НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ
ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

Я в о р с ь к а Г а л и н а В а с и л і в н а

УДК 576.852.21:616-036+576.8-097

МІКОБАКТЕРІЇ ТУБЕРКУЛЬОЗУ В СУЧАСНИХ УМОВАХ: БАКТЕРІОЛОГІЯ ТА ІМУНОЛОГІЯ

03.00.07-мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Сибірна Рома Іллінічна

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України;

доктор медичних наук, член-кор. АМН України, професор Чернушенко Катерина Федорівна, завідувач лабораторії імунології Інституту фтизіатрії та пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України.

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України.

Захист відбудеться “16” жовтня 2002 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.233.01. при Інституті мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАНУкраїни (03143, Київ, вул.Заболотного, 154, Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України,зал засідань)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України.

Автореферат розісланий “16” вересня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останнього десятиріччя у всьому світі і в Україні різко погіршується епідеміологічна ситуація з туберкульозу. З 1995 р. у нашій країні визнано епідемію цього захворювання. Дедалі частіше спостерігаються гостропрогресуючі, важкопротікаючі, а часом і невиліковні форми туберкульозу [Москаленко В.Ф., Фещенко Ю.І.,2001]. Найбільше занепокоєння спричиняють хворі, які активно виділяють мікобактерії туберкульозу у навколишнє середовище та зростання кількості форм зі зміненими біологічними особливостями [Березовський Б.А. та ін., 1991; Степашина В.Н. та ін.,2000; Peter C.R.et al.,1998]. Незважаючи на накопичений десятиріччями досвід у боротьбі та профілактиці цього захворювання, туберкульоз і на сьогодні продовжує бути однією з важливих медико-соціальних проблем. На фоні неухильного зростання захворюваності та смертності від цієї недуги все більш актуальним стає питання своєчасного виявлення хвороби та ефективної боротьби з її збудником.

Профілактику та лікування туберкульозу також відносять до числа важливих і важковирішуваних питань. Особлива увага належить зростанню кількості резистентних, до протитуберкульозних препаратів, штамів Mycobacterium tuberculosis [Горохова Г.В.,1997; Корнага С.І.,1998; Степашина В.Н. зі співавт.,2000; De Kantor I.N. et al.,1998]. Крім того, не до кінця з’ясовані особливості поширення туберкульозної інфекції, не завжди своєчасна діагностика і небагаточисельний арсенал засобів лікування [Борисов С.Е.,2001; Жукова М.П.,1998; Матусевич В.Г.,1999; Чернушенко К.Ф.та ін.,2000]. Тому, необхідним вважається подальше вивчення основних біологічних властивостей, визначення особливостей стійкості виділених культур до протитуберкульозних препаратів та встановлення вірулентності.

Значно погіршує ситуацію зниження імунологічної опірності людського організму, яке спостерігається в Україні у результаті надмірного забруднення довкілля [Голышевская В.И.,1997; Музичук Н.Т,2000]. Актуальною є також проблема, направлена на вирішення питання впливу збудника на стан імунної системи макроорганізму.

У зв’язку з цим, подальше, більш детальне, вивчення основних біологічних властивостей мікобактерій туберкульозу, визначення їхнього впливу на стан Т-системи імунітету, яка при туберкульозі відіграє особливе місце, є необхідним для здійснення найбільш раціонального комплексного підходу для діагностики, лікування та профілактики цієї інфекції. Дана проблема є актуальною як для теоретичної, так і для практичної мікробіології і фтизіатрії.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було простежити основні морфологічні, культуральні і цитохімічні особливості виділених культур та характер бактеріовиділення, визначити ступінь вірулентності, встановити закономірності стійкості виділених збудників до основних протитуберкульозних препаратів та розглянути особливості Т-системи імунітету у інфікованих різними групами штамів мікобактерій туберкульозу експериментальних тварин.

Завдання: -порівняти рівень захворюваності на туберкульоз легень з бактеріовиділенням у різних населених пунктах області;

-виявити особливості характеру бактеріовиділення серед хворих на туберкульоз легень різного часу виявлення і клінічної форми патологічного процесу;

-проаналізувати стійкість культур Mycobacterium tuberculosis до основних протитуберкульозних препаратів та встановити закономірності динаміки резистентних штамів, виділених від хворих, що проживають у різних населених пунктах;

-розглянути основні морфологічні та культуральні особливості виділених збудників, різних за чутливістю до антибактеріальних препаратів;

-визначити життєздатність мікобактерій, які виділяються хворими різними формами туберкульозного процесу та з різним генезом виявлення;

-встановити ступінь вірулентності різних груп штамів Mycobacterium tuberculosis для гвінейських свинок;

-простежити особливості перебігу туберкульозу у тварин різних груп згідно патоморфологічних та гістологічних даних;

-проаналізувати зміни Т-системи імунітету у інфікованих лабораторних тварин.

Об’єкт дослідження: штами Mycobacterium tuberculosis, виділені від хворих на туберкульоз легень.

Предмет дослідження: основні морфологічні, тинкторіальні, культуральні, біохімічні та імунологічні особливості мікобактерій туберкульозу, виділених в сучасних умовах.

Методи дослідження: мікробіологічні – для ідентифікації культур, оцінки морфологічних, культуральних та тинкторіальних особливостей виділених збудників, наявності корд-фактору, для вивчення антибіотикочутливості клінічних штамів M.tuberculosis і встановлення ступеня їх вірулентності для гвінейських свинок; біохімічні – для встановлення життєздатності виділених збудників та визначення активності ферментів; імунологічні – для виявлення впливу різних штамів мікобактерій туберкульозу на показники Т-клітинного імунітету у експериментальних тварин; статистичні – для аналізу та оцінки достовірності отриманих даних.

Наукова новизна одержаних результатів

Уперше розглянуто динаміку стійкості штамів M. tuberculosis, виділених від хворих, що проживають у різних населених пунктах, до основних протитуберкульозних препаратів. Констатовано збільшення кількості полірезистентних культур мікобактерій туберкульозу серед жителів міст.

Уперше проаналізовано основні біологічні властивості виділених культур мікобактерій туберкульозу в сучасних умовах та встановлено характер бактеріовиділення. Виявлено, що серед полірезистентних штамів M. tuberculosis зменшується кількість культур з активністю всіх досліджених ферментів, крім глюкозодегідрогенази. Морфологічні, культуральні і тинкторіальні особливості мікобактерій залишаються незмінними.

Встановлено, що полірезистентні (крім стійкості до ізоніазиду) штами M.tuberculosis є високовірулентними для гвінейських свинок. Продемонстровано зв’язок між стійкістю до ізоніазиду і послабленням вірулентності мікобактерій туберкульозу.

Показано зміни стану клітинного імунітету при туберкульозі у інфікованих різними штамами мікобактерій експериментальних тварин. Отримано експериментальне підтвердження про особливості перебігу туберкульозу, викликаного полірезистентними штамами M. tuberculosis.

Практичне значення одержаних результатів

Збільшення кількості полірезистентних культур мікобактерій туберкульозу серед жителів міст вказує на необхідність належного контролю за призначенням хіміотерапії.

У лабораторну діагностику впроваджено цитохімічний метод визначення життєздатності збудника, що значно пришвидшує перевірку впливу призначених препаратів на мікобактерії.

Одержані дані про наявність ферментів, серед різних за чутливістю до протитуберкульозних препаратів груп мікобактерій туберкульозу, розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про взаємозв’язки між ферментативною активністю та резистентністю і є підставою для цілеспрямованого пошуку ензимів, здатних бути попереднім показником полірезистентності культури. Рекомендовано визначення активності ферментів при дослідженні стійких, до протитуберкульозних препаратів, культур мікобактерій.

Встановлені особливості впливу на стан Т-системи імунітету у експериментальних тварин, інфікованих резистентними культурами мікобактерій туберкульозу, є додатковим критерієм для оцінки стану імунної системи при даному патологічному процесі.

Впровадження результатів дослідження в практику. Матеріали дисертації отримали практичне застосування у лабораторіях Волинського, Івано-Франківського та Львівського обласних фтизіопульмонологічних центрів, а також у лекційних курсах Львівського національного університету. Вони можуть широко використовуватися у наукових дослідженнях та у фтизіатричній практиці.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження відображені у дисертаційній роботі є частиною державної науково-дослідної роботи: Н-3-99 “Визначити роль вогнищ туберкульозної інфекції в зростанні епідемії туберкульозу та розробити заходи з метою зниження захворюваності серед контактних осіб” (№ державної реєстрації 0199V000151) відділу туберкульозу та неспецифічних захворювань легень Львівського науково-дослідного іституту епідеміології та гігієни.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з обраної теми, проведено мікробіологічні, біохімічні та цитохімічні дослідження мікобактерій туберкульозу, статистичний аналіз матеріалу.Виявлені закономірності сформульовано у висновках роботи і практичних рекомендаціях, підготовлено відповідні матеріали до друку.У плануванні основних напрямків дослідження, імунологічних, гістологічних та патоморфологічних дослідженнях, обговоренні отриманих результатів брали участь науковий керівник і співробітники імунологічної лабораторії відділу туберкульозу та неспецифічних захворювань легень Львівського науково-дослідного іституту епідеміології та гігієни, де виконувались експериментальні дослідження. Особлива подяка науковому керівнику д.б.н., проф. Р.І.Сибірній за дієву допомогу та підтримку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Екологія і здоров’я дітей” (Чернівці,1999), IV Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль,2000), звітній науковій конференції Львівського національного університету ім.І.Франка (Львів,2000), ІІ(ІХ) установчому з’їзді мікробіологів України (Чернігів,2000), V Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль,2001), науковому семінарі кафедри мікробіології Львівського національного університету ім.І.Франка (Львів,2001).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 10 друкованих робіт, з них 8 статей в наукових журналах і збірниках та тези 2 доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 125 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, підсумку, висновків та списку літератури, що нараховує 245 джерел (134-з країн СНД і 111-інших країн). Робота містить 24 таблиці та 16 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається із двох розділів, в яких висвітлено сучасні уявлення про проблему епідемії туберкульозу, основні фактори, що впливають на його поширення. Детально описано сучасний стан методів діагностики захворювання та перспективи їх розвитку; розглянуто основні біологічні особливості збудника і значення стану імунологічної реактивності організму на даний інфекційний агент.

Матеріали і методи. Проведено аналіз бактеріологічних досліджень 3056 хворих на туберкульоз легень з бактеріовиділенням за 1996-2000 рр. Під час обстеження проводили дослідження мокроти, промивних вод бронхів, пунктатів, ексудатів та вмісту плевральної порожнини хворих. Дослідження in vitro проводили із 437 штамами Mycobacterium tuberculosis, виділеними від хворих.

Для вивчення морфологічних і культуральних особливостей мікобактерій туберкульозу, тривалості і масивності бактеріовиділення, виявлення корд-фактору використовували методи фарбування мазків за Грамом і Ціль-Нільсеном та посів патологічного матеріалу. Чутливість 1429 штамів Mycobacterium tuberculosis до стрептоміцину, ізоніазиду, канаміцину, рифампіцину, етамбутолу та парааміносаліцилової кислоти визначали методом абсолютних концентрацій на твердих поживних середовищах згідно з наказом № 558 МОЗ СРСР [1978]. Полірезистентними вважали штами стійкі до трьох і більше протитуберкульозних препаратів.

Визначення каталазної, пероксидазної, нітратредуктазної і амідазної активності виділених культур мікобактерій проводили також згідно з наказом № 558 МОЗ СРСР [1978]. Визначення дегідрогеназної активності проводили за методом Савченко П.Е. [1998].

Дослідження життєздатності мікобактерій проводили цитохімічним методом Lock в модифікації Дихно М.М. з співавт. [1961].

Експериментальні дослідження виконано на 78 гвінейських свинках у віці 3-4 місяців з масою тіла 250-350 г. Тварин заражали музейними (з музею відділення туберкульозу та неспецифічних захворювань легень Львівського науково-дослідного іституту епідеміології та гігієни) штамами Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Mycobacterium вovis Вovinus 8 та культурами, виділеними від хворих. Інфікування тварин проводили внутрішньом’язево трьохтижневими культурами мікобактерій туберкульозу вказаних штамів у дозі 0,01 мг на 1 кг маси тіла тварин. У кожній групі було по 18 гвінейських свинок. Вісім тварин було використано як донорів для отримання гомологічної сироватки. Для вивчення вірулентності штамів та імунологічних досліджень використані тварини були розділені на 5-ть груп: 1-здорові тварини (6 гвінейських свинок); 2-заражені M.tuberculosis H37Rv, чутливими до протитуберкульозних препаратів (18 гвінейських свинок); 3-заражені M.вovis Вovinus 8, чутливими до протитуберкульозних препаратів (18 гвінейських свинок); 4-заражені штамами M.tuberculosis, виділеними від хворих, стійкими до ізоніазиду і стрептоміцину (18 гвінейських свинок); 5-заражені штамами M.tuberculosis, виділеними від хворих, стійкими до трьох і більше протитуберкульозних препаратів (крім стійкості до ізоніазиду)–18 гвінейських свинок. При оцінці ступеня вірулентності використовували три основні показники: тривалість життя тварин; середній індекс ураження внутрішніх органів; висівання мікобактерій при посіві патологічного матеріалу. Індекс ураження вираховували за Tolderlung K. et al. [1967] і Чернушенко К.Ф. з співавт.[1984]. Проводили макроскопічні, патоморфологічні та гістологічні дослідження внутрішніх органів тварин (печінка, селезінка, легені і регіональні лімфовузли). Фіксацію легень, печінки, селезінки та регіонарних лімфовузлів проводили в 10%-ному розчині нейтрального формаліну. Кусочки обезводнювали та заливали парафіном. Зрізи фарбували гематоксилін еозином. Забивали тварин під гексеналовим наркозом. Гексенал вводили внутрішньочеревно з розрахунку 150-200 мг/кг маси.

Для вивчення стану імунітету при розвитку вказаного інфекційного процесу проаналізовані зрушення реакцій клітинного типу у тварин всіх вказаних груп. Кількісні параметри імунокомпетентних Т-лімфоцитів крові експериментальних тварин вивчали за допомогою феномену розеткоутворення. Реакцію спонтанного розеткоутворення проводили за методом Jondal et al [1972]. Для виявлення у периферичній крові специфічно сенсибілізованих лімфоцитів використовували метод розеткоутворення за Gruchaud, Frei в модифікації Вахидової Г.А.[1978] з попереднім завантаженням еритроцитів туберкуліном. Вміст розеткоутворюючих клітин виражали в % до загального числа лімфоцитів.Функціональний стан Т-лімфоцитів визначали у реакції бласттрансформації за методикою Permein G. et al.[1963], Линг Н.Р.[1971]. Як специфічні антигени-стимулятори використовували сухий очищений туберкулін. Як мітоген використовували фітогемаглютинін фірми Reanal (Венгрія). Для визначення відсотку бластів підраховували не менше 500 клітин.

Отримані цифрові значення дослідів піддавали статистичній обробці, використовуючи критерій Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Характеристика бактеріовиділення серед хворих на туберкульоз легень у Львівській області. Проаналізовано вікову, статеву та клінічну структуру і рівень захворюваності на туберкульоз легень з бактеріовиділенням у хворих серед різних районів Львівської області протягом п’яти років. У 994 пацієнтів визначено характер бактеріовиділення.

При аналізі статевої структури виявлено, що більше 70% складають хворі особи чоловічої статі.

Аналіз клінічної структури показав, що перше місце серед пацієнтів з бактеріовиділенням посідають хворі з дисемінованою формою туберкульозу, причому з тенденцією до росту з року в рік.

У віковій структурі обстежених переважають особи віком 30-50-ти р. Відмічено закономірність до зростання кількості осіб даної вікової категорії, які проживають у районах Львівської області. Констатовано, також, збільшення кількості осіб віком до 30-ти р. (з 1996 до 2000 у 1,7 рази, р<0,001), що є несприятливою прогностичною ознакою. Однак у м.Львові, кількість пацієнтів з бактеріовиділенням віком до 30-ти р. зменшується (з 1996 до 2000 у 1,5 рази, р<0,001). Частота серед хворих інших вікових категорій залишається на одному рівні протягом досліджених років. Лише кількість повторно виявлених хворих осіб віком 70-и р., мешканців області, зростає (з 1996 до 2000 у 5,6 рази, р<0,001).

Залежно від місця проживання пацієнтів (табл.1) спостерігається ріст кількості осіб з бактеріовиділенням серед мешканців сільської місцевості, що можливо свідчить про послаблення профілактичних та діагностичних заходів на селі. Серед жителів міст, навпаки, спостерігається тенденція до зниження частоти бактеріовиділювачів.

Таблиця 1

Бактеріовиділення серед хворих на туберкульоз легень протягом 1996-2000 рр. залежно від місця проживання.

Роки | Кількість хворих з бактеріовиділенням | Всього

Жителі сіл | Жителі міст

абс | % | абс | % | абс

1996 | 153 | 33,02,2 | 310 | 67,02,2 | 463

1997 | 183 | 35,22,1 | 337 | 64,82,1 | 520

1998 | 247 | 39,52,0* | 378 | 60,52,0* | 625

1999 | 278 | 42,21,9* | 381 | 57,81,9* | 659

2000 | 335 | 42,51,8* | 454 | 57,51,8* | 789

*-різниця порівняно до 1996р. вірогідна (р<0,001)

Аналіз рівня захворюваності на туберкульоз легень з бактеріовиділенням серед різних районів Львівської області показав високий рівень (більше 20,0 на 100 тис.населення) у Буському, Бродівському, Городоцькому, Жидачівському, Миколаївському, Пустомитівському районах та у місті Львові, а з 1998р. у Мостиському, Перемишлянському, Стрийському, Турківському районах та місті Стрий; з 1999р. у Городоцькому, Сколівському та Яворівському і з 2000 - Жовківському та Золочівському районах. Найнижчий рівень (менше 10,0 на 100 тис.населення) встановлено у Дрогобицькому, Кам’янко-Буському, Самбірському, Сокальському, Старосамбірському районах та у містах Дрогобичі і Червонограді.

Виявилося, що в більшості у населених пунктів з більш забрудненою атмосферою повітря спостерігається вищий рівень захворюваності на туберкульоз з бактеріовиділенням. Однак, дана закономірність не була встановлена для всіх досліджуваних територій. Виходячи з отриманих результатів, можна припустити, що екологічні фактори, поряд з іншими чинниками відіграють певну роль у рості захворюваності на туберкульоз з бактеріовиділенням.

Вивчення тривалості бактеріовиділення показало, що у половині випадків хворі виділяють збудників періодично. Рідше спостерігається постійне бактеріовиділення і ще рідше одноразове.

При визначенні масивності бактеріовиділення встановлено, що превалює незначне бактеріовиділення (більше 50% випадків). Рідше спостерігається помірне і масивне виділення мікобактерій туберкульозу.

Дослідження швидкості росту культур Mycobacterium tuberculosis показало, що найшвидше ростуть культури, виділені від хворих дисемінованою і фіброзно-кавернозною формами туберкульозу (25-27 проти 29-32 діб серед культур, виділених від хворих інфільтративною та іншими формами туберкульозу).

Таким чином, з результатів проведеного аналізу випливає, що, в абсолютних показниках, кількість хворих на туберкульоз легень з бактеріовиділенням зростає з року в рік. Збільшення кількості таких хворих спостерігається, в основному серед населення сільської місцевості і осіб працездатного віку. Обстежені пацієнти виділяють мікобактерії туберкульозу найчастіше періодично, з перевагою незначного бактеріовиділення. Швидкість росту культур Mycobacterium tuberculosis, виділених від хворих, практично не залежить від форми туберкульозного процесу.

Біологічні особливості виділених штамів Mycobacterium tuberculosis. Досліджували динаміку стійкості до основних протитуберкульозних препаратів (стрептоміцину, ізоніазиду, канаміцину, рифампіцину, етамбутолу і парааміносаліцилової кислоти) у 1429 штамів Mycobacterium tuberculosis, виділених від хворих на туберкульоз легень протягом 1994-2000 років. З них 828 культур були стійкими хоча б до одного з досліджуваних препаратів.

В результаті проведених досліджень виявлено тенденцію до зростання кількості стійких штамів щодо всіх досліджених препаратів. При дослідженні стійкості штамів Mycobacterium tuberculosis до різних концентрацій вказаних препаратів було показано, що із всіх стійких до стрептоміцину, канаміцину та рифампіцину переважна більшість були резистентними до високих концентрацій даних препаратів. Серед культур мікобактерій туберкульозу, які виявилися резистентними до ПАСК, ізоніазиду та етамбутолу переважали резистентні до низьких концентрацій даних препаратів у середовищі.

Проводилися дослідження стійкості виділених культур до різної кількості антибактеріальних препаратів в залежності від виділення за місцем проживання. В результаті проведених досліджень показано, що серед культур стійких до 1-2-х протитуберкульозних препаратів (рис.1А), виділених від осіб з сільської місцевості, спостерігається тенденція до їх зменшення (з 1994 до 2000 у 1,9 рази, р<0,001) Однак, серед штамів стійких до 3-х і більше протитуберкульозних препаратів (рис.1Б), виділених від жителів міст, навпаки, йде зростання протягом вказаного часу (з1994 до 2000 у 2,6 рази, р<0,001).

А Б

Рис. 1. Динаміка стійкості штамів Mycobacterium tuberculosis до 1-2-х (А) і до 3-х і більше (Б) протитуберкульозних препаратів (І- виділених від жителів сіл, ІІ- виділених від жителів міст).

Таблиця 2

Чутливість культур мікобактерій туберкульозу до протитуберкульозних препаратів.

Роки | Кількість досліджених штамів

чутливих до препаратів | стійких до препаратів

від жителів сіл | від жителів міст | від жителів сіл | від жителів міст

абс | % | абс | % | абс | % | абс | %

1994 | 65 | 19,62,2 | 10 | 33,12,6 | 77 | 23,22,3 | 80 | 24,12,3

всього | 175 | 52,72,7 | 157 | 47,32,7

1995 | 47 | 25,53,2 | 55 | 29,93,4 | 37 | 20,13,0 | 45 | 24,53,2

всього | 102 | 55,43,7 | 82 | 44,63,7

1996 | 41 | 19,62,7 | 42 | 20,12,8 | 58 | 27,83,1 | 68 | 32,53,2

всього | 83 | 39,73,4* | 126 | 60,33,4*

1997 | 15 | 13,33,2 | 15 | 13,33,2 | 38 | 33,64,4 | 45 | 39,84,6*

всього | 30 | 26,64,2* | 83 | 73,44,2*

1998 | 62 | 19,92,3 | 72 | 23,12,4 | 68 | 21,82,3 | 110 | 35,22,7*

всього | 134 | 43,02,8* | 178 | 57,02,8*

1999 | 4 | 3,52,7 | 14 | 12,23,1 | 35 | 30,44,3 | 62 | 53,94,6*

всього | 18 | 15,73,4* | 97 | 84,33,4*

2000 | 26 | 15,92,9 | 33 | 20,13,1 | 45 | 27,43,5 | 60 | 36,63,8*

всього | 59 | 36,03,7* | 105 | 64,03,7*

*-різниця порівняно до 1994р. вірогідна (р<0,001)

В загальному (табл.2) серед досліджених культур виявлено тенденцію до зменшення кількості чутливих (з 1994 до 2000 у 1,5 рази, р<0,001) і відповідно збільшення стійких хоча б до одного з досліджених препаратів (з 1994 до 2000 у 1,4 рази, р<0,001). Причому, збільшення кількості стійких штамів спостерігається, в основному, серед виділених від жителів міст. Піки стійкості відзначено у 1997 та 1999 роках.

Досліджували морфологічні, культуральні і тинкторіальні особливості та наявність корд-фактору у 98 штамів мікобактерій туберкульозу, виділених від хворих на туберкульоз легень, різних за чутливістю до антимікобактеріальних препаратів (АМБП). Порівнювали особливості наступних груп штамів Mycobacterium tuberculosis: 1-контроль-чутливі до АМБП (M.tuberculosis Н37Rv); 2-чутливі до АМБП; 3-стійкі до 1-2-х АМБП; 4-стійкі до 3-х і більше АМБП.

В результаті проведених досліджень встановлено (табл.3), що мікобактерії туберкульозу всіх досліджених груп штамів при фарбуванні за Грамом були грам-позитивними. За-відношенням до кислот, лугів та спиртів - кислото-, луго- та спиртостійкими.

Таблиця 3

Морфологічні та культуральні особливості штамів Mycobacterium tuberculosis

Група штамів | Кількість досліджених штамів | Фарбу-вання за Грамом | Фарбування за Ціль-Нільсеном | Характер росту

Трива-лість росту, дні | Характер колоній | Наявність корд-фактору

1 | 2 | + | тонкі,червоні, гомогенні | 25,20,05 | R-форма | +

2 | I | 16 | + | тонкі,червоні, гомогенні | 25,40,03 | R-форма | +

4 | потовщені,гетеро-генні,поліморфні

ІІ | 22 | + | тонкі,червоні, гомогенні | 25,10,02 | R-форма | +

3 | I | 7 | + | тонкі,червоні, гомогенні,дещо поліморфні | 25,30,03 | R-форма | +

3 | потовщені,гетеро-генні,поліморфні

ІІ | 14 | + | тонкі,червоні, гомогенні | 25,80,01 | R-форма | +

4 | І | 12 | + | тонкі,червоні, гомогенні,дещо поліморфні | 31,10,02 | R-форма | +

2 | потовщені,гетеро-генні,поліморфні

ІІ | 18 | + | тонкі,червоні, гомогенні | 31,20,03 | R-форма | +

всього | 98

Примітка. + - результат позитивний

При фарбуванні за Ціль-Нільсеном, майже всі (включаючи контрольні), крім дев’яти культур (4-х з другої,3-х з третьої та 2-х з четвертої груп), мали вигляд тонких, дещо вигнутих червоних поліморфних паличок, частіше гомогенних, незалежно від наявності резистентності. Серед мікобактерій відмінних дев’яти культур спостерігалося деяке потовщення клітин, гетерогенність структури та більша поліморфність, що можливо пов’язано з впливом на них лікарських препаратів, так як дані культури були виділені від вперше виявлених хворих, які певний час лікувалися. У всіх досліджених груп штамів виявлено корд-фактор. Спостерігався ріст у вигляді змієподібних сплетень, джгутів і кіс. Щодо культуральних особливостей і характеру росту при посіві на поживні середовища, то мікобактерії туберкульозу з контрольної, другої та третьої груп штамів росли дещо швидше, ніж полірезистентні, у вигляді негладких кремових колоній (25,1-25,8 проти 31,1-31,2 діб).

Таким чином, в результаті проведених досліджень серед морфологічних, культуральних та тинкторіальних особливостей різних різних за чутливістю до протитуберкульозних препаратів груп штамів Mycobacterium tuberculosis, не виявлено значних відмінностей від класичних паличок Коха, крім дещо повільнішого росту полірезистентних культур.

Вивчали життєздатність збудників, виділених від 218 пацієнтів з різними клінічними формами туберкульозного процесу та генезом виявлення. Порівняльний аналіз досліджень показав, що при всіх формах туберкульозного процесу і різним генезом виявлення найчастіше як життєздатні, так і мертві палички мікобактерій туберкульозу хворі виділяють помірно. При дослідженні співвідношення життєздатних і мертвих мікобактерій у мазку, було встановлено, що життєздатні мікобактерії виділяються в більшій кількості, ніж мертві при дисемінованій (у 1,6 рази, р<0,001), інфільтративній (у 1,3 рази, р>0,05) та інших формах (у 1,2 рази, р>0,05) туберкульозу. При фіброзно-кавернозному патологічному процесі частіше виявляються мертві бактерії. Хворі виявлені повторно і хворі хронічним туберкульозом в більшій кількості виділяють життєздатні МБТ (у 1,8, р<0,001 і 1,6, р>0,05 рази відповідно).

При порівнянні культурального і цитохімічного методів виявлення мікобактерій було встановлено, що здебільшого помірне виділення життєздатних і мертвих МБТ при різних формах і генезі співпадає з незначним і помірним ростом мікобактерій при посіві на культуральне середовище.

Таким чином, визначення життєздатності мікобактерій показало, що хворими частіше виділяються життєздатні мікобактерії туберкульозу при всіх, крім фіброзно-кавернозної форми патологічного процесу. Така ж тенденція спостерігається і у хворих хронічним і повторно виявленим туберкульозом легень.

Було проведено визначення активності дев’яти ферментів серед різних за чутливістю до антимікобактеріальних препаратів груп мікобактерій. Залежно від кількісної оцінки чутливості до препаратів, досліджені культури були поділені на наступні групи: чутливі; стійкі до одного; стійкі до двох; стійкі до трьох; стійкі до чотирьох і більше протитуберкульозних препаратів (у довільній комбінації). Показано, що у групи полірезистентних штамів спостерігалося зменшення частки культур з наявністю досліджуваних ензимів, крім пероксидази та глюкозодегідрогенази, зменшення активності яких не виявлено. Крім того, серед чутливих культур глюкозодегідрогеназа виявлялася лише у 40% штамів, як і культур стійких до одного антимікобактеріального препарату. Всі проаналізовані штами мікобактерій містили фермент нітратредуктазу.

Було, також, досліджено залежність ферментативної активності від якісної оцінки стійкості виділених культур. При цьому встановлено незначне зменшення кількості культур з каталазною активністю серед штамів стійких до стрептоміцину, ізоніазиду, етамбутолу, рифампіцину та флуренізиду. Пероксидаза виявлялася у всіх досліджуваних культур, крім декількох, стійких до етамбутолу. При дослідженні амідазної активності виявлено, що зі всіх досліджених лише всі чутливі штами мали нікотиназу, піразинамідазу та уреазу. Штами, стійкі до досліджуваних препаратів, не всі містили вказані амідази, як і дегідрогеназні ензими. Так, серед всіх стійких штамів спостерігалося зменшення кількості культур у яких виявлено сукцинат-, глутамат- та алкогольдегідрогенази. Глюкозодегідрогеназа виявлялася завжди у штамів, стійких до ізоніазиду, канаміцину та рифампіцину.

Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що серед полірезистентних штамів мікобактерій туберкульозу, виділених від хворих, зменшується відсоток культур з наявністю майже всіх досліджуваних ензимів, крім глюкозодегідрогенази, яка виявляється завжди серед полірезистентних культур.

Інфекційний процес при експериментальному туберкульозі. Вивчали вірулентність та патологічні зміни при туберкульозному процесі у інфікованих різними культурами мікобактерій туберкульозу тварин. Обстежено 78 гвінейських свинок,які були розділені на 5-ь груп. 18 з них знаходилися під спостереженням на виживання.

Досліджено внутрішні органи здорових та інфікованих тварин. Індекс ураження внутрішніх органів здорових тварин дорівнював нулю (табл.4). У лабораторних тварин 2,3-ї та 5-ї груп (інфіковані чутливими до протитуберкульозних препаратів штамами M.tuberculosis H37Rv, M.вovis Вovinus 8 –2,3-я групи та полірезистентними, крім стійкості до ізоніазиду M.tuberculosis-5-а група) вже через два тижні після інфікування було зареєстровано збільшення регіонарних лімфатичних вузлів.

Патоморфологічні обстеження показали збільшення селезінки, змінену структуру печінки та легенів. Значні зміни структури органів підтвердили і гістологічні дослідження. Зокрема, у внутрішніх органах тварин цих груп було виявлено специфічні туберкульозні ураження. Середній індекс ураження становив 18,9-19,6 та 5,2-5,9 (за Чернушенко та Tolderlung відповідно). Через місяць після інфікування виявлено ознаки генералізації туберкульозного процесу. Про це свідчили збільшені лімфатичні вузли, часто з казеозом, макроскопічні специфічні ураження легенів, печінки, селезінки (індекс ураження внутрішніх органів-20,0-20,6 і 6,9-7,1 відповідно) та гістологічні дослідження внутрішніх органів. Тварини 4-ї групи (інфіковані M.tuberculosis, стійкими до ізоніазиду і стрептоміцину) мали середню вірулентність. Це підтверджено патоморфологічними та гістологічними дослідженнями. Ураження внутрішніх органів даних тварин були менш виражені як через два тижні, так і через місяць з моменту інфікування. В органах виявлялися поодинокі зміни на фоні загального збільшення їх маси і, як правило, дещо порушена структура тканин. Спостерігалися лише поодинокі вогнища з казеозним некрозом. Середній індекс ураження становив через два тижні -12,6 і 4,2 та 13,7 і 5,0 відповідно-через один місяць після інфікування.

При посіві патологічного матеріалу на поживне середовище Левенштейна-Йенсена виявлено масивний ріст (більше 100 колоній) мікобактерій з другої, третьої та п’ятої груп і помірний (20-100 колоній) ріст збудників з четвертої групи.

Таблиця 4

Вірулентність мікобактерій туберкульозу щодо гвінейських свинок

Гру-па шта-мів | Кіль-кість зара-жених тварин | За-ги-ну-ло | За-би-ті | Трива-лість життя, дні | Середній індекс ураження (Мm) | Висівання МБТ з органів | Сту-пінь віру-лент-ності

за Чернушенко | за Tolderlung

два тижні | oдин місяць | два тижні | один місяць | два тижні | один місяць

1 | - | - | 6 | - | 0 | 0 | - | - | -

2 | 18 | 6 | 12 | 46-85 | 19,60,04 | 20,6

0,02 | 5,9

0,04 | 7,1

0,02 | +++ | +++ | висо-кий

3 | 18 | 6 | 12 | 45-87 | 19,30,02 | 20,4

0,02 | 5,6

0,05 | 6,9

0,02 | +++ | +++ | Висо-кий

4 | 18 | 6 | 12 | 52-105 | 12,60,04 | 13,7

0,04 | 4,2

0,04 | 5,0

0,04 | ++ | ++ | Cередній

5 | 18 | 6 | 12 | 34-56 | 18,90,04 | 20,0

0,04 | 5,2

0,04 | 7,0

0,02 | +++ | +++ | висо-кий

Примітка . - - відсутність росту;

+ - слабкий ріст;

++ - помірний ріст;

+++ - масивний ріст

Тварини залишені для спостереження на виживання спочатку мали нормальний апетит і приріст маси. Однак, до кінця другого місяця ставали малорухливими, починали линяти та худнути. Першими гинули тварини, інфіковані полірезистентними, крім стійкості до ізоніазиду, штамами мікобактерій (п’ята група) через 34 дні і до кінця другого місяця. Тварини, інфіковані чутливими культурами мікобактерій (друга і третя групи), гинули періодично, починаючи з 45-го дня після зараження і до кінця третього місяця. Найпізніше, починаючи з 52-го дня і до закінчення четвертого місяця після інфікування, гинули тварини з четвертої групи (інфіковані штамами стійкими до ізоніазиду та стрептоміцину). Проведені патоморфологічні дослідження загиблих тварин показали, що ураження внутрішніх органів відбувалося з поступовим наростанням. Максимального ураження зазнавали лімфатичні вузли. Причиною загибелі всіх тварин був генералізований туберкульозний процес.

Таким чином, у результаті проведених досліджень вірулентності різних, за чутливістю до протитуберкульозних препарвтів, груп мікобактерій туберкульозу, патоморфологічних та гістологічних особливостей впливу збудника на макроорганізм встановлено, що культури стійкі до ізоніазиду і стрептоміцину є менш вірулентними, ніж чутливі та полірезистентні, крім стійкості до ізоніазиду, штами збудника туберкульозу. Це дозволяє зробити припущення про залежність стійкості до ізоніазиду із послабленням вірулентності МБТ.

При розвитку специфічного процесу проводилось дослідження змін показників Т-системи імунітету. В крові гвінейських свинок через два тижні та один місяць з моменту інфікування визначали кількість специфічно сенсибілізованих розеткоутворюючих клітин. Контролем служили обстежені здорові тварини. У периферичній крові здорових тварин виявлено низький рівень вмісту специфічно сенсибілізованих лімфоцитів, який становив 1,830,04%. Однак, у інфікованих тварин всіх досліджуваних груп (рис.2) вже через два тижні кількість імунних розеткоутворюючих клітин достовірно підвищувалася. Максимального значення ці показники досягають через місяць перебігу хвороби у груп тварин заражених чутливими штамами Mycobacterium tuberculosis та виділеними від хворих, стійкими до ізоніазиду і стрептоміцину. Але в периферичній крові тварин інфікованих полірезистентними культурами спостерігалася тенденція до зниження рівня специфічно сенсибілізованих лімфоцитів. Їх кількість складала 5,670,03%.

А Б

Рис. 2. Показники імунного (А) та спонтанного (Б) розеткоутворення при інфікуванні тварин мікобактеріями туберкульозу (різниця порівняно до контролю вірогідна, р<0,001).

Що стосується кількості спонтанних розеткоутворюючих клітин, то в периферичній крові здорових тварин їх рівень становить 43,670,04%. У інфікованих тварин всіх досліджуваних груп, вже через два тижні після зараження, ця кількість достовірно знижується. Через один місяць у групах тварин інфікованих стійкими штамами Mycobacterium tuberculosis показники такого розеткоутворення дещо підвищуються. Лише у тварин другої і третьої груп кількість спонтанних розеткоутворюючих клітин продовжує знижуватися.

Вивчали функціональну активність лімфоцитів за допомогою реакції бласттрансформації лімфоцитів з туберкуліном (ППД-Л) і з фітогемаглютиніном (ФГА). Виявлено, що у здорових тварин кількість лімфоцитів, які трансформувалися у бласти при стимуляції ППД-Л, складає 0,430,04%. Активність бластоутворення в культурах периферичної крові значно посилювалась через два тижні після інфікування у всіх групах заражених тварин (рис.3), особливо серед тварин інфікованих стійкими штамами.

Тенденція до посилення проліферації спостерігалася і після одного місяця з моменту зараження майже у всіх групах тварин, крім інфікованих полірезистентними культурами мікобактерій туберкульозу.

При використанні мітогену ФГА, кількість бластоутворюючих клітин у здорових тварин досягала 65,330,04%. Після двох тижнів з моменту зараження цей показник достовірно зменшувався у всіх групах експериментальних тварин. Подальше зниження кількості бластоутворюючих клітин через місяць після зараження спостерігалося у тварин, інфікованих лабораторними штамами мікобактерій туберкульозу. Однак, у груп гвінейських свинок, інфікованих штамами Mycobacterium tuberculosis, виділеними від хворих на туберкульоз легень, стійкими до протитуберкульозних препаратів, відмічено підвищення показників реакції бласттрансформації лімфоцитів з ФГА після одного місяця від часу зараження.

А Б

Рис.3. Показники бласттрансформації лімфоцитів з ППД-Л (А) та ФГА (Б) при інфікуванні тварин мікобактеріями туберкульозу (різниця порівняно до контролю вірогідна, р<0,001).

Отже, у тварин заражених резистентними культурами спостерігалася тенденція до зниження рівня імунних розеткоутворюючих клітин та посилення бластоутворення з специфічним антигеном. При цьому відбувалося посилення загальної реактивності, підтверджене підвищенням кількості спонтанних розеткоутворюючих клітин і зростанням показників реакції бласттрансформації лімфоцитів з фітогемаглютиніном.

Таким чином, проведені дослідження дозволили комплексно оцінити основні біологічні властивості мікобактерій туберкульозу виду Mycobacterium tuberculosis і показали можливість покращення лабораторної діагностики при туберкульозі.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Список робіт опублікованих за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЯ

Яворська Г.В. Мікобактерії туберкульозу в сучасних умовах: бактеріологія та імунологія.-Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія.- Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К.Заболотного НАН України, Київ,2002.

Дисертацію присвячено вивченню основних біологічних особливостей культур мікобактерій виду Mycobacterium tuberculosis, виділених в сучасних умовах. Показано, що відбувається збільшення кількості полірезистентних штамів, особливо виділених від жителів міст, які до того ж володіють високою вірулентністю і повільно ростуть на поживних середовищах. Встановлено залежність ферментативної активності деяких ензимів мікобактерій туберкульозу від наявності резистентності. Показано, що у патологічному матеріалі хворих на повторно виявлений та хронічний туберкульоз виявляється більша кількість життєздатних збудників.

Встановлено порушення стану Т-системи імунітету при