антагоністами фібриногенових рецепторів.

Синтезовані нові “проліки” - похідні RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну. Показано, що в дослідах ex vivo метиловий ефір 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну має високу антиагрегаційну активність.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментальні результати свідчать про перспективність пошуку антиагрегантів в рядах похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, які є потенційними антиагрегантами. Залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти може використовуватися як замінник залишку аргініну для створення нових RGD-міметиків, перспективних сполук з високою антиагрегаційною активністю, котрі можуть бути застосованими в медицині для профілактики і лікування різноманітних захворювань серцево-судинної системи.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно синтезовані нові похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону і ряд нових RGD-міметиків, а також “проліки” на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти, інтерпретовані дані спектрів 1Н ЯМР, мас спектрів. У співавторстві виконані дослідження впливу одержаних RGD-міметиків на зв’язування FITC-фібриногену з рецепторами на тромбоцитах, аналіз одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на міжнародному симпозіумі “23-rd European Peptide Symposium” (Брага, Португалія, 1994), IX конференції з органічної та біоорганічної хімії молодих вчених (Прага, Чехія, 1995), XVIII Українській конференції з органічної хімії (Дніпропетровськ, Україна, 1998), І конференції молодих вчених і студентів-хіміків південного регіону України (Одеса, Україна, 1998), V національному з'їзді фармацевтів України (Харків, Україна, 1999), міжнародній конференції “The Second Multidisciplinary Conference on Drug Research” (Єленя гура, Польща, 2000), науково-практичному семінарі “Природні біологічно активні речовини і їх синтетичні аналоги” (Гурзуф, Україна, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у фахових журналах і тези 8 доповідей на українських і міжнародних конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 127 стор. машинописного тексту і складається із вступу, трьох розділів, висновків, містить 18 таблиць, 17 рисунків. Список використаних джерел включає 120 найменувань. Перший розділ являє собою огляд літератури, в якому описано сполуки непептидної природи – інгібітори агрегації тромбоцитів, викладено підходи до дизайну і синтезу RGD-міметиків, описано їх фармакологічні властивості і застосування в медицині, а також подано сучасні уявлення про молекулярний механізм антиагрегаційної дії RGD-міметиків.

У другому розділі описано синтез похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, нового RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну, модельного RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну, наведено спект-ральні підтвердження будови одержаних речовин, особливості їх розпаду під електронним ударом, описані антиагрегаційні властивості і вплив RGD-міметиків на зв’язування FITC-фібриногену з рецептором на тромбоцитах.

Третій розділ містить методики синтезу одержаних сполук.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Пошук потенційних інгібіторів агрегації тромбоцитів в ряді похідних
3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону

Знайдено велику кількість інгібіторів агрегації тромбоцитів серед сполук, що належать до класу азотвмісних гетероціклів. Високоактивні антиагреганти виявлено в ряді похідних піридину, піперазину, хіназоліну, 1,4-бенздіазепину, триазолобенздіазепінів та інших класів сполук.

З метою пошуку ефективних антиагрегантів серед похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону нами синтезовані сполуки 1 – 13.

Для отримання 1-незаміщеного-3-амінопіперидин-2,6-діону (сполука 1) ми застосували реакцію циклізації п-нітрофенілового ефіру Boc-Gln (Boc-Gln-ONp) в присутності триетиламіну, представлену на схемі 1.

Схема 1

Синтез 1-(піридилзаміщених)-3-амінопіперидин-2,6-діонів і 3-аміно-піролідин-2,5-діонів базується на утворенні циклічних ангідридів N-за-хищених дикарбонових амінокислот з наступною реакцією їх з 2-, 3- і 4-амі-нопіридинами (схема 2). Для отримання сполук 5 і 6 як вихідну сполуку застосовували Boc-Asp-OH. Схема синтезу при цьому лишається незмінною.

Схема 2

Синтез сполук 12 і 13 здійснювався за методом активованих ефірів шляхом конденсації 1-(піридин-2-іл)-3-амінопіперидин-2,6-діону з Вос-похідними п’ятичленних циклічних амінокислот в присутності триетиламіну (схема 3).

Схема 3

Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методу ТШХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії 1Н-ЯМР.

Була досліджена антиагрегаційна активність тринадцяти сполук – похідних піперидину (1 - 4, 7 - 9, 12, 13) і піролідину (10, 11), в тому числі сполук, що містять Вос-групу (2 - 4) і залишки циклічних амінокислот. Як свідчать дані, наведені у табл. 1, всі одержані сполуки різною мірою, залежно від структури, інгібували агрегацію тромбоцитів, викликану АДФ у багатій на тромбоцити плазмі крові щурів. Величини ІС50 варіюють в межах від 3.6.10-4 М до 26.5.10-4 М. Слід відмітити, що майже всі вивчені сполуки цієї серії за антиагрегаційною активністю перевищували ацетилсаліцилову кислоту.

Таблиця 1.

Похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону і показники їх антиагрегаційної активності.

№№
сполук | Структура | R1 | R2 | n | m | IC50 (10-4 M)

1 | H | H | 1 | 2 | 26.5 0.65

2 | Boc | піридил-2 | 0 | 2 | 6.6 0.51

3 | Boc | піридил-3 | 0 | 2 | 8.2 0.49

4 | Boc | піридил-4 | 0 | 2 | -

5 | Boc | піридил-2 | 0 | 1 | -

6 | Boc | піридил-3 | 0 | 1 | 8.9 0.70

7 | H | піридил-2 | 2 | 2 | 3.6 0.25

8 | H | піридил-3 | 2 | 2 | 7.0 0.47

9 | H | піридил-4 | 2 | 2 | 9.5 0.61

10 | H | піридил-2 | 2 | 1 | 8.0 0.72

11 | H | піридил-3 | 2 | 1 | 8.0 0.68

12 | Pro | піридил-2 | 2 | 2 | 10.0 0.93

13 | Thz | піридил-2 | 2 | 2 | 25.6 1.70

Аналізуючи вплив структури на антиагрегаційну активність одержаних сполук, ми встановили, що ефект 3-амінопіперидин-2,6-діону (1) знаходиться на рівні ефекту ацетилсаліцилової кислоти. Введення ж замісників у положення 1 й ацилювання аміногруп як похідних піперидину 1 - 4, 7 - 9, 12 і 13, так і похідних піролідину 10, 11, підвищує їх антиагрегаційну активність. Очевидно, що найбільшій внесок у підвищення активності робить залишок піридину в першому положенні, тому що наявність в третьому положенні захисної Вос-групи або залишків циклічних амінокислот не впливала суттєво на активність даних сполук, так само як і повна відсутність замісників у положенні 3.

Одержані результати вказують на перспективність пошуку сполук з антиагрегаційними властивостями серед похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону.

Синтез RGDF-пептидоміметика -
4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирил-гліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну

Даний розділ роботи присвячено синтезу нової сполуки - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну (14), яка є модель-ним пептидоміметиком, що імітує RGDF-послідовність фібриногену. В цьому пептидоміметику перший амінокислотний залишок (R) було замінено на його міметик 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутаноїл (PS) (Рис. 1). Решту амінокислотних залишків не заміняли.

Рис. 1. RGDF-пептид і його міметик - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирил-гліцил-L-аспартил-L-фенілаланін (14).

Жорсткість 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутаноїлу як можливого Arg-подібного фрагменту більша, ніж у залишку 4-(піперидин-1-іл)бутанової кислоти, і менша, ніж у амінобензамідину. Останні успішно використовують-ся для дизайну RGD-міметиків (рис 2).

Рис. 2. Структури залишків аргініну і його міметіків.

Як вихідну сполуку використовували 1-Вос-піперазин, який ацилювали ангідридом янтарної кислоти. В результаті була одержана 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанова кислота (15), котра стала основою для будування Arg-імітуючої частини. Su-Ефір 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанової кислоти (16) одержували двома способами. Перший базувався на використанні DCCI і SuOH, другий – на використані реагенту Сакакібари (TfaOSu). Цей реагент одержували реакцією між трифтороцтовим ангідридом і SuOH.

Далі для отримання блоку, що імітує аргінілгліцил (Схема 4), проводили реакцію між натрієвою сіллю гліцину і ефіром 16. В результаті був синтезований 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцин (17). Сполу-ка 17, реагуючи з DCCI і SuOH, давала сукцинімідний ефір 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцину (18).

Будування другого блоку починалося з конденсації BocAsp(OBzl)OH з TsOH.HPheOBzl за DCCI-методом з добавкою BtOH. Видалення бензилових захисних груп проводили гідрогенолізом, що приводило до BocAspPheOH (20) з виходом 77 %. Як каталізатор застосовували 3 % паладій на активованому вугіллі. Останнім етапом при одержанні другого блоку, НСl.НAspPheOH (21) було ацидолітичне розщеплення Вос-захисту.

Схема 4

Реакція між сполуками 18 і 21 приводила до утворення 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну (22). Заключна стадія синтезу цільового пептидоміметика – гідрохлориду 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну (14) – ацидолі-тичне розщеплення Вос-групи 4 н розчином HCl в діоксані ([]25D = -17.52 (c = 1, H2О)).

Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії 1Н-ЯМР.

Синтез і антиагрегаційна активність нового RGD-міметика

Метою дослідження, викладеного в даному розділі, був синтез нової сполуки, яка б імітувала RGD-послідовність фібриногену. Як Arg-міметик був застосований залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти. Аспарагінову частину імітували залишком D,L--феніл--аланіну, якій має в своєму складі гідрофобний фенільний радикал, що необхідно для забезпечення здатності сполуки інгібувати агрегацію тромбоцитів, а також зв’язування фібриногену з GP IIb/IIIa рецептором.

Виходячи з вищенаведених уявлень, ми синтезували високоактивний RGD-міметик - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланін (23) на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти і D,L--феніл--аланіну. Синтез пептидоміметика 23 подано на схемі 5.

Як вихідну використовували сполуку 15, яку дією DCCI і PfpOH переводили у відповідний Pfp-ефір (24), що був першим блоком для створення заданого пептидоміметика.

Будування другого блоку починалося з синтезу D,L--феніл--аланіну, котрий був отриманий за стандартним методом Родіонова. Далі дією хлористого тіонілу на суспензію -амінокислоти в метанолі був одержаний гідрохлорид метилового ефіру (25), конденсація якого з Вос-GlyOH за стандартним DCCI-методом з добавкою BtOH приводила до утворення дипептиду – Вос-гліцил-D,L--феніл--аланіну (26). Видалення Вос-групи (без виділення проміжного гідрохлориду) і реакція з 25 привели до утворення метилового ефіру 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (27), омилення складноефірної групи якого давало відповідну кислоту 28. Останню стадію отримання пептидоміметика 23 проводили за стандартною методикою видалення Вос-групи 4 Н розчином HCl в діоксані.

Схема 5

Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії 1Н-ЯМР.

Оптимізація схеми синтезу і одержання нових RGD-міметиків

Схема 5, запропонована для синтезу пептидоміметика 23, складається з 6 стадій і описує досить складний і трудомісткий процес. В зв’язку з цим, ми поставили собі мету оптимізувати існуючу схему синтезу. Нову оптимізовану схему ми застосували для одержання нових аналогів пептидоміметика 23 для дослідження впливу замісників на здатність сполук інгібувати агрегацію тромбоцитів, а також зв’язування фібриногену з GP IIb/IIIa рецепторами.

Синтез вихідних сполук. Необхідні вихідні D,L-?-арил-?-аланіни 29 – 34 були синтезовані за реакцією Родіонова з відповідних п-заміщених бензальдегідів (схема 6).

Схема 6

Спроба розділення енантіомерів D,L-?-арил-?-амінокислот за допомогою дробної кристалізації виявилася невдалою. З цієї причини L-3-аміно-3-фенілпропіонова кислота (L-) (35) нами була синтезована з L-2-аміно-2-фенілоцтової кислоти (L-фенілгліцін) за реакцією Арндта-Естерта (Схема 7).

Схема 7

Аміногрупу вихідного L-фенілгліцину блокували Вос-захисною групою, для введення якої застосовували Вос2О, в результаті чого отримували сполуку 36. Далі Вос-похідне 36 дією ізо-бутилхлорформіату перетворювали на змішаний ангідрид 37. Наступним етапом синтезу була конденсація ангідриду 37 з діазометаном, в результаті чого одержували діазокетон 38. Діазокетон 38 розкладали до Вос-L-?-феніл-?-аланіну (39) у водно-органічному середовищі, оксид срібла використовували як каталізатор. Ацидолітичне деблокування захисної групи давало гідрохлорид L-?-феніл-?-аланіну (35) з кількісним виходом ([]20D = - 2.7 (c = 1, H2O)).

Застосування альтернативної схеми синтезу для одержання 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну і його аналогів. В результаті ацилювання янтарним або глутаровим ангідридами 1-Вос-піперазину отримані, відповідно, 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанова (15), вже описана вище, і 5-оксо-5-(4-Вос-піперазин-1-іл)пентанова (40) кислоти. Далі кислоти 15 і 40 перетворювали на активовані ефіри: Pfp- (24) і Su- (16) і (41) (Схема 8).

Схема 8

Таблиця 2

RGD-пептидоміметики.

№№
сполук | Структура | R | n | m

23 | Ph | 1 | 1

57 | п-F-C6H4 | 1 | 1

58 | п-Cl-C6H4 | 1 | 1

59 | п-MeO-C6H4 | 1 | 1

60 | м, п-(MeO)2-C6H4 | 1 | 1

61 | 1 | 1

62 | (L) Ph | 1 | 1

63 | (L) Me | 1 | 1

65 | H | 1 | 1

66 | (L) Ph | 1 | 0

67 | (D) Ph | 1 | 0

68 | Ph | 2 | 1

69 | п-MeO-C6H4 | 2 | 1

70 | (L) Ph | 2 | 0

71 | (D) Ph | 2 | 0

Реакція між активованими ефірами 24 або 16, або 41, і натрієвою сіллю гліцину давала 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутаноїл- (17), і 5-оксо-5-(4-Вос-піперазин-1-іл)пентаноїл- (42) похідні гліцину. Проте, похідні 17 і 42 можна одержувати без виділення активованих ефірів 24, 16 і 41, що значно простіше в препаративному плані, а також приводить до скорочення числа стадій. Проведення реакцій між активованими ефірами 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутаноїл- або 5-оксо-5-(4-Вос-піперазин-1-іл)пентаноїлгліци-ну, без виділення з реакційної суміші, з ?-аланіном, ?-аріл-?-аланінами і енантіомерами фенілгліцину приводило до отримання Вос-похідних 28, 43-56.

На останній стадії процесу ацидолітичним деблокуванням сполук 28, 43-56 були одержані цільові пептидоміметики 23, 57-71 (таблиця 2).

Сумарний вихід цільового міметика 23, синтезованого за схемою 5, складає 45 %. При застосуванні схеми 8 сумарний вихід складає в середньому 56 %. Крім того, схема 8 простіша в препаративному плані.

Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії 1Н-ЯМР.

Синтез проліків - похідних RGD-пептидоміметиків

Для лікування хронічних захворювань серцево-судинної системи необхідні сполуки з високою антиагрегаційною активністю і відносно тривалим часом напівжиття при їх пероральному введенні. Хоча на активність при пероральному введенні впливає багато факторів, проте основним є обмежене проникнення RGD-міметиків крізь мембрану через наявність заряджених груп і високої полярності. Другим фактором є метаболічна лабільність деяких RGD-міметиків в присутності протеаз і пептитаз. В зв'язку з цим виникає необхідність створення “проліків” найбільш активних RGD-пептидоміметиків для їх перорального застосування.

Цей розділ присвячений синтезу нових “проліків” - похідних RGD-пептидоміметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (23).

Синтез метилового ефіру 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (72) здійснювали за схемою 9:

Схема 9

“Проліку” - Етиловий ефір 4-оксо-4-(4-етоксикарбоніл-піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (73), сполуку з двома ефірними групами на обох кінцях молекули, одержували за схемою 10. Спроба синтезу сполуки 73 за схемою, аналогічною схемі 5, виявилася невдалою через гідроліз етоксикарбонільної групи Su-ефіру 4-оксо-4-(4-етоксикарбоніл-піперазин-1-іл)бутанової кислоти (76) на стадії його конденсації з гліцином у водно-органічному середовищі.

Як вихідну сполуку брали 1-етоксикарбонілпіперазин (74), який ацилювали ангідридом янтарної кислоти. В результаті одержували 4-оксо-4-(4-етоксикарбоніл-піперазин-1-іл)бутанову кислоту (75). Дією DCCI і SuOH на кислоту 75 її переводили у відповідний Su-ефір (76), який був першим блоком для створення заданої сполуки з властивостями “проліків” (схема 10).

Схема 10

Побудова другого блоку починалося з синтезу гідрохлоріду етилового ефіру D,L--феніл--аланіну. Конденсацію етилового ефіру D,L--феніл--аланіну з Boc-GlyOH за стандартним DCCI-методом з додаванням BtOH був одержаний дипептид – етиловий ефір Вос-гліцил-D,L--феніл--аланіну (77). Видалення Вос-групи (без виділення проміжного гідрохлоріду) і реакція з Su-ефіром 76 привели до утворення цільової сполуки 73 з властивостями “проліків”.

Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії та спектрос-копії 1Н-ЯМР.

Антиагрегаційна активність RGD-міметиків на основі -
4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти

Антиагрегаційна активність синтезованої сполуки 23 вивчалася на багатій на тромбоцити плазмі крові щурів за методом Борна. Пептидоміметик 23 інгібував АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів з ІС50 = 8.7.10-9 М. Також було встановлено, що сполука 23 має високу антиагрегаційну активність і у відношенні до тромбоцитів крові людини. Константа напівінгібування агрегації тромбоцитів у багатій на тромбоцити плазмі крові людини дорівнює 3.3.10-8 М.

Щоб з’ясувати молекулярний механізм антиагрегаційної дії пептидоміметика 14, проведено дослідження його впливу на специфічне зв’язування міченого флуоресцеїном фібриногену (FITC-фібриногену) з його рецепторами на суспензії відмитих тромбоцитів людини. Було встановлено, що дана сполука інгібує зв’язування FITC-фібриногену з рецептором GP IIb/IIIa на суспензії відмитих тромбоцитів людини з ІС50 = 2.2.10-8 М. Крива залежності відсотка зв’язування FITC-фібриногену з тромбоцитами людини від логарифму концентрації пептидоміметика наведена на рис. 3.

Рис. 3. Залежність відсотка специфічного зв’язування (SB, %) FITC-фібриногену з GP IIb/IIIa від логарифму концентрації 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (23).

Вивчення антиагрегаційної активності пептидоміметиків 57 і 60 на багатій на тромбоцити плазмі крові людини показало, що введення фтору в пара-положення фенілу залишку ?-амінокислоти призвело до зниження активності (сполука 57, ІС50 = 9.9.10-7 М), а використання залишку D,L--(3,4-диметоксифеніл)--аланіну як міметика Asp-Phe-частини призвело до значного збільшення антиагрегаційної активності (сполука 60, ІС50 = 1.5.10-9 М).

Визначення констант напівінгібування специфічного зв’язування FITC-фібриногену з рецептором GP IIb/IIIa для сполук 14, 59 і 60 показало, що RGD-міметики 14 і 60 інгібують зв’язування в наномолярних концентраціях з ІС50, що дорівнювало 0.9.10-9 М і 0.7.10-9 М, відповідно (рис. 4).

Для сполуки 59 значення ІС50 дорівнювало 3.1.10-8 М, що, очевидно, обумовлено зменшенням ліпофільності сполуки 59 порівняно із сполукою 60.

Одержані експериментальні дані за антиагрегаційною активностю та інгібуванню специфічного зв’язування FITC-фібриногену з його рецепторами на тромбоцитах дають змогу розглядати ряд RGD-міметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти як високоактивні інгібітори агрегації тромбоцитів і антагоністи фібриногенових рецепторів.

Рис. 4. Залежність відсотка специфічного зв’язування (SB, %) FITC-фібриногену з GP IIb/IIIa рецепторами від логарифму концентрації сполук 14 і 60.

Антиагрегаційна активність сполуки 77 при її пероральному введенні була досліджена за гібридним методом на мишах і щурах. Значення ID50 складало 10 мг/кг.

Таким чином, проведені дослідження дозволяють розглядати сполуку 77 як потенційний засіб для перорального застосування, що потребує по дальшого поглибленого дослідження.

ВИСНОВКИ

1. Вперше показано, що залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти може бути використаним для молекулярного дизайну RGDF-міметиків – ефективних інгібіторів агрегації тромбоцитів.

2. Встановлено, що молекулярною мішенню RGDF-міметиків – похідних
4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти, є глікопротеїновий комплекс GP IIb/IIIa.

3. В ряді нових RGD-міметиків виявлено сполуки з високою антиагрегаційною активністю і високим афінітетом до GP IIb/IIIa рецепторів.

4. Показано, що “проліка” - похідна RGD-міметика мають антиагрегаційну активність при пероральному введенні.

5. Показано, що одержані похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-аміно-піролідин-2,5-діону мають антиагрегаційну активність на рівні ацетилсаліцилової кислоти.

6. Запропонована схема синтезу непептидних RGD-міметиків призвела до скорочення кількості стадій і спрощенню процесу їх одержання.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Крысько А.А., Кабанов В.М., Кабанова Т.А., Беликова М.В., Мазепа А.В. Синтез и антиагрегационная активность производных 3-аминопиперидин-2,6-дионов и 3-аминопирролидин-2,5-дионов // Хим.-фарм. журн.- 1997.- Т. 32, № 6.- С. 18-20.

2. Андронати С.А., Крысько А.А., Карасева Т.Л., Кабанов В.М., Кабанова Т.А., Павловский В.И. Синтез и антиагрегационные свойства нового пептидомиметика - 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)-бутирилглицил--фенил--аланина и его метилового эфира как перорально активного пролекарства // Фізіол. акт. речовини. - 1999.- № 2 (28).- С. 6-11.

3. Крысько А.А., Кабанов В.М., Полищук П.Г., Чугунов Б.М., Павловский В.И., Андронати С.А., Мазепа А.В., Карасева Т.Л., Кабанова Т.А., Синтез и антиагрегационная активность нового RGDF-пептидомиметика // ЖОХ.- 2000.- Т. 70, Вып. 6.- С. 1013-1017.

4. Andronati S.A., Kabanov V.M., Karaseva T.L., Korotenko T.I., Mazurov A.A.,
Kabanova T.A. and Krysko A.A. Pseudopeptides with antithrombotic activity. // Peptides 1994, Ed. by Y.L.S. Maia. Proceedings of the Twenty-Third European Peptide Symposium.- ESCOM, Leiden.- 1995.- Р. 383-385.

5. Krysko A., Belikova M. Pseudopeptides based on 3-aminopiperidin-2,6-dione as a novel antiaggregative agents. // Book of Abstracts. IX-th Conference on Organic chemistry and Biochеmistry of Young Scientists. Liblice Castle, Czech.Republic, 9-13 October 1995.- Р. 117-118.

6. Андронаті С.А., Крисько А.А., Кабанова Т.А., Кабанов В.М., Павловський В.І., Карасьова Т.Л., Мазепа О.В., Поліщук П.Г. Синтез нового ефективного RGD-миметика. // XVIII Українська конференція з органічної хімії. Дніпропетровськ, Україна.- 1998.- Ч. 1.- С. 16-17.

7. Андронати С.А., Карасева Т.Л., Кабанова Т.А., Кабанов В.М., Крысько А.А., Павловский В.И., Мазепа А.В. Синтез и биологическая активность новых RGDF-пептидомиметиков на основе 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)-бутановой кислоты // “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”. Матеріали V Національного з’їзду фармацевтів України. - Харків: Золоті сторінки, УкрФа.- 1999.- С. 403-404.

8. Андронати С.А., Карасева Т.Л., Крысько А.А., Кабанова Т.А. Успехи и перспективы в создании синтетических антиагрегационных средств // Там же.- С. 404-405.

9. Andronati S.A., Krysko A.A., Kabanov V.M., Karaseva T.L., Kabanova T.A. Synthesis and properties of peptidomimetics – platelet aggregation inhibitors. // The Second Multidisciplinary Conference on Drug Research, MKNOL-2000.- Jelenja gora - Cieplice (Poland).- 2000.- W-7.

10. Крысько А.А. Дизайн, синтез и свойства ингибиторов агрегации тромбоцитов. // I конференция молодых учёных и студентов - химиков южного региона Украины. Одесса, Украина.- 1998.- С. 23-24.

11. Чугунов Б.М., Крысько А.А. Оптимизация метода получения RGD-псевдопептидов // Там же.- С. 41.

12. Андронати С.А., Крысько А.А., Кабанов В.М., Карасёва Т.Л., Кабанова Т.А. Ингибиторы агрегации тромбоцитов, селективные антагонисты фибриногеновых GP IIb/IIIa рецепторов // Научно-практический семинар. Гурзуф, Украина.- 2000.- С. 3-6.

АНОТАЦІЇ

Крисько А.А. Синтез і властивості інгібіторів агрегації тромбоцитів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10. – біоорганічна хімія. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2001.

Дисертація присвячена синтезу і дослідженню властивостей похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, і RGD-міметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти.

Синтезовані нові похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролі-дин-2,5-діону з антиагрегаційними властивостями.

Запропоновано новий Arg-міметик – залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти для отримання RGD-міметиків. З використанням даного Arg-міметика синтезовано новий модельний RGDF-міметик - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланін.

За двома альтернативним схемам синтезу одержано ряд RGD-міметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти як Arg-міметика і ?-арил-?-аланінів як Asp-Phe-міметиків.

Синтезовані нові похідні RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну, як “проліки” для перорального застосування.

Нові синтезовані RGD-міметики виявили високу антиагрегаційну активність в дослідах in vitro з ІС50 в межах 10-7 – 10-9 М, а також інгібували специфічне зв'язування FITC-фібриногену з його рецептором GP IIb/IIIa на тромбоцитах людини з показниками ІС50 порядку 10-8 – 10-10 М.

Метиловий ефір 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну виявив антиагрегаційну активність при пероральному введенні в дослідах ex vivo з ІD50 = 10 мг/кг.

Ключові слова: піперидин-2,6-діон, піролідин-2,5-діон, RGD-міметики, 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанова кислота, активованих ефірів метод, ?-арил-?-аланіни, “проліки”, фібриноген, GP IIb/IIIa, антиагрегаційна активність.

Крысько А.А. Синтез и свойства ингибиторов агрегации тромбоцитов.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10. – биоорганическая химия. Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2001.

Диссертация посвящена синтезу и изучению свойств производных 3-аминопиперидин-2,6-диона и 3-аминопирролидин-2,5-диона, а также RGD-миметиков – производных 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты.

Синтезированы новые производные 3-аминопиперидин-2,6-диона и 3-аминопирролидин-2,5-диона, обладающие свойствами ингибиторов агрега-ции тромбоцитов. Антиагрегационный эффект синтезированных соединений превосходит эффект ацетилсалициловой кислоты. Показано, что введение остатка пиридина в первое положение пиперидинового либо пирролидино-вого кольца приводит к увеличению антиагрегационной активности полученных производных. Ацилирование аминогруппы в третьем положении также положительно влияло на антиагрегационный эффект.

Впервые предложен для молекулярного дизайна RGD-миметиков остаток 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты в качестве фрагмента, имитирующего остаток аргинина. С использованием данного аргинил-имитирующего фрагмента синтезирован новый модельный RGDF-миметик - 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутирилглицил-L-аспартил-L-фенилаланин, в кото-ром имитировался только остаток аргинина, а остальные аминокислотные остатки не заменялись. Получен также новый RGD-миметик, который содержит два имитирующие фрагменты. При этом остаток аргинина заменён, как и в первом случае, на остаток 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты, а Asp-Phe-участок - на остаток D,L-?-фенил-?-аланина.

Предложены две схемы синтеза RGD-миметиков на основе 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты и ?-арил-?-аланинов. Суммарный выход целевого RGD-миметика - 4-оксо-4-(пиперазин-1-иіл)бутирилглицил-D,L--фенил--аланина, синтезированного по первой схеме составляет 45 %, в то время как использование второй схемы синтеза приводит к увеличению суммарного выхода на 3 % и упрощению выделения промежуточных продуктов.

С целью получения производных RGD-миметика, обладающих повышенной биодоступностью и длительным временем полужизни при их пероральном введении, синтезированы “пролекарства” – производные - 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутирилглицил-D,L--фенил--аланина.

Синтезированные RGD-миметики – производные 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты, в опытах in vitro на богатой тромбоцитами плазме крови животных и человека ингибировали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с IC50 в пределах 10-7 – 10-9 М.

Установлено, что молекулярной мишенью новых RGD-миметиков является гликопротеиновый комплекс GP IIb/IIIa, расположенный на поверхности активированных тромбоцитов человека. Полученные RGD-миметики ингибировали специфическое связывание флуоресцеин-меченного фибриногена с его рецептором GP IIb/IIIa. Значения IC50 в находятся пределах 10-8 – 10-10 М.

В опытах ex vivo на животных новое “пролекарство” – метиловый эфир 4-оксо-4-(пиперазин-1-иіл)бутирилглицил-D,L--фенил--аланина, проявило антиагрегационную активность при пероральном введении с показателем ID50 = 10 мг/кг.

Ключевые слова: пиперидин-2,6-дион, пироллидин-2,5-дион, RGD-миметики, 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановая кислота, активированных эфиров метод, ?-арил-?-аланины, “пролекарства”, фибриноген, GP IIb/IIIa, антиагрегационная активность.

Krysko A.A. Synthesis and properties of platelet aggregation inhibitors. – The manuscript.

Thesis for a candidate's degree in Chemical Sciences on speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. A.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2001.

The dissertation concerns the synthesis and investigation of properties of
3-aminopiperidine-2,6-dione and 3-aminopyrrolidine-2,5-dione derivatives and RGD-mimetics based on 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid.

The novel 3-aminopiperidine-2,6-dione and 3-aminopyrrolidine-2,5-dione derivatives with antiaggregative properties were synthesized. The novel Arg-mimetic – the residue of 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid, was proposed for receiving of RGD-mimetics. The novel model RGDF-mimetic - 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyrylglycyl-L-aspartyl-L-phenylalanine, was synthesized using above mentioned Arg-mimetic. The series of RGD-mimetics on the basis of 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid as Arg-mimetic and -aryl--alanines as Asp-Phe-mimetics was synthesized by two alternative schemes. The novel derivatives of RGD-mimetic - 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyrylglycyl-D,L--phenyl--alanine were synthesized as oral active prodrugs. The synthesized RGD-mimetics showed a high antiaggregatory activity in vitro with IC50 values within 10-7 – 10-9 M. They also inhibited the FITC-fibrinogen specific binding to its receptor GP IIb/IIIa on human platelets with IC50 values of 10-8 – 10-10 M. 4-Oxo-(piperazine-1-yl)butyrylglycyl-D,L--phenyl--alanine methyl ester showed an oral antiaggregatory activity ex vivo with ID50 of 10 mg/kg.

Key words: piperidine-2,6-dione, pirrolidine-2,5-dione, RGD-mimetics,
4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid, activated esters method, -aryl--alanines, prodrugs, fibrinogen, GP IIb/IIIa, antiaggregatory activity.